王鳳芹， 張 林， 路則慶， 宋德廣， 汪以真*

(浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部華東動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省飼料及動(dòng)物營養(yǎng)研究實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310058)

自Shrift和Kelly[1]于1962年首次報(bào)道大腸桿菌耐受亞硒酸鹽的毒性并將其還原成單質(zhì)硒以來，由微生物介導(dǎo)的還原亞硒酸鹽和硒酸鹽為單質(zhì)硒的研究備受關(guān)注[2]。文獻(xiàn)報(bào)道[3 - 4]細(xì)菌合成的單質(zhì)硒聚合成為納米硒顆粒，其不僅具有抗氧化能力同時(shí)降低了硒的毒性[5]。并有研究表明：一定劑量的納米單質(zhì)硒對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有免疫調(diào)節(jié)功能[6]，納米單質(zhì)硒作為獨(dú)特的抗氧化劑正被用于臨床治療[7]。單質(zhì)硒不溶于水、醇，溶于硫酸、硝酸，硒在二硫化碳中的溶解度也較低只有0.64 mg/mL[8]，給樣品中硒的提取帶來困難，其次是二硫化碳有毒。

目前，對(duì)于單質(zhì)硒的研究，主要是基于X射線衍射、掃描電鏡或透射電鏡進(jìn)行的定性或表征分析，只有少數(shù)研究涉及單質(zhì)硒的提取和定量測定[8]。萬雯等[9]與侯曉川等[10]采用真空蒸餾法提取硒，實(shí)現(xiàn)了單質(zhì)硒與高沸點(diǎn)難揮發(fā)的其他物質(zhì)的分離，但此法僅僅應(yīng)用于粗硒的提純，而不適用于基于定量分析微量和痕量硒為目的的單質(zhì)硒收集。Biswas等[11]報(bào)道直接采用1 mol/L Na2S水溶液提取細(xì)菌生物合成的納米硒，再經(jīng)紫外分光光度法測定，但實(shí)際上提取的不僅僅是單質(zhì)硒，還包括了其它價(jià)態(tài)的硒和樣品中的其他基質(zhì)，從而造成檢測結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單質(zhì)硒的實(shí)際含量。

本研究設(shè)計(jì)了一種新型、經(jīng)濟(jì)的炭化裝置，該裝置可用于分離和富集單質(zhì)硒同時(shí)免受基質(zhì)干擾。樣品在加熱過程中，有機(jī)物灼燒后被破壞，氧化態(tài)的硒如Se(Ⅵ)和Se(Ⅳ)的鹽不能被蒸發(fā)，保留在殘?jiān)?，而單質(zhì)硒因其低沸點(diǎn)而升華并冷凝附著在上蓋內(nèi)壁或空氣冷凝管的內(nèi)壁。加熱過程既分離了單質(zhì)硒與其他雜質(zhì)，也使單質(zhì)硒得到富集。富集得到的單質(zhì)硒經(jīng)酸加熱消化后，在鹽酸介質(zhì)中，將試樣中的硒統(tǒng)一還原成四價(jià)硒，四價(jià)硒在微酸性條件下與2，3-二氨基萘(DAN)生成苤硒腦絡(luò)合物，用環(huán)己烷萃取，并測定其熒光強(qiáng)度，從而計(jì)算出樣品中的單質(zhì)硒含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

C20L-NL909T電磁爐(林光電子有限公司);Softmax pro5多功能連續(xù)光譜酶標(biāo)儀(美國,Molecular Devices公司)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華)；pH計(jì)(美國Mettler Toledo 公司)。

硒蛋白多糖樣品(本課題組富硒菌株Z0206發(fā)酵醇沉產(chǎn)品)，Na2S(分析純，國藥集團(tuán))，色譜級(jí)硒粉和分析純2，3-二氨基萘(DAN)購于Sigma公司。氨水、高氯酸、濃硝酸、EDTA二鈉鹽、鹽酸羥胺、環(huán)己烷均為分析純，由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)用水為純水儀(日本，Yamato公司)制備。

1.2 反應(yīng)試劑的配制

DAN試劑(1.0 g/L)：此試劑在暗室內(nèi)配制。稱取DAN(純度95%～98%)200 mg 于一帶蓋錐形瓶中，加入0.1 mol/L 鹽酸200 mL，振搖約15 min 使其全部溶解。加入約40 mL 環(huán)己烷，繼續(xù)振蕩5 min。將此液倒入塞有玻璃棉或脫脂棉的分液漏斗中，待分層后分去環(huán)己烷層，收集DAN 溶液層，反復(fù)用環(huán)己烷純化，直至溶液的熒光強(qiáng)度降至最低時(shí)為止(約純化12 次)。將純化后的DAN 溶液儲(chǔ)存于棕色瓶中，加入約1 cm 厚的環(huán)己烷覆蓋表層，于冰箱內(nèi)保存。EDTA混合液：稱取EDTA 二鈉鹽2.5 g，加水并加熱至完全溶解，冷卻后稀釋至125 mL，然后加入6.25 g 鹽酸羥胺，溶解后稀釋至250 mL。

1.3 新型炭化裝置的設(shè)計(jì)

圖1 炭化裝置實(shí)物圖Fig.1 Carbonization device

整套裝置采用硼硅酸鹽玻璃材質(zhì)，包括玻璃杯底座、上蓋腔體，玻璃杯底座設(shè)有磨口裙邊，上蓋腔體的底部設(shè)有相應(yīng)吻合的磨口裙邊，上蓋腔體的頂部接有一個(gè)空氣冷凝管，空氣冷凝管與上蓋腔體的垂線以夾角120度伸出后再垂直向下延伸；玻璃杯底座、上蓋腔體采用魚尾夾對(duì)稱固定；玻璃杯底座、上蓋腔體、空氣冷凝管的玻璃厚度為0.3 cm；玻璃杯底座內(nèi)徑為2.3 cm，高1 cm，磨口裙邊寬1.2 cm；上蓋腔體磨口裙邊寬1.2 cm，腔體內(nèi)徑2.3 cm，高7 cm，空氣冷凝管內(nèi)徑0.5 cm，總長度30 cm，其中冷凝管與垂線(腔體)120度夾角延伸20 cm后垂直向下延伸10 cm，見圖1。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1單質(zhì)硒的分離與富集準(zhǔn)確稱取約25 mg硒粉，同時(shí)稱取約200 mg NaCl，置于裝置的玻璃杯底座中，混勻，蓋上上蓋腔體，將上下兩個(gè)磨口裙邊部位完全吻合放置，并用魚尾夾對(duì)稱固定；上述裝置放在電磁爐的加熱板上，300 ℃加熱30 min；冷卻后用1 mol/L Na2S水溶液將腔體包括冷凝管部分的硒粉無損轉(zhuǎn)移至容量瓶中，并用Na2S水溶液定容至25 mL。再從容量瓶中取1 mL硒的Na2S水溶液，用Na2S水溶液定容至500 mL。

準(zhǔn)確稱取約50 mg樣品，同時(shí)稱取約200 mg NaCl，按上述操作。冷卻后用5 mL 1 mol/L Na2S水溶液將腔體包括冷凝管部分的單質(zhì)硒無損轉(zhuǎn)移至離心管，搖勻備用。

1.4.2酸解及檢測將上述制得的標(biāo)樣或者樣品溶液0.5 mL，于100 mL的圓底燒瓶中，加入1 mL的質(zhì)量百分比為69%的濃硝酸，再加入2 mL質(zhì)量百分比為70%～72%的高氯酸，置于沸水浴中磁力攪拌1 h；反應(yīng)結(jié)束冷卻后，加入8.4 mL濃度為6 mol/L的鹽酸，置于沸水浴中反應(yīng)10 min，冷卻后用水定容至100 mL。

移取上述定容后的酸解溶液5 mL，用氨水和鹽酸調(diào)節(jié)pH至 1.5～2.0，加入3 mL EDTA 混合液搖勻后，加入3 mL DAN溶液，搖勻，補(bǔ)充水至總體積約30 mL，置于沸水中保持5 min，取出冷卻至室溫；然后將其轉(zhuǎn)移到125 mL分液漏斗中，加10 mL環(huán)己烷振蕩2.0 min，靜置分層后，參照我國國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中硒的測定》法[12]和《飼料中硒的測定》[13]進(jìn)行操作，在激發(fā)波長376 nm、發(fā)射波長520 nm條件下測定環(huán)己烷層的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 炭化條件的選擇

設(shè)置加熱時(shí)間為30 min，分別設(shè)置炭化溫度為150 ℃、300 ℃和 400 ℃對(duì)硒粉進(jìn)行加熱，發(fā)現(xiàn)溫度設(shè)置為300 ℃能夠獲得最大的回收率；設(shè)置加熱溫度為300 ℃，分別設(shè)置炭化時(shí)間為15 min、30 min 和 60 min，發(fā)現(xiàn)時(shí)間設(shè)置為30 min時(shí)已經(jīng)能夠獲取滿意的回收率。另一方面，參考常規(guī)重金屬測定炭化時(shí)防噴濺劑的使用[14 - 15]，考察了將CaO、MgO、Mg(NO3)2、Ca(OH)2和NaOH作為對(duì)樣品加熱過程中的防噴濺劑對(duì)樣品加收率的影響，發(fā)現(xiàn)在選擇這些化學(xué)試劑作為防噴濺劑時(shí)，回收率均不理想。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)選擇NaCl作為防噴濺劑，獲得十分滿意的回收率。

2.2 線性關(guān)系和精密度

準(zhǔn)確稱取亞硒酸鈉，用蒸餾水定容稀釋，得到每毫升含0.2 μg 硒的工作液。分別準(zhǔn)確吸取0、0.2、0.6、1.0、3.0以及8.0 mL硒標(biāo)準(zhǔn)工作液。用水稀釋至30 mL，同1.4.2樣品檢測方法進(jìn)行測定。每個(gè)體積的標(biāo)準(zhǔn)品測定3次，測定其熒光值，用得到的熒光值(平均值)對(duì)單質(zhì)硒的質(zhì)量作圖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：單質(zhì)硒在0.0～1.6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)R2為1.0000，其線性回歸方程為：Y=1849.68X+27.85。計(jì)算熒光值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.52%，表明精密度良好。

2.3 重現(xiàn)性及回收率

精確稱取5份約25 mg硒粉，按照“1.4.1和1.4.2”方法操作，并重復(fù)測定5次，求平均值。5份樣品測得單質(zhì)硒的含量結(jié)果分別為97.77%、99.44%、100.20%、101.20%、103.34%，其平均值為100.39%，由此計(jì)算出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.95%。表明方法的重現(xiàn)性好，回收率高。

2.4 硒多糖中單質(zhì)硒檢測

精確稱取5份硒多糖樣品，按照“1.4.1和1.4.2”方法操作，并重復(fù)測定3次，求平均值。5份樣品測定單質(zhì)硒的含量結(jié)果分別為1869.6 μg/g、2004.0 μg/g、1870.19 μg/g、1937.72 μg/g、1934.62 μg/g，平均值為1923.23 μg/g，由此計(jì)算出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.91%。

3 結(jié)論

由于單質(zhì)硒的低沸點(diǎn)特性，而硒酸鈉和亞硒酸鈉具有較高沸點(diǎn)特性，利用本研究設(shè)計(jì)的裝置，將升華冷凝后的單質(zhì)硒進(jìn)行收集，而較高沸點(diǎn)的氧化態(tài)硒留在殘?jiān)?。該裝置操作簡單且易于在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。本文建立的單質(zhì)硒收集及定量分析方法可以應(yīng)用于細(xì)菌合成納米硒的含量分析，而作為硒多糖的質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)。