萬建春， 郭 平， 祝建新， 占春瑞*， 左海根

(江西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術(shù)中心，江西南昌 330038)

圖1 19種農(nóng)藥極性強(qiáng)度排列圖Fig.1 Arrangement diagram of polar intensity of 19 pesticidesC1：Acetamiprid,C2：Atrazine,C3：Buprofezin,C4：Carbendazim,C5：Carbofuran,C6：Difenoconazole,C7：Dimethomorph,C8：Hexythiazox,C9：Imazalil,C10：Imidacloprid,C11：Isoproturon,C12：Methomyl,C13：Omethoate,C14：Prochloraz,C15：Profenofos,C16：Prometryne,C17：Pyrimethanil,C18：Triadimenol,C19：Triazophos，the same below.

QuEChERS方法是近年得到快速發(fā)展和推廣運用的一種快速前處理技術(shù)，它非常適用于含水量大的蔬菜、水果等農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留快速測定，在農(nóng)殘檢測方面有較多的實際應(yīng)用[1 - 12]。QuEChERS方法常用的吸附劑有N-丙基乙二胺(PSA)、C18、石墨化碳黑(GCB)、無水MgSO4等。PSA具有弱陰離子交換和極性作用，能去除萃取液中脂肪酸，有機(jī)酸，極性色素以及糖類等物質(zhì)[4]；C18粉含碳量在10%左右，具有疏水作用，對非極性的組分有吸附作用，能除去萃取液中非極性色素，脂肪酸等物質(zhì)；GCB有六邊形的微觀結(jié)構(gòu)，可吸附非極性和弱極性化合物，尤其對色素吸附作用較好，GCB表面的特殊的六邊形結(jié)構(gòu)，使它能吸附具有平面結(jié)構(gòu)的化合物[13 - 14]。

本文選擇了啶蟲脒(Acetamiprid)、莠去津(Atrazine)、噻嗪酮(Buprofezin)、多菌靈(Carbendazim)、呋喃丹(Carbofuran)、苯醚甲環(huán)唑(Difenoconazole)、烯酰嗎啉(Dimethomorph)、噻螨酮(Hexythiazox)、抑霉唑(Imazalil)、吡蟲啉(Imidacloprid)、異丙隆(Isoproturon)、滅多威(Methomyl)、氧樂果(Omethoate)、咪鮮胺(Prochloraz)、丙溴磷(Profenofos)、撲草凈(Prometryne)、嘧霉胺(Pyrimethanil)、三唑醇(Triadimenol)、三唑磷(Triazophos)19種農(nóng)藥，其極性差異如圖1所示。極性相當(dāng)?shù)幕衔锝Y(jié)構(gòu)上也有所不同，如多菌靈和嘧霉胺是具有平面結(jié)構(gòu)的化合物，實驗加入甲苯作為保護(hù)劑，以確定保護(hù)劑與吸附劑之間的交互作用，得到適合不同化學(xué)性質(zhì)的QuEChERS吸附劑和保護(hù)劑組合方式，為方法拓展檢測項目提供了參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6495液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(美國,Agilent)；IKA-T25高速組織勻漿機(jī)(德國,IKA公司)；Milli-Q超純水機(jī)(美國,Millipore公司)；Vortex-Genie 2渦旋混勻器(美國,Scientific Industries公司)；TDL-5-A常速離心機(jī)(上海安亭公司)，SIGMA 1-14微量離心機(jī)(美國,Sigma公司)。

19種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品純度>95%，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司和中國農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所。乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Sigma公司)；三氯甲烷(色譜純，上海安譜公司)；乙酸銨(色譜純，上海安譜公司)；水為Milli-Q超純水；PSA粉(40～60 μm)、C18粉(50 μm)、GCB粉(100～400 目)，購自天津博納艾杰爾科技有限公司；無水MgSO4(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，使用前在640 ℃灼燒4 h。

1.2 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別稱量或移取適量的各種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，于-18 ℃避光保存?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)中間溶液：移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于4 ℃避光保存。提取液：分別量取50 mL甲酸和250 mL乙腈，加水溶解并定容至1 000 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

稱取試樣10.0 g至50 mL聚丙烯離心管內(nèi)，加入10 mL提取液，高速勻漿提取1 min，加入10 mL三氯甲烷，于4 500 r/min離心5 min，棄去全部上層溶液和殘渣，將下層有機(jī)相全部轉(zhuǎn)移至15 mL聚丙烯離心管中，在40 ℃下氮吹至干，加入1 mL乙腈和1 mL甲苯，渦旋混合均勻后，準(zhǔn)確移取1 mL復(fù)溶液至10 mL 聚丙烯離心管中，向離心管中加入混合吸附劑(PSA：50 mg，GCB：20 mg，無水MgSO4：100 mg)后，快速混勻，在4 500 r/min下離心5 min，取全部上層清液至另一10 mL聚丙烯離心管中，在40 ℃下氮吹至干，用1 mL定容液(0.1%甲酸水溶液∶乙腈=8∶2)超聲溶解，過0.22 μm濾膜后，供LC-MS/MS測定。

1.4 儀器條件

色譜條件：色譜柱為Shiseido CAPCELL PAK CR柱(150×2.1 mm，3.5m)；柱溫：40 ℃；流動相A為乙腈，流動相B為5 mmol乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣體積；5L；梯度洗脫程序：0～3.0 min，1%～30%A；3.0～6.0 min，30%～40%A，保持3 min；9.0～15.0 min，40%～60%A；15.0～19.0 min， 60%～90%A，保持4 min;23.0～23.01 min;流動相A由90%瞬變至1%后，保持4 min。

質(zhì)譜條件：離子源(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；毛細(xì)管電壓：3 000 V；干燥氣溫度：280 ℃；干燥氣流量：14 L/min；霧化氣壓力：20 psi；鞘氣溫度：325 ℃；鞘氣流量：11 L/min。以1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)混合液，利用Agilent 6495自動優(yōu)化軟件，選擇各化合物的其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

*quantitative ion pair.

2 結(jié)果與討論

2.1 液相條件的建立和優(yōu)化

反相C18色譜柱對非極性化合物有較好的保留作用，在質(zhì)譜正模式分析中，流動相中加入一定量的揮發(fā)性酸可提高離子化效率，進(jìn)而提高靈敏度，但對堿性化合物來說，酸性環(huán)境下會有離子化趨勢，其色譜行為變差，保留時間短，更易受基質(zhì)中極性物質(zhì)的干擾，化合物峰展寬也變寬，影響其靈敏度。本方法比較了Shiseido CAPCELL PAK CR色譜柱和反相C18色譜柱的分離效果，CR色譜柱的固定相是SCX和C18復(fù)合填料，能夠避免堿性化合物因離子化而導(dǎo)致色譜行為變差的現(xiàn)象，多菌靈、滅多威等極性化合物有較好的色譜保留，低比例的SCX填料也不會造成堿性化合物的死吸附。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

圖2 吸附劑對19種農(nóng)藥的吸附作用強(qiáng)度Fig.2 Adsorption of 19 kinds of pesticides by adsorbent

實驗選擇常用吸附劑PSA、C18、GCB、無水MgSO4，分別考察各吸附劑對各農(nóng)藥的吸附作用強(qiáng)度，用乙腈配制一定濃度的19種農(nóng)藥混合溶液，分別加入100 mg的PSA、C18、GCB、無水MgSO44種吸附劑處理后，經(jīng)溶劑轉(zhuǎn)換后上機(jī)測定，實驗結(jié)果如圖2所示。多菌靈和嘧霉胺是平面結(jié)構(gòu)化合物，GCB對這兩種農(nóng)藥有較強(qiáng)的吸附作用，C18對弱極性的噻螨酮和三唑磷也有較強(qiáng)的吸附能力，而無水MgSO4對咪鮮胺的影響則較大，PSA對19種農(nóng)藥無顯著吸附作用。為降低GCB對平面結(jié)構(gòu)化合物的影響，試驗加入甲苯作為保護(hù)劑，設(shè)置A、B、C、D、E 5個因素，每個因素取4個水平，以蔬菜樣品中檢出農(nóng)藥數(shù)量為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗。從正交試驗結(jié)果直觀分析來看，4個因素的極差有一定的差異，PSA、甲苯、GCB對待測物的吸附作用相對明顯，而C18和無水MgSO4則影響相對較小，而PSA、甲苯、GCB兩兩間有一定的交互作用，20 mg GCB加入250 mL甲苯，GCB對平面結(jié)構(gòu)的化合物吸附能力有明顯改善，50 mg PSA加入500 mL甲苯，PSA凈化溶液檢出了全部農(nóng)藥，而20 mg GCB和50 mg PSA的組合，凈化溶液檢出全部19農(nóng)藥。正交試驗的結(jié)果顯示，PSA(50 mg)、甲苯(1 mL)、GCB(20 mg)的組合方式的試驗結(jié)果最理想，考慮試樣溶液含水，在溶劑轉(zhuǎn)換過程中會影響測定結(jié)果，吸附劑組合中增加無水MgSO4(100 mg)。

表2 正交試驗設(shè)計(5因素4水平)

表3 正交試驗結(jié)果

(續(xù)表3)

Experiment No.12345PSAGCBC18MgSO4TolueneResult113312418123421317134142317144231419154324115164413216k118.50018.25018.00018.00016.750k218.00018.25017.50017.75017.500k317.25017.00018.00017.25017.750k416.75017.00017.00017.50018.500Range1.7501.2501.0000.7501.750

Note:kiis mean value corresponding toifactor.

圖3 19種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)Fig.3 Matrix effects of 19 pesticides

2.4 測定低限和校準(zhǔn)曲線

本實驗用陰性蔬菜樣品進(jìn)行加標(biāo)實驗，計算待測物的信噪比(S/N)確定方法的定量限。QuEChERS吸附劑在吸附共萃取物的同時，對待標(biāo)物也有一定吸附作用，其程度除與待測物性質(zhì)有關(guān)外，共萃取物的量是重要因素，這些都是影響QuEChERS方法的基質(zhì)效應(yīng)的因素。本方法考察了19種農(nóng)藥在蔬菜中的基質(zhì)效應(yīng)，19種農(nóng)藥在蔬菜基質(zhì)中呈現(xiàn)較明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)(圖3)，為消除基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響，本方法采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量。在50～1 000 ng/mL濃度范圍，各化合物線性相關(guān)性較好，表4是各化合物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、定量限數(shù)據(jù)。

表4 蔬菜樣品中各化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、定量限

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

本方法采用陰性蔬菜樣品的加標(biāo)實驗進(jìn)行的準(zhǔn)確度和精密度評價，實驗分別在1、2和4倍定量限濃度水平進(jìn)行加標(biāo)實驗，添加回收實驗結(jié)果顯示，各農(nóng)藥回收率在65.4%～120.0%范圍，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.35%～17.46%之間。

3 結(jié)論

本文建立了蔬菜中19種農(nóng)藥殘留量的測定方法，方法采用SCX和C18復(fù)合填料的色譜柱分離，流動相中加入甲酸，堿性和極性化合物均有較理想的色譜峰形，提高了質(zhì)譜檢測的靈敏度。通過正交試驗設(shè)計，得到了QuEChERS凈化用吸附劑和保護(hù)劑理想的組合方式。采用本方法對油麥菜、小白菜、黃瓜、生菜、芹菜等50余個蔬菜樣品進(jìn)行測定，其中農(nóng)藥多菌靈檢出率最高，其次為啶蟲脒。