傅 麗, 胡曉紅, 鞠 巖, 高 帆, 遠(yuǎn)新新, 張玉嬋

(廊坊師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，河北廊坊 065000)

恩諾沙星(Enrofloxacin,EFLX)屬喹諾酮類(lèi)新一代的廣譜抗菌藥物，具有高效的殺菌效果，家畜經(jīng)藥物注射后不良反應(yīng)輕微，且與其他藥物同時(shí)使用時(shí)不會(huì)造成交叉耐藥現(xiàn)象。因此，恩諾沙星被廣泛應(yīng)用于以牛、羊?yàn)榇淼募倚蟾腥静〉姆乐?。牛血清白蛋?Bovine Serum Albumin，BSA)是一種球型蛋白，承擔(dān)著血液中各種小分子物質(zhì)的運(yùn)輸和貯存作用。因此，研究EFLX與蛋白的作用，有助于幫助我們了解藥物在動(dòng)物體內(nèi)的存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，同時(shí)能為藥物的設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)及藥理研究提供有價(jià)值的信息。蛋白具有內(nèi)源熒光，可與許多生物小分子相互結(jié)合。研究藥物與蛋白的相互作用，熒光光譜法相比于平衡透析法[1]、毛細(xì)管電泳法[2]、高效親和色譜法[3]等更簡(jiǎn)單、快速，因此熒光光譜法成為人們研究蛋白與其他物質(zhì)相互作用的主要手段。

圖1 恩諾沙星結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of EFLX

經(jīng)典的熒光光譜法通常采用以血清白蛋白為檢測(cè)對(duì)象，隨藥物小分子的不斷加入，蛋白在340 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度有規(guī)律地減弱，據(jù)此建立起蛋白與藥物相互作用的熒光光譜法。但當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，340 nm處的熒光是由色氨酸殘基發(fā)出的[4]。生物體蛋白包含20種氨基酸[5]，而其他19種氨基酸都有可能參與到相互作用的過(guò)程中，因此，色氨酸殘基的熒光并不能準(zhǔn)確地反映藥物與蛋白的相互作用信息[6]。相反，藥物小分子的熒光代表的是藥物整體的熒光，可獲得蛋白與藥物更為準(zhǔn)確和全面的相互作用信息。

本文以第三代喹諾酮類(lèi)獸用EFLX為檢測(cè)對(duì)象(結(jié)構(gòu)式如圖1)，在模擬生理?xiàng)l件下，分別以BSA和EFLX為研究對(duì)象，采用熒光光譜法研究了EFLX與BSA的相互作用，并獲得了二者的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、熱力學(xué)等參數(shù)。此外，考察了離子強(qiáng)度對(duì)EFLX-BSA體系熒光強(qiáng)度的影響及I-對(duì)該體系的熒光猝滅。通過(guò)EFLX與曙紅B(EB)、鹽酸柔紅霉素(DH)、赫斯特?zé)晒馊玖?Hoechst)的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，推測(cè)了EFLX與BSA的結(jié)合方式。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4600型熒光光度計(jì)(日立，日立公司)；UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本，島津公司)；SYC-15型超級(jí)恒溫水浴(南京桑力電子設(shè)備廠)。

牛血清白蛋白(BSA)配成1.0×10-4mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；曙紅B(EB)配成1.072×10-4mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；鹽酸柔紅霉素(DH)配成1.0×10-4mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；赫斯特?zé)晒馊玖?Hoechst)配成1.086×10-3mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液(以上試劑均為分析純，由大連美侖生物科技股份有限公司提供)；恩諾沙星注射液(文登市雨澤銀豐動(dòng)物藥業(yè)有限公司)配成1.043×10-3mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；pH=7.34的Tris-HCl緩沖溶液；0.1 mol/L 的NaCl標(biāo)準(zhǔn)溶液；0.1 mol/L 的KI 標(biāo)準(zhǔn)溶液。實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1以BSA為檢測(cè)對(duì)象的熒光光譜法在10 mL比色管中，依次加入2 mL Tris-HCl緩沖溶液，1 mL 0.1 mol/L 的NaCl溶液，1 mL 1.0×10-5mol/L BSA溶液，然后加入不同體積的EFLX標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水定容至10 mL，配制成系列溶液。分別于溫度298 K、303 K、308 K和313 K下靜置反應(yīng)15 min。設(shè)置熒光光譜儀的激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，負(fù)高壓為410 V，記錄BSA在波長(zhǎng)340 nm處的熒光強(qiáng)度。

1.2.2以EFLX為檢測(cè)對(duì)象的熒光光譜法在10 mL比色管中，依次加入2 mL Tris-HCl緩沖溶液，1 mL 0.1 mol/L NaCl溶液，0.5 mL 1.043×10-4mol/L EFLX溶液，然后加入不同體積的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水定容至10 mL，配制成系列溶液，以下同1.2.1。在激發(fā)波長(zhǎng)為270 nm，負(fù)高壓為410 V，記錄EFLX在410 nm處的熒光強(qiáng)度。

1.2.3紫外吸收光譜法同1.2.2，以相應(yīng)濃度的BSA溶液做參比，掃描其在250～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外光譜，記錄EFLX在270 nm處的吸光度A。

1.2.4作用方式的判斷實(shí)驗(yàn)條件及儀器參數(shù)與1.2.2同，實(shí)驗(yàn)溫度298 K。通過(guò)測(cè)定二元體系EFLX-NaCl/(KI) 在410 nm處EFLX發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度，以及三元體系EFLX-BSA-NaCl/(KI)在340 nm處的熒光強(qiáng)度，判斷作用力方式是否為靜電作用。通過(guò)對(duì)比二元體系EB-BSA(DH-BSA)與三元體系EB-BSA-EFLX(DH-BSA-EFLX)發(fā)射峰熒光強(qiáng)度的變化，判斷作用力方式是否為嵌入式。通過(guò)對(duì)比二元體系Hoechst-BSA與三元體系Hoechst-BSA-EFLX發(fā)射峰熒光強(qiáng)度的變化，判斷作用方式是否為溝槽式。

2 結(jié)果與討論

圖2 BSA-EFLX體系的熒光光譜(303 K)Fig.2 The fluorescence spectra of the BSA-EFLX system(303 K)cBSA=1.0×10-6 mol/L;slit widths：10 nm;cEFLX(a-h):0,2.086,4.172,6.258,8.272,10.34,12.408,14.476(×10-6 mol/L).

2.1 EFLX-BSA體系的經(jīng)典熒光光譜

BSA分子中因含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基而能發(fā)射較強(qiáng)的熒光[7]。圖2表明，固定BSA濃度不變，隨著EFLX濃度的增加，BSA的熒光強(qiáng)度有規(guī)律的降低，發(fā)射峰位置從340 nm依次紅移至349 nm，峰形基本保持不變，表明兩者存在相互作用。

通常，可根據(jù)猝滅常數(shù)隨溫度的變化及猝滅速率常數(shù)的大小來(lái)區(qū)分動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅。由動(dòng)態(tài)猝滅遵循Stern-Volmer方程[8]計(jì)算猝滅常數(shù)KSV及猝滅常數(shù)Kq，見(jiàn)表1。由表1可以看出，隨著溫度升高，KSV依次減小，由此推斷該反應(yīng)為靜態(tài)猝滅過(guò)程[9]。Kq均大于最大擴(kuò)散猝滅常數(shù)(2.0×1010L/(mol·s))[10]，進(jìn)一步證明EFLX與BSA形成復(fù)合物而發(fā)生靜態(tài)猝滅。

表1 EFLX與BSA在不同溫度下的猝滅反應(yīng)參數(shù)

Note:r1is the correlation coefficients ofF0/F-[Q];r2is the correlation coefficients of log[(F0-F)/F]-log[Q].

由靜態(tài)猝滅遵循的Scatchard 方程[11]計(jì)算體系的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n列入表1?？梢钥闯觯煌瑴囟认翶a數(shù)量級(jí)皆為105，這表明EFLX與BSA有很強(qiáng)的結(jié)合能力，在血液中可以通過(guò)血清白蛋白對(duì)EFKX進(jìn)行儲(chǔ)存和運(yùn)輸。溫度的變化對(duì)結(jié)合位點(diǎn)影響不大，表明EFKX與BSA結(jié)合的穩(wěn)定性；n接近于1，說(shuō)明二者相互作用時(shí)形成了1∶1的復(fù)合物。

2.2 以恩諾沙星為研究對(duì)象的該體系的熒光光譜

圖3 EFLX-BSA體系的熒光光譜(303 K)Fig.3 The fluorescence spectra of the EFLX-BSA system(303 K)A:Emission spectra;B:Excitation spectra.cEFLX=5.215×10-6 mol/L;cBSA(a-h):0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5(×10-6 mol/L).

據(jù)1.2.2得到不同溫度下EFLX與BSA相互作用的熒光譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，隨著B(niǎo)SA濃度依次增高，EFKX的熒光強(qiáng)度呈增強(qiáng)的趨勢(shì)，而它在410 nm處的發(fā)射峰彼此重疊，但這并不是由熒光的敏化增強(qiáng)作用引起的，從激發(fā)圖譜可知這二者的熒光嚴(yán)重交疊所致，在EFLX的檢測(cè)條件下，BSA仍然具有較強(qiáng)的發(fā)射熒光，且熒光強(qiáng)度隨濃度的增大而增大，使得EFLX的熒光受到嚴(yán)重干擾。因此，本研究以圖3中相應(yīng)濃度的純BSA溶液作空白，在相同的儀器條件下掃描BSA的熒光光譜，所得數(shù)據(jù)與圖3中的數(shù)據(jù)聯(lián)合處理后，得到EFLX隨BSA濃度變化的真實(shí)熒光譜圖如圖4所示。可見(jiàn)隨著B(niǎo)SA濃度的增加，EFLX的熒光強(qiáng)度呈遞減趨勢(shì)。由動(dòng)態(tài)方程分別得出相應(yīng)溫度下的KSV、Kq、Ka和n及對(duì)應(yīng)的線性相關(guān)系數(shù)r3、r4，結(jié)果列于表2。

表2 恩諾沙星與BSA在不同溫度下的猝滅反應(yīng)參數(shù)

Note:r3is the correlation coefficients ofF0/F-[Q];r4is the correlation coefficients of lg[(F0-F)/F]-lg[Q].

由表2的數(shù)據(jù)得出該體系的猝滅方式為靜態(tài)猝滅。對(duì)比經(jīng)典熒光光譜法，可以得出無(wú)論是以蛋白還是以藥物為檢測(cè)對(duì)象，得出的二者相互作用的機(jī)理是一致的。結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，相同溫度下，以藥物為檢測(cè)對(duì)象的數(shù)值均大于以蛋白為檢測(cè)對(duì)象的數(shù)值，表明BSA肽鏈中除色氨酸殘基外，其它殘基也與EFLX發(fā)生了相互作用。該相互作用信息能在恩諾沙星的熒光譜圖上表現(xiàn)出來(lái)。由此可以得出，相對(duì)于經(jīng)典熒光光譜法，以藥物小分子為檢測(cè)對(duì)象的分析方法能更全面、準(zhǔn)確地傳達(dá)藥物與蛋白分子的整體作用信息。

2.3 恩諾沙星-BSA體系的紫外光譜

EFLX與不同濃度的BSA結(jié)合反應(yīng)的紫外吸收光譜如圖5。BSA與EFLX的結(jié)合常數(shù)Kb關(guān)系[13]：

(1)

其中A0、A是猝滅劑加入前后的吸光度值，[L]表示猝滅劑的濃度。由圖5得出EFLX在波長(zhǎng)270 nm的吸收峰是隨BSA濃度的增大而降低并且發(fā)生藍(lán)移[14]，從而表明BSA與EFLX的作用方式為溝槽式。由于BSA在EFLX紫外吸收峰處有影響，故采用對(duì)應(yīng)相同濃度的蛋白作為參比。由式(1)得出的方程列于表3。由表3中的結(jié)合常數(shù)可以看出，它與以EFLX為檢測(cè)對(duì)象的數(shù)據(jù)更接近。

圖4 EFLX-BSA體系的熒光光譜(303 K)Fig.4 The fluorescence spectra of the EFLX-BSA system(303 K)cEFLX=5.215×10-6 mol/L,cBSA(a-h):0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5(×10-6 mol/L).

圖5 EFLX-BSA體系的紫外(UV)光譜 (303 K)Fig.5 The UV spectrum of the EFLX-BSA systemcEFLX=5.215×10-6 mol/L;cBSA(a-g):0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0(×10-7 mol/L).

T/(K)Kb/(L/mol)Equation of linear regressionr52989.82×105(A0-A)-1=2.931+2.984×10-6[L]-10.99763032.55×106(A0-A)-1=5.734+2.250×10-6 [L]-10.99603084.13×106(A0-A)-1=7.185+1.739×10-6[L]-10.99803135.00×106(A0-A)-1=14.487+2.894×10-6[L]-10.9903

Note:r5is the correlation coefficients of (A0-A)-1-[L]-1.

2.4 熱力學(xué)函數(shù)的變化與作用力的判斷

藥物與蛋白之間的主要作用力類(lèi)型包括疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力等[15]。EFLX-BSA 體系的熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算[16 - 17]結(jié)果見(jiàn)表4。可知，EFLX-BSA體系在不同溫度下的△G< 0、△S>0，相互作用是一個(gè)熵驅(qū)動(dòng)的過(guò)程；△H>0、△S>0，表明作用力主要以疏水作用力為主。

表4 不同溫度下EFLX-BAS體系熒光猝滅過(guò)程的熱力學(xué)參數(shù)

Note:r6is the correlation coefficients ofRlnKa-1/T.

2.5 恩諾沙星與BSA的作用方式

2.5.1NaCl、KI對(duì)EFLX和EFLX-BSA體系的影響按1.2.4的實(shí)驗(yàn)方案，分別固定EFLX-BSA體系和EFLX的量，加入不同量的NaCl溶液，依次測(cè)量各熒光發(fā)射峰強(qiáng)度,見(jiàn)圖6(A)。由圖可知，隨著離子強(qiáng)度的增大，EFLX-BSA體系和EFLX自身的熒光強(qiáng)度基本保持不變，說(shuō)明Na+并未發(fā)生與EFLX和BSA的競(jìng)爭(zhēng)作用，即EFLX與BSA之間不是靜電作用[18]。由圖6(B)可以看出I-離子對(duì)EFLX-BSA體系的影響小于對(duì)EFLX單獨(dú)的影響，進(jìn)一步表明EFLX與BSA之間不是靜電作用。EFLX由于與BSA結(jié)合而部分被保護(hù)，故有可能二者是嵌入式作用或溝槽式作用[19]。

圖6 NaCl/KI對(duì)EFLX和EFLX-BSA體系的影響 Fig.6 The influence of NaCl/KI on the fluorescence intensity of the EFLX-BSA system cEFLX=5.215×10-6 mol/L;cBSA=1.0×10-6 mol/L.

2.5.2EFLX與EB、DH、Hoechst熒光染料的競(jìng)爭(zhēng)作用由于EB和DH與BSA的作用方式是典型的嵌入式作用，而Hoechst熒光染料則是與BSA以溝槽式結(jié)合[20 - 21]，可通過(guò)分別比較EB-BSA、DH-BSA、Hoechst-BSA的二元復(fù)合物結(jié)合常數(shù)和加入EFLX后的三元復(fù)合物體系的結(jié)合常數(shù)的大小，來(lái)判斷藥物小分子以何種方式與BSA結(jié)合，依1.2.4中的方法掃描各個(gè)體系的熒光光譜圖，再依據(jù)Scatchard方程得出它們的結(jié)合常數(shù)，列于表5，由表中數(shù)據(jù)可知典型的嵌入式代表物EB和DH的Ka均比加入EFLX后的三元復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)高出一個(gè)數(shù)量級(jí)，故EFLX與EB及EFLX與DH均不存在競(jìng)爭(zhēng)作用，即EFLX與BSA之間不是嵌入式作用方式。由Hoechst熒光染料的熒光圖譜數(shù)據(jù)可知，EFLX與BSA相互作用為溝槽式。對(duì)比表1、表2與表5也可以看出EFLX-BSA與Hoechst+BSA、EFLX+Hoechst-BSA的Ka同屬一個(gè)數(shù)量級(jí)，進(jìn)一步表明EFLX與BSA的作用方式為溝槽式。

表5 EFLX與曙紅B、鹽酸柔紅霉素、赫斯特?zé)晒馊玖系母?jìng)爭(zhēng)作用

Note:r7is the correlation coefficients of lg[(F0-F)/F]- lg[Q].

3 結(jié)論

利用經(jīng)典的以蛋白為檢測(cè)對(duì)象的熒光光譜法和以藥物小分子為檢測(cè)對(duì)象的熒光光譜法探究了藥物小分子與BSA的相互作用，并以紫外光譜法進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果表明以具有熒光的藥物分子為檢測(cè)對(duì)象的探究方法比經(jīng)典的以蛋白為檢測(cè)對(duì)象的方法，能更全面、更準(zhǔn)確地表達(dá)蛋白與藥物小分子的相互作用。同時(shí)本研究還通過(guò)離子強(qiáng)度的影響，以及與染料的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了EFLX與BSA的作用力類(lèi)型，并得出EFLX與BSA的結(jié)合方式是溝槽式，從分子層面上進(jìn)一步了解了EFLX的藥效、藥理，對(duì)于新的喹諾酮類(lèi)光譜抗菌藥的開(kāi)發(fā)具有一定的指導(dǎo)作用。