秦廣利，肖文靜

菌落總數(shù)傳統(tǒng)與快速檢測技術(shù)的比較探討

秦廣利，肖文靜

（商丘市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗測試中心，河南商丘 476000）

采用對比分析法，將檢測食品微生物菌落總數(shù)的傳統(tǒng)國標(biāo)法與現(xiàn)代快速檢測法進行比較分析。在綜述分析采用國標(biāo)法檢測注意事項的基礎(chǔ)上，重點介紹現(xiàn)代快速檢測的技術(shù)原理及特點，該方法具有速度快、檢測項目全、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點，在食品微生物菌落總數(shù)的檢測中具有重要應(yīng)用價值。

傳統(tǒng)方法；快速方法；菌落總數(shù)

民以食為天，食以安為先。食品是人類賴以生存和發(fā)展的基本物質(zhì)條件，食品安全涉及人類最基本的權(quán)利保障。隨著經(jīng)濟的全球化，食品種類越來越豐富；隨著食品加工過程中化學(xué)品和新技術(shù)的廣泛使用，食品安全問題也越來越突出。三聚氰胺、瘦肉精、毒豆芽等事件頻頻曝光，嚴(yán)重危害消費者身體健康與生命安全，食品安全問題已成為消費者關(guān)注的焦點。為了保證食品安全，國家出臺了《中華人民共和國食品衛(wèi)生法》 《中華人民共和國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全》等相關(guān)的法律與條例，科學(xué)合理的檢測技術(shù)是確保食品安全的關(guān)鍵，運用先進的檢測方法是保障檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和可信度的保障。食品中菌落總數(shù)反映從原料加工到成品包裝受外界污染情況，也能夠衡量細(xì)菌在食品中的繁殖動態(tài)，確保食品的保質(zhì)期，是食品安全衛(wèi)生評價的重要指標(biāo)[1-2]。將檢測食品微生物菌落總數(shù)的傳統(tǒng)國標(biāo)法與現(xiàn)代快速檢測法進行比較分析，對食品安全菌落總數(shù)的檢測具有重要意義。

1 傳統(tǒng)檢測方法

1.1 傳統(tǒng)檢測方法的流程

傳統(tǒng)檢測方法的流程：

檢樣20 g/mL樣品+225 mL稀釋液，均質(zhì)→10倍系列稀釋→選擇2～3個適宜稀釋度的樣品勻液各取1 mL，分別加入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)→每皿中加入15～20 mL平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混勻→培養(yǎng)→計數(shù)各平板菌落數(shù)→計算菌落總數(shù)→報告。

1.2 注意事項

國標(biāo)法檢驗樣品中微生物菌落總數(shù)是樣品經(jīng)過前處理后，平板接種到一定成分培養(yǎng)基上，在一定溫度、時間、有氧等條件下培養(yǎng)后所得到每克或每毫升中形成的結(jié)果。該方法采用普通培養(yǎng)基，在溫度為35～37℃的有氧條件下培養(yǎng)，所以檢測的結(jié)果只包括了一些嗜中溫、有氧的細(xì)菌菌落，對于一些有特殊營養(yǎng)要求厭氧菌受到了抑制，與樣品中實際菌落總數(shù)存在差異。因此，采用國標(biāo)法檢測菌落總數(shù)應(yīng)該注意以下幾個問題。

1.2.1 玻璃器皿及稀釋液

檢測樣品前先將檢驗過程所用到的玻璃器皿（如培養(yǎng)皿、微量移液管、錐形瓶等） 徹底清洗干凈，然后用滅菌設(shè)備進行完全滅菌，保證沒有任何殘留菌或抑菌物質(zhì)；制作樣品稀釋液時最好每批設(shè)空白對照組，防止在樣品平板上若菌落出現(xiàn)較少，就要與對照平板進行比較，用于診斷是否是空白稀釋液、平皿培養(yǎng)基、吸管等可能存在的污染。

1.2.2 樣品稀釋

檢驗樣品稀釋時，固體和半固體樣品無菌稱取25 g，放入裝有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，轉(zhuǎn)速控制在8 000～10 000 r/min均質(zhì)1～2 min（因樣品而定）。如果固體樣品較大，先無菌剪碎再放；液體樣品用無菌吸管吸取25 mL，放入裝有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混合均勻，稀釋成比例為1∶10樣品液。如果液體樣品酸度較高（比如碳酸性飲料類的食品），直接吸取原液進行檢測，往往會出現(xiàn)結(jié)果偏低，甚至為0，可以先用25%左右的無菌碳酸鈉將樣品液的pH值調(diào)成中性，再嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)進行檢測才能降低結(jié)果誤差[3]。

如果想繼續(xù)遞增稀釋成1∶100的樣品勻液，選擇1 mL的無菌吸管或微量移液管吸取1∶10樣品液1 mL，放入裝有9 mL稀釋液的無菌試管中，注意加入溶液時所使用的吸管或移液管尖端緊靠試管壁慢慢注入，切忌不要觸及稀釋液面，加入后輕輕振蕩搖勻即可。

1.2.3 制作平皿接種與培養(yǎng)

平皿制作時要根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求對樣品污染狀況進行估計，選擇適宜的2～3個稀釋度樣品勻液（液體樣品可包括原液），分別進行10倍遞增稀釋時，用無菌吸管吸取1 mL樣品勻液從皿側(cè)加入，注意不要全部揭開皿蓋，每個稀釋度分別做2個平皿作為重復(fù)。同時，分別吸取空白稀釋液1 mL加入2個無菌皿內(nèi)作為樣品液的對照。然后每個平皿分別加入15～20 mL平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，溫度控制在45～47 ℃。

平皿接種后，待瓊脂凝固時將平板翻轉(zhuǎn)開始培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度和時間根據(jù)食品樣品種類確定。原因是不同食品在加工生產(chǎn)時溫度及特性存在明顯差異。肉、奶、蛋類食品培養(yǎng)溫度35～37℃，培養(yǎng)時間47～49 h；水產(chǎn)品29～30℃培養(yǎng)70～74 h。具體每種食品培養(yǎng)溫度與時間參照食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 菌落計數(shù)

培養(yǎng)到一定時間后，從溫箱內(nèi)取出平板開始菌落計數(shù)時，可以肉眼觀察，也可以借助放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量，菌落計數(shù)單位以CFU表示。菌落選取的范圍控制在30～300 CFU，無蔓延菌落生長的平板計數(shù)總數(shù)，少于30 CFU的平板可記錄具體菌落數(shù)，多于300 CFU的平板可記錄為多部可計。每個樣品稀釋度的菌落數(shù)，應(yīng)該采用2個重復(fù)平板的平均數(shù)。

平板菌落診斷，每個稀釋度2個重復(fù)平板，如果其中1個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該樣品稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的50%，而其余50%中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表1個平板菌落數(shù)。當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無顯著界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈條作為1個菌落計數(shù)。

1.2.5 結(jié)果與報告

菌落結(jié)果報告填寫有6種情況：①如果在所設(shè)不同稀釋度中只有1個稀釋度平板的菌落數(shù)在適宜的范圍內(nèi)，將2個平板菌數(shù)的平均值乘以相對應(yīng)稀釋倍數(shù)作為報告的值；②若有2個稀釋度平板菌落數(shù)平均值都在適宜范圍內(nèi)，應(yīng)該根據(jù)2個稀釋的平均值之比確定報告數(shù)，比值小于2，報告其平均值；③若所有稀釋度的平板菌落數(shù)都大于300 CFU，結(jié)果按稀釋最高的平板菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)報告；④若所有稀釋度的平板數(shù)都小于30 CFU，結(jié)果按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；⑤若所有稀釋度的平板都無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告；⑥若所有稀釋度的平板菌落數(shù)都不在30～300 CFU，其中一部分小于30 CFU，一部分大于300 CFU，則以接近30 CFU或300 CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。

2 快速檢測新技術(shù)

2.1 3M測試片快速分析技術(shù)

2.1.1 3M測試片快速分析技術(shù)概念

3M測試片法是一種便捷可再生水化干膜，適用于細(xì)菌和真菌的計數(shù)。

3M測試片效果見圖1。

圖1 3M測試片效果

2.1.2 檢測步驟

3M測試片快速分析步驟見圖2。

圖2 3M測試片快速分析步驟

只需3步就可實現(xiàn)快速準(zhǔn)確的測定。

2.1.3 結(jié)果判讀

3M測試片快速分析結(jié)果見圖3。

圖3 3M測試片快速分析結(jié)果

①測試片中含有一種紅色指示染劑可使菌落著色，計算所有紅色菌落（不論其大小和顏色深淺均計算之）；②測試片上沒有任何菌落生長；③測試片生長有不多的菌落；④測試片生長的菌落數(shù)在25～250個適宜范圍內(nèi)；⑤測試片生長菌落數(shù)超過250個，則選擇觀察1個或幾個有代表性的小方格面積（1 cm2），求其平均數(shù)乘以測試片的總面積，獲得總菌落數(shù)；⑥測試片上菌落太多而無法計數(shù)。

2.1.4 3M測試片技術(shù)特點

（1）提高工作效率。使用3M測試片快速分析食品中微生物菌落，與傳統(tǒng)分析方法相比較，簡化了檢測程序，減少了樣品分析成本，節(jié)省勞動資源，縮短了樣品檢測分析時間，能在更短的時間內(nèi)獲得樣品分析的準(zhǔn)確可靠結(jié)果，效益明顯得到提高。大量研究分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用3M測試片技術(shù)可以顯著提高樣品檢測工作效率。

（2）微生物菌落檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化。傳統(tǒng)的檢測方法在培養(yǎng)基配制、樣品接板、培養(yǎng)條件的控制等環(huán)節(jié)，不同的檢測人員在操作上存在差異，造成檢測結(jié)果有誤差。3M測試片快速檢測技術(shù)簡化了傳統(tǒng)檢測方法的環(huán)節(jié)，解決了傳統(tǒng)方法存在的問題及弊端，實現(xiàn)了微生物菌落檢測技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化。

（3）3M測試技術(shù)得到國際化的認(rèn)證。3M測試技術(shù)在微生物菌落檢測中得到廣泛應(yīng)用，同時也通過了AOAC，AFNOR在國際權(quán)威機構(gòu)的認(rèn)證，在世界其他國家也獲得官方機構(gòu)的批準(zhǔn)，實現(xiàn)了全球化推廣應(yīng)用，得到了檢測結(jié)果的可靠性和世界各地的廣泛認(rèn)可。

（4） 方便進行HACCP認(rèn)證。3M測試技術(shù)由于檢測速度快、檢測項目全、準(zhǔn)確性高的特性，為食品加工生產(chǎn)過程中關(guān)鍵控制點的監(jiān)控提供了快速檢測技術(shù)，實現(xiàn)了包括生產(chǎn)線、生產(chǎn)設(shè)備和環(huán)境在內(nèi)的各個環(huán)節(jié)進行全面的測試。

2.2 ATP熒光法快速檢測技術(shù)

2.2.1 技術(shù)原理

螢火蟲會發(fā)光是由于它能合成將化學(xué)物質(zhì)的化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿纳锎呋瘎獰晒馑孛浮⑾x熒光素（D-luciferin），以及所有細(xì)胞生物都產(chǎn)生的生物能量物質(zhì)——三磷酸腺苷（ATP）。

蟲熒光素與三磷酸腺苷在催化劑熒光酶的作用下，發(fā)生有氧氧化反應(yīng)。

化學(xué)反應(yīng)式見圖4。

圖4 化學(xué)反應(yīng)式

2.2.2 技術(shù)特點

ATP熒光法檢測食品微生物總菌落數(shù)在國內(nèi)外已被廣泛推廣應(yīng)用，該方法具有成本低、操作簡單、響應(yīng)速度快等特點。

2.3 MTT法快速檢測技術(shù)

2.3.1 技術(shù)原理

活體微生物細(xì)胞中線粒體含有琥珀酸脫氫酶，外源性MTT（噻唑藍(lán)）在琥珀酸脫氫酶作用下被還原成不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan） 并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞不能發(fā)生此還原反應(yīng)。甲臜（Formazan） 結(jié)晶形成的量與活菌數(shù)成正比。將酶聯(lián)免疫檢測儀的波長調(diào)控到490 nm處測定其吸光度，可間接反映活菌細(xì)胞數(shù)量。

巴氏消毒牛奶中活菌素快速檢測流程見圖5。

圖5 巴氏消毒牛奶中活菌素快速檢測流程

2.3.2 應(yīng)用實例巴氏消毒奶中活菌素快速檢測

巴氏消毒牛奶中活菌素快速檢測結(jié)果見圖6。

取巴氏消毒奶10 mL，置于無菌離心管中以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心5 min，棄去上清液；加入10 mL無菌生理鹽水洗滌離心管，再次3 000 r/min離心5 min，棄去上清取出奶液基質(zhì)；加入1 mL生理鹽水重懸底部的微生物，取0.2 mL到96孔酶標(biāo)板中，同時加入標(biāo)準(zhǔn)菌液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，統(tǒng)一加入底物反應(yīng)30 min，讀數(shù)。

圖6 巴氏消毒牛奶中活菌素快速檢測結(jié)果

該技術(shù)具有檢測快速、靈敏度高等特點。

3 結(jié)語

食品中菌落總數(shù)反映了從原料加工到成品包裝受外界污染情況，也能夠衡量細(xì)菌在食品中的繁殖動態(tài)，確保食品的保質(zhì)期，是食品安全衛(wèi)生評價的重要指標(biāo)。檢測過程的每一個環(huán)節(jié)都要認(rèn)真細(xì)心、精準(zhǔn)操作，才能確保結(jié)果的準(zhǔn)確度。傳統(tǒng)檢測最常用的方法是國標(biāo)法采用的平板計數(shù)，操作過程復(fù)雜，完成檢測時間較長，影響工作效率。而新的檢測技術(shù)檢測速度快、檢測項目全、準(zhǔn)確性高，但是存在成本相對較高，并且對檢測食品的種類有特定的要求。因此，應(yīng)該研究科學(xué)先進的檢測技術(shù)，讓檢測更加精準(zhǔn)、經(jīng)濟、便捷和可靠，確保食品衛(wèi)生安全。

[1]黃偉偉.食品中菌落總數(shù)的國標(biāo)法測定注意事項及快速檢測技術(shù) [J].臺灣農(nóng)業(yè)探索，2012（3）：56-59.

[2]盧崇南，劉毅，吳達(dá)勇.pH值對菌落總數(shù)檢測結(jié)果的分析 [J]．國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報，2005（15）：121-122.

[3]王曉文，張俊偉.TTC應(yīng)用于食品菌落總數(shù)測定的研究 [J]．遼寧大學(xué)學(xué)報，2011，38（1）：86-89.◇

The Discussion of the Analysis on the Comparison of Detection Technology between the Traditional and the Fast Method

QINGuangli，XIAOWenjing
（Shangqiu Quality Technology Supervision and Testing Center，Shangqiu，He'nan 476000，China）

In this paper，the comparative analysis method is used to the traditional national standard method and modern rapid detection method of testing the total number of bacterial colonies.On the basis of the review of the national standard method，the principle and characteristics of modern fast detection technology are introduced.The Examples prove that the method is fast，test items complete and high accuracy，and which is of great importance in the detection of microbial colony of food.

traditional methods；the fast method；the total number of colonies total number of colonies

TS207.4

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.09.018

1671-9646（2017） 09a-0064-03

2017-07-18

秦廣利（1979— ），女，碩士，工程師，研究方向為微生物學(xué)。