向 輝， 譚 利， 袁絲蘭， 張羅一覽， 鄭 紅*,2,3

(1.重慶師范大學化學學院，重慶 401331； 2.中國科學院青海鹽湖研究所，青海西寧 810008； 3.青海師范大學化學系，青海西寧 810008)

磺胺二甲基嘧啶(Suifamethazine，SM2)是較廣泛應用的磺胺類藥物之一，其抗菌性強，消炎作用好，廣泛用于豬、禽和牛養(yǎng)殖業(yè)疾病的預防和治療[1 - 2]，但是過量食用含SM2的動物組織能導致人的過敏反應，對人類的健康產(chǎn)生極大危害，因此，我國農(nóng)業(yè)部在2002年235號公文中規(guī)定動物源性食品中磺胺類總量不得超過0.1 mg/kg[3]。目前，測定磺胺類物質(zhì)的方法有：酶聯(lián)免疫方法(ELISA)[4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[5]、反相高效液相色譜法(RP-HPLC)[6 - 7]、高效液相色譜法(HPLC)[8 - 9]、薄層色譜法[10]等。但是以上方法均存在一些缺點，且測定SM2時很多物質(zhì)對其測定有干擾，很難用于復雜樣品中SM2的測定，因此建立操作方便、適用性強、準確性高的分析方法對SM2的檢測有重大意義。

本研究分別以SM2、二乙烯三胺、聚乙二醇、環(huán)氧樹脂為目標分子、功能單體、溶劑、交聯(lián)劑，合成了對SM2具有特異性識別的分子印跡聚合物(MIP)，采用HCl-KMnO4-甲醛發(fā)光體系，運用流動注射儀學發(fā)光技術(FI-CL)，建立了對SM2有特異性識別的MIP-FI-CL分析方法，并成功用于復雜樣品中SM2的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

IFFM-D型流動注射化學發(fā)光儀(西安瑞邁電子科技有限責任公司)；DKL310C送風定溫恒溫箱(成都盛德先華科貿(mào)有限公司)；PS-20實驗室超聲波清洗機(鞏義市英峪儀器廠)；AL204電子天平(捷久計量衡器有限公司)

SM2標準儲備液(1.0×10-3mol/L):稱取0.273 g SM2(純度99%)，超聲溶解并定容于1 L容量瓶中備用;HCl(分析純，西隴化工)；KMnO4溶液(1.0×10-2mol/L);甲醛(分析純，南京化學試劑股份有限公司)；聚乙二醇1500(PEG)(分析純，上海研生實業(yè)有限公司)；二乙烯三胺(分析純，上海弘順生物科技有限公司)；環(huán)氧樹脂(濟南宏博利化工有限公司)。實驗用水為二次餾水。

1.2 SM2 MIP的制備

稱取聚乙二醇1500(PEG)8 g，水浴溶解，趁熱依次加入SM2 0.5 mmol，攪拌，再移取1 mL二乙烯三胺，同樣使其混合均勻，最后加入4 g環(huán)氧樹脂，充分攪拌5 min，再放入超聲清洗儀中超聲去除混合液中的氣泡，得到透明澄清的溶液。趁熱倒入一端已密閉的10 mL針筒中后，將另一端也密閉。將此針筒放入60 ℃的烘箱內(nèi)，在此條件下反應24 h，得到白色固狀聚合物。非印跡聚合物(NMIP)的制備除不加標準樣品SM2外，其余步驟相同。將柱狀MIP聚合物于室溫冷卻，然后研磨，將研磨后的粉末放于燒杯中，加入蒸餾水，放入超聲清洗儀中洗滌10 min，重復以上洗滌步驟數(shù)次，直至燒杯中的蒸餾水不再渾濁，則聚乙二醇已被洗盡。將洗滌后的粉末直接放入60 ℃烘箱中烘干，取出干燥已成塊狀的粉末，研磨過篩，收集粒徑為100～150 μm的聚合物粉末。

1.3 SM2 MIP柱的制備

將0.02 g含有SM2的印跡顆粒添加到塑料管中(20×4 mm)，兩頭用玻璃棉堵住，保證印跡顆粒不被沖走并使流路順通，將兩根內(nèi)徑3 mm、外徑為4 mm的軟管插入塑料管兩端即可。在用此印跡柱之前，將HCl、甲醛和KMnO4溶液同時流經(jīng)印跡柱，除去柱中的SM2，當混合溶液流經(jīng)印跡柱時，與柱中的SM2直接反應，產(chǎn)生CL信號，SM2不斷被消耗，發(fā)光信號漸漸變?nèi)?，當信號降至與空白信號相同且不再變化，此時可認為柱中的SM2被洗干凈。然后,用水洗去柱中的殘留物質(zhì)以備用。

圖1 分子印跡-化學發(fā)光分析流路圖Fig.1 Schematic diagram of molecularly imprinted chemiluminescence method a:HCl;b:KMnO4;c:formaldehyde;d:water;e:SM2 solution;F:flow cell;P:peristaltic pumb;V:8-way injection valve;HV:negative high voltage;PMT:photomultiplier tube;W:waste solution;AM:amplifier;A/D:digital to analog converter;COM:computer.

1.4 分析步驟

依照圖1所示流路檢測SM2，其步驟為：(1)SM2的富集。將泵1靜止，轉(zhuǎn)動八通閥使其位于e處，泵2運送SM2溶液流過印跡柱，吸附SM2。(2)洗脫除去殘余雜質(zhì)。泵1靜止，轉(zhuǎn)動八通閥使其位于d處，泵2運送重蒸餾水流過印跡柱，除去未被吸附的SM2溶液和雜質(zhì)。(3)化學發(fā)光檢測。轉(zhuǎn)動八通閥使其位于c處，泵1轉(zhuǎn)動，泵2停止，KMnO4、HCl和甲醛溶液同時流經(jīng)印跡柱，與吸附在柱子上的SM2發(fā)生CL反應。清洗MIP柱。泵1靜止，轉(zhuǎn)動八通閥使其位于d處，泵2運送二次蒸餾水流過MIP柱，將柱子上的剩余物洗盡，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 SM2分子印跡聚合物的紅外光譜表征

圖2 MIP和NMIP紅外(IR)光譜圖Fig.2 IR spectra of MIP and NMIP

由圖2紅外光譜可知，NMIP和MIP中1 500 cm-1處出現(xiàn)的強峰為環(huán)氧化物的特征峰，在2 600～3 000 cm-1處出現(xiàn)的峰為飽和碳氫鍵的峰，在3 400 cm-1處出現(xiàn)的寬峰為羥基的特征峰。這些特征峰在NMIP和MIP上同時出現(xiàn)，證明了NMIP和MIP合成成功，且他們的骨架成分相同，而在MIP中單獨出現(xiàn)1 528 cm-1的峰是C=N的特征峰，說明MIP柱上成功的吸附了SM2分子。

2.2 MIP柱的尺寸及穩(wěn)定性

在檢測中，將甲醛、HCl與KMnO4同時經(jīng)過MIP柱，若二者接觸太久，得到的信號過低。經(jīng)實驗，采用直型的塑料管(d=4 mm，L=20 mm)，將20 mg SM2 MIP填入即可，將其連入系統(tǒng)中。甲醛、HCl與KMnO4混合，與柱上的SM2反應，得到較強的CL信號。由實驗可得，制成的印跡柱重復使用上百次，性能幾乎不變。

2.3 化學發(fā)光分析條件的優(yōu)化

2.3.1酸介質(zhì)和濃度分別以1.2 mol/L的HCl、HNO3、H3PO4、H2SO4為反應介質(zhì)，測定KMnO4-甲醛-SM2體系的CL強度。結(jié)果表明，在HCl中CL信號最強，所以選取HCl為反應介質(zhì)。選取濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L HCl進行實驗，HCl為0.4 mol/L時CL信號最高，故選取0.4 mol/L為HCl最佳濃度。如圖3。

2.3.2KMnO4溶液濃度固定其他條件不變，考察了KMnO4濃度對CL強度的影響，如圖4。KMnO4溶液濃度在5.0×10.0-5～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)時，可以看出最佳條件是1.0×10-3mol/L。

圖3 鹽酸濃度對化學發(fā)光強度的影響Fig.3 Effect of HCl concentrations on chemiluminescence

圖4 高錳酸鉀濃度對化學發(fā)光強度的影響Fig.4 Effect of KMnO4 concentrations on chemiluminescence

2.3.3甲醛質(zhì)量分數(shù)當KMnO4、HCl、SM2濃度固定不變時，考察不同質(zhì)量分數(shù)甲醛對發(fā)光強度的影響。分別選取質(zhì)量分數(shù)為4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%，實驗結(jié)果表明甲醛質(zhì)量分數(shù)為10%時發(fā)光強度最大。

2.3.4吸附時間當溶液濃度相同，裝柱量相同時，檢測了吸附時間在 20～100 s對CL強度的影響，實驗結(jié)果顯示，對于1.0×10-3mol/L的SM2，在60 s 時，吸附量基本達到飽和，不再隨時間的改變而改變。因此，吸附時間定為60 s。

2.3.5化學發(fā)光時間甲醛、HCl、KMnO4溶液流經(jīng)印跡柱時,與印跡柱上的SM2反應,得到增強的CL信號。當其與空白信號一致時,可知柱上的SM2已被徹底消耗。結(jié)果表明，結(jié)束一個這樣的發(fā)光過程需時間50 s。

2.4 標準曲線、精密度和檢出限

在最佳實驗條件下，CL強度與SM2濃度在1.0×10-4～1.5×10-3mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系，回歸方程為：ΔICL=2.35×105c(mol/L)+16.92，相關系數(shù)R2為0.9988，檢出限是6.0×10-5mol/L。對濃度為0.5×10-3mol/L的SM2平行測定11次，相對標準偏差為1.6%

2.5 干擾實驗

2.6 樣品分析

在選定的最優(yōu)化條件下，測定在市面上購買的獸藥(含10%SM2)中SM2的含量，測定結(jié)果對照標準曲線SM2含量為9.1%。同時做加標實驗，稱取葡萄糖，NaCl，MgSO4，NH4NO3，KCl各0.1 g于500 mL容量瓶中，再加入適量的SM2標準溶液，二次蒸餾水定容。準確吸取一定體積溶液稀釋到線性范圍內(nèi)，按照圖1流程，3次平行測定，其回收率見表1。

表1 樣品中SM2的測定結(jié)果(n=3)Table 1 Results of sample and recovery tests(n=3)

3 結(jié)論

本文運用HCl-KMnO4-HCHO發(fā)光體系和SM2分子印跡技術聯(lián)用對復雜樣品中的SM2含量進行測定，結(jié)果令人滿意，方法的加標回收率為95.0%～109.0%。