秦玉燕, 王運儒, 時鵬濤， 杜國冬*， 藍 唯， 農耀京

(1.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西南寧 530001； 2.農業(yè)部亞熱帶果品蔬菜質量監(jiān)督檢驗測試中心，廣西南寧 530001)

1 前言

砷是土壤中普遍存在的有毒類金屬元素，被國際癌癥研究機構(IARC)列為第Ⅰ類明確致癌物。砷在地殼中主要以硫化物形式存在，世界上土壤砷背景平均值為6 mg/kg，我國為11.2 mg/kg[1]。由于采礦、冶煉、皮革、化工、化石燃料燃燒等工業(yè)活動的加強和含砷的農藥、化肥、殺蟲劑的大量使用，使得大量砷進入土壤。因此，土壤砷污染目前已經成為一個全球性的環(huán)境問題[2]。

砷在土壤中以不同形態(tài)存在，且不同形態(tài)間的毒性差異較大，總砷含量不足以評價砷對環(huán)境的影響及生物有效性。同時，砷的形態(tài)決定了砷在土壤中的可移動性和遷移轉化規(guī)律，也決定了生物對其吸收利用的程度[3]。土壤砷污染嚴重影響動植物生長和品質[4]，并通過食物鏈進入人體，最終威脅人類的生存和健康。砷的形態(tài)分析有可能闡明砷進入環(huán)境的方式及遷移、轉化過程的本質，闡明砷在水、氣、土壤、植物循環(huán)中的地球化學行為，為環(huán)境健康風險評估、砷污染土壤診斷與修復提供重要的科學依據，同時也為提高農產品質量和更好地制定土壤和農產品質量標準提供理論基礎。

2 土壤中砷的形態(tài)

砷在自然界中以-Ⅲ、0、+Ⅲ、+V四種價態(tài)存在，形成各種砷化合物，通常稱為氧化還原態(tài)。目前發(fā)現(xiàn)的砷形態(tài)共有50多種，包括砷酸(As(Ⅴ))、亞砷酸(As(Ⅲ))、一甲基砷酸(MMA(Ⅴ))、二甲基砷酸(DMA(Ⅴ))、三甲胂氧化物(TMAO)、四甲基砷(Me4As+)、砷甜菜堿(AsB)、砷膽堿(AsC)、阿散酸(p-ASA) 和洛克沙胂(ROX)等。土壤中砷主要以無機形態(tài)As(Ⅴ)和As(Ⅲ)為主[5]，還含有少量的有機砷。土壤中砷形態(tài)與吸附介質的種類、pH、氧化還原電位及土壤微生物活動[6]等有關，在氧化條件下以As(Ⅴ)為主，還原條件下以As(Ⅲ)為主，As(Ⅲ)可移動性比As(Ⅴ)大[7]。砷的氧化還原態(tài)決定著砷化合物的毒性，其中無機砷的毒性較強，As(Ⅲ)毒性是As(Ⅴ)的60倍，DMA(Ⅴ)和MMA(Ⅴ)毒性較弱。近年來在有機砷代謝過程發(fā)現(xiàn)的中間體DMA(Ⅲ)和MMA(Ⅲ)的毒性與As(Ⅲ)相當，AsB和AsC基本被認為無毒[8]。另一方面，由于砷在土壤中通常與Al、Fe、Ca等礦物元素相結合，根據結合的緊密程度將砷分為不同的結合形態(tài)，如交換態(tài)、碳酸鹽態(tài)、鐵錳氧化物態(tài)、有機結合態(tài)、殘渣態(tài)等，通常稱為砷的賦存形態(tài)。砷的賦存形態(tài)對于了解砷在土壤中的遷移轉化規(guī)律及生物有效性具有重要意義。

3 聯(lián)用技術分析法

3.1 樣品前處理技術

聯(lián)用技術一般是色譜法與光譜、質譜法聯(lián)合應用的分析方法，但分析前需要對樣品進行前處理。前處理過程的提取方式有水浴提取、振蕩提取、超聲輔助提取和微波輔助提取等。水浴提取一般伴隨加熱，加熱可提高提取率，但高溫易使砷形態(tài)發(fā)生轉化。振蕩提取對砷形態(tài)影響小，但提取率較低。超聲輔助提取和微波輔助提取的應用較多[9]。超聲過程可將固體顆粒打碎，增加溶劑與顆粒的接觸面積，使不易溶解的物質分散到提取劑中，也使包裹在顆粒內部的物質溶出。微波提取中提取劑和目標成分可在微波作用下迅速“體加熱”，采用低功率的微波萃取可避免長時間高溫分解樣品。張靜[10]以1.0 mol/L磷酸為提取劑，發(fā)現(xiàn)100 ℃水浴提取3 h，提取率可達79%，而超聲萃取只有51%?？梢娂訜嵯啾瘸暷芴峁└蟮哪芰恳詽M足砷從土壤礦物晶格中釋放。不同提取方法及應用見表1。

表1 土壤中砷形態(tài)提取方法Table 1 Extraction methods of arsenic speciation in soil

前處理過程既要使不同砷形態(tài)盡可能全部提取出來，又要保持其原有形態(tài)不發(fā)生變化，提取劑的選擇是關鍵。提取劑的種類、pH值和溫度是砷形態(tài)發(fā)生轉變的主要影響因素[27]。目前國內外應用最多的提取劑為磷酸及磷酸鹽溶液，其化學性質同砷酸鹽相似，不僅可以溶解土壤表面吸附的砷，還可以通過配位交換和競爭吸附解吸出氧化鐵和氧化鋁吸附的砷，甚至土壤顆粒晶格中的砷。前處理過程最大的難點是As(Ⅲ)易氧化成As(Ⅴ)，加入一定的輔助劑如抗壞血酸可以減少As(Ⅲ)的氧化，提高其穩(wěn)定性。白云飛[28]分別優(yōu)化了磷酸、鹽酸、磷酸鹽、草酸銨四種溶劑超聲提取土壤底泥中砷形態(tài)的方法，結果表明0.6 mol/L 磷酸的提取效果最好，提取率為49.46%。同時比較了抗壞血酸、EDTA和氯化羥銨三種輔助提取劑的效果，發(fā)現(xiàn)加入0.1 mol/L抗壞血酸時回收率在85.0%～105.0%之間，達到最佳。劉崴等[29]比較了磷酸-抗壞血酸、磷酸鹽-NaDDC兩種組合提取劑對土壤砷形態(tài)的提取效果，發(fā)現(xiàn)磷酸-抗壞血酸的提取率比較高，為70%以上；磷酸鹽-NaDDC提取率在57%以下，但提取過程砷形態(tài)穩(wěn)定性比較好，回收率在81.4%～115.9%之間。Georgiadis等[30]以磷酸鹽為提取劑，研究了EDTA、鹽酸羥銨和NaDDC 三種輔助劑對As(Ⅲ)氧化成As(Ⅴ)的抑制效果，發(fā)現(xiàn)加入EDTA不能阻止As(Ⅲ)的氧化；加入1%鹽酸羥銨，提取時間超過12 h時，As(Ⅲ)開始氧化；加入0.5% NaDDC能顯著抑制As(Ⅲ)的氧化。其原理是NaDDC作為一種螯合劑，在提取過程可以與As(Ⅲ)形成螯合物，阻止其氧化。Gallardo等[24]認為As(Ⅲ)氧化成As(Ⅴ)是動力學控制過程，其氧化速率取決于反應液濃度和pH，當對提取液進行稀釋和調節(jié)pH為中性時，反應速率很低。他以3 mol/L磷酸提取土壤樣品，提出控制As(Ⅲ)氧化的兩種方法：一種是提取液離心后立即稀釋10倍，5 h內As(Ⅲ)不會氧化；另一種是提取后立即用氨水調節(jié)pH為中性，As(Ⅲ)在5 h內保持穩(wěn)定。

3.2 分離及檢測方法

3.2.1氣相色譜聯(lián)用法氣相色譜氣相色譜(GC)用于易形成揮發(fā)性成分的低沸點物質的分析，對不易揮發(fā)的組分分析前需進行衍生化處理。巰基乙酸甲酯(TGM)可作為砷化物衍生試劑，但TGM屬于強還原劑，會將As(Ⅴ)還原成As(Ⅲ)，所以一般用于有機砷的衍生，不適用于土壤樣品的分析。由于很難找到一種有效的GC衍生法，使各砷形態(tài)同時被衍生成低沸點化合物，但GC與MS、ICP-MS等的連用可用于直接分析揮發(fā)性砷的形態(tài)。Yuan等[31]建立了一種液氮冷阱捕集、在線收集和分離湖泊沉積物釋放出的揮發(fā)性砷的方法，用棉花填裝柱對四種揮發(fā)性砷形態(tài)AsH3、CH3AsH2、(CH3)2AsH和(CH3)3As進行富集和分離，GC-AFS分析時檢出限達2.5～11 pg，RSD為3.2%～4.9%。周黎明等[32]采用正丁硫醇衍生-GC-MS對化學武器污染的土壤中的砷形態(tài)進行了研究，表明東北某地被污染的土壤中砷化合物的形態(tài)主要為 2-氯乙烯胂酸、雙(2-氯乙烯基)胂酸、三(2-氯乙烯基)胂、三苯胂、苯胂酸和二苯胂酸等。

3.2.2毛細管電泳聯(lián)用法毛細管電泳(CE)具有高效、快速、樣品用量少的特點，不同砷形態(tài)只要有結構或電荷上的差別都可以進行分離。但在實際樣品的分析過程中，CE與檢測設備聯(lián)用的接口較為復雜，紫外檢測器的靈敏度較低，對樣品基質的耐受力弱等問題限制了CE聯(lián)用技術的發(fā)展。CE-ICP-MS一般只能用于標準溶液和基體簡單樣品的分析。Koellensperger等[33]對接口處進行了改進，將CE-ICP-MS聯(lián)用技術應用于蜈蚣草根際土壤的分析，在分析As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsC、AsB 6種標準溶液時，檢出限為5.26～12.1 ng/g，RSD為3.73%～6.65%。李平靜等[34]采用在柱富集-CE/UV聯(lián)用技術對4-羥基苯砷酸、洛克沙砷、苯砷酸、4-氨基苯砷酸和4-硝基苯砷酸進行分析，檢出限為0.68～6.9 μg/L，RSD為5.6%～11.8%。

3.2.3高效液相色譜聯(lián)用法高效液相色譜(HPLC)分離主要包括離子對色譜和離子交換色譜。離子對色譜適用于分離中性和離子態(tài)的砷，四丁基氫氧化銨(TEAH)通常作為離子對試劑。當流動相pH為5.0～7.0時，As(Ⅲ)、DMA、MMA、As(Ⅴ)能較好分離，并依次洗脫出來，但As(Ⅲ)和AsB會同時最先洗脫出來。若調pH=9.0，As(Ⅲ)帶負電，色譜柱上較弱保留；AsB為兩性離子，色譜柱上不保留，二者可進行分離[35]。用氧化劑將As(Ⅲ)氧化成As(Ⅴ)也可實現(xiàn)AsB和As(Ⅲ) 的分離[36]。以苯-1,2-二磺酸二鉀鹽作為離子對試劑的多級色譜分析法，已成功用于分離常見的8種砷形態(tài)[20]。離子交換色譜在土壤砷形態(tài)分析中應用最廣，陰離子交換色譜一般用于分離As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA、MMA；陽離子交換色譜一般分離AsB、AsC、TMAO、Me4As+。Mrquez-García等[37]用Hamilton PRP-X100陰離子交換柱分離As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA、MMA和三種砷糖，Zorbax SCX-300陽離子交換柱分離AsB、AsC、TMAO和一種砷糖，從土壤中分離檢測到11種砷化合物。HPLC可以和大多數檢測系統(tǒng)如AAS、AFS、ICP-AES、ICP-MS等直接聯(lián)用，也可以通過氫化物發(fā)生(HG)裝置再與這些檢測器聯(lián)用。

(1)HPLC-ICP-MS。HPLC-ICP-MS聯(lián)用具有超高靈敏度、多元素同測等優(yōu)點，是實驗室研究砷形態(tài)最有效的工具之一。Mestrot等[38]建立了一種基于硝酸銀浸漬的硅膠填充管的化學捕集法，富集稻田土壤中的揮發(fā)性砷，HPLC-ICP-MS檢測AsH3、CH3AsH2、(CH3)2AsH和(CH3)3As四種形態(tài)，檢出限達3.8 ng，回收率80.1%～95.6%，可用于野外研究。Mello等[39]用HPLC-ICP-MS分析了金礦礦區(qū)富砷土壤在厭氧條件下的砷形態(tài)變化過程，并意外發(fā)現(xiàn)部分樣品主要含有機砷，可能是土壤中的生物(如海藻和藍藻)將無機砷轉化為有機態(tài)砷。Dobran等[40]用HPLC-ICP-MS分析了土壤中有機物的含量對土壤砷形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)有機物含量在7.5%～15%之間時，土壤結合的As(Ⅴ)會逐漸轉變?yōu)锳s(Ⅲ)。HPLC-ICP-MS在土壤砷形態(tài)分析中的應用見表2。

表2 HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術的應用Table 2 Application of HPLC-ICP-MS

(2)HPLC-HG-AFS。HG是在酸性條件下用還原劑KBH4將砷還原成相應的氫化物然后進行檢測。HG使砷形成的氫化物與復雜樣品基質分離[43]，只有形成的氫化物才能進入檢測器，消除了檢測器內遇到的光譜和化學干擾，靈敏度比常規(guī)的液體進樣方式提高10～100倍。對于不能形成氫化物的有機砷形態(tài)如AsB、AsC、Me4As+、砷糖和芳香族砷化物等，可通過微波輔助氧化、紫外光氧化等技術將其轉化為能形成氫化物的形態(tài)[35]。HPLC-HG-AFS在土壤砷形態(tài)分析中的應用見表3。

表3 HPLC-HG-AFS聯(lián)用技術的應用Table 3 Application of HPLC-HG-AFS

(3)HPLC與有機質譜聯(lián)用法。近年來，越來越多新的砷糖和砷脂類化合物逐漸被發(fā)現(xiàn)，由于常規(guī)檢測方法無法提供化合物結構信息，色譜分離過程可能出現(xiàn)同時洗脫或者不完全洗脫等原因[44]，新化合物的定性和定量分析較為困難。采用HPLC與電噴霧質譜(ESI-MS)[45]、快原子轟擊串聯(lián)質譜(FAB)、多級串聯(lián)質譜等有機質譜聯(lián)用分析，可提供未知砷化物的結構信息，用于新的、未知結構的砷形態(tài)的鑒定[46]。Hsieh等[47]用IC-ESI-MS聯(lián)用法對海藻中幾種未知形態(tài)的砷糖和砷脂類化合物進行了定性分析。

4 分級提取法

分級提取法是一種基于操作定義的選擇性提取法，通過一系列化學活性不斷增強的試劑來依次提取土壤中不同形態(tài)的砷，然后用測定總砷的方法分別測定各形態(tài)含量。Tessier等人在1979年首先提出五步提取法，將土壤中的砷形態(tài)分為交換態(tài)、碳酸鹽態(tài)、鐵錳氧化物態(tài)、有機結合態(tài)和殘渣態(tài)。Beesley等[48]在該方法基礎上進行了修正，將土壤中的砷形態(tài)分為水溶態(tài)、表面吸附態(tài)、Fe -Al 結合態(tài)、碳酸鹽結合態(tài)和殘渣態(tài)，并被胡毅鴻等[49]應用于分析石門雄黃礦礦區(qū)土壤砷形態(tài)。由于不同學者使用方法不同，各方法流程差異較大，得出的數據缺乏可比性。歐共體標準物質局于90年代初提出了三步提取法，對各步驟和流程做了統(tǒng)一規(guī)范，將土壤中的砷形態(tài)分為可交換態(tài)、可還原態(tài)、可氧化態(tài)和殘渣態(tài)，簡稱BCR法，并研制出了沉積物標準物質BCR 601。之后有學者針對BCR法重現(xiàn)性差的問題進行了改進[50]。胡德新等[51]采用改進BCR法測得礦產品堆場土壤可交換態(tài)、可還原態(tài)、可氧化態(tài)和殘渣態(tài)砷所占比例分別為1.4%～1.7%、1.6%～2.2%、19.4%～28.2%、64.4%～75.6%。BCR法是對重金屬形態(tài)分析普遍適用的方法，但相比之下Tessier法及各種改進方法在土壤砷形態(tài)分析中的應用更廣。Ariza等[52]分別比較了Tessier修正法、Meguellati法和BCR法三種方法對不同類型土壤的砷形態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)修正Tessier法更適合分析富含鐵氧化物的土壤。許仙菊等[53]采用Tessier連續(xù)提取法測得水稻不同生育期土壤砷均以殘渣態(tài)為主，占90%以上，其次是鐵錳氧化物態(tài)(0.8%～6.9%)，有機結合態(tài)(0.2%～0.9%)、碳酸鹽態(tài)(0.2%～1.3%)和交換態(tài)(0～0.4%)。楊曉偉[54]采用修正的Tessier法測得內蒙古某礦區(qū)土壤中水溶態(tài)砷、交換態(tài)砷、鋁形砷、鐵形砷、鈣形砷和殘渣態(tài)砷的含量分別為0.27%、1.56%、7.17%、12.47%、15.74%和62.79%。

水溶態(tài)和可交換態(tài)砷易遷移，是土壤中毒性最強的砷形態(tài)，易被植物吸收，其含量可反映植物受損程度[55]；碳酸鹽態(tài)、鐵錳氧化物態(tài)和有機結合態(tài)不易被植物吸收，但在一定條件下可釋放出來；殘渣態(tài)一般處于原生礦物晶格中，較為穩(wěn)定。土壤中砷形態(tài)一般以殘渣態(tài)為主，水溶態(tài)和交換態(tài)砷含量很低，說明土壤中大部分砷能穩(wěn)定存在，在自然條件下較難釋放到環(huán)境中，對環(huán)境相對安全。分析土壤不同結合態(tài)的砷，有利于人們在了解土壤砷形態(tài)組成的基礎上，對土壤砷污染進行修復。研究表明含鐵材料如FeCl3、FeCl2、Fe和Fe2O3[56]和有機無機復合藥劑[57]可將土壤中部分易溶態(tài)砷轉化成難溶態(tài)砷，生物炭可以通過吸附作用對污染土壤中可溶態(tài)砷進行固定[58]。在微生物作用下，土壤中加入有機物將有利于土壤中砷的甲基化作用和不同砷形態(tài)轉化為揮發(fā)態(tài)砷的過程，這預示著土壤砷污染修復的另一種新方式[59]。

5 同步輻射X-射線吸收光譜法

同步輻射X-射線吸收光譜法(Synchrotron Radiation X-ray Adsorption Spectroscopy,SRXAS)是一種原位微觀分析技術，包括拓展X-射線精細結構(EXAFS)和近邊結構分析(XANES)。EXAFS可提供元素氧化還原態(tài)、鍵合方式、分子形態(tài)等信息，XANES可得到混合物中不同形態(tài)的組成比例。SRXAS法對氣、液、固三相樣品均可實現(xiàn)元素氧化還原狀態(tài)的原位探測，同時可提供表面結合態(tài)、晶格態(tài)和無定形沉淀等形態(tài)信息[60]，在分子水平上給出目標元素周圍的局部結構和化學信息，實現(xiàn)形態(tài)分析與結構鑒定的同步進行。

SRXAS法無需進行樣品預處理，避免了前處理過程砷形態(tài)的轉變，近年來在土壤砷形態(tài)分析的應用越來越多[61]。劉永軒[62]用EXAFS測定了廣西刁江流域的表層土壤，結果上游土壤中砷形態(tài)主要由毒砂、As(Ⅴ)和As(Ⅲ)組成，百分含量分別為15%、82%、3%；中游土壤砷形態(tài)由毒砂和As(Ⅴ)組成，分別為8%和92%；下游土壤砷形態(tài)主要由As(Ⅴ)組成。萬小銘等[63]通過SRXAS法研究不同種群蜈蚣草中砷形態(tài)差異，結果表明，在蜈蚣草根部，砷以與O結合的方式存在，還存在少量As-S配位，砷形態(tài)以As(Ⅴ) 為主，占59.6%～83.8%。Manning等[64]用XANES技術分析發(fā)現(xiàn)，As(Ⅲ)處理的土壤中，As(Ⅲ) 主要與Fe(Ⅲ)的氫氧化物結合，而As(Ⅴ)可與Fe(Ⅲ)的氫氧化物、鋁的氫氧化物和鋁硅酸鹽結合。Acosta等[65]采用XANES分析礦山附近植物根際土壤中的砷形態(tài)，結果顯示所有樣品中的砷均為As(Ⅴ)。Landrot等[66]用EXAFS分析污染土壤中的砷形態(tài)，結果顯示土壤中的砷主要與Al結合，其次與Fe結合，并且主要以As(Ⅴ)形式與鋁氧化物結合，形成類似于砷鋁石結構的化合物。

SRXAS法可應用于檢測樣品處理過程砷形態(tài)是否發(fā)生變化，協(xié)助優(yōu)化聯(lián)用技術中的樣品前處理方法。Huynh等[67]用薄膜擴散梯度技術富集砷，1 mol/L HNO3或1 mol/L NaOH溶液將富集的砷反萃入溶液中，再進行HPLC-ICP-MS或HPLC-HG-AFS分析砷形態(tài)；對樣品處理全過程采用XANES技術分析砷形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)砷形態(tài)在富集過程都是穩(wěn)定的，但被反萃入溶液后發(fā)生了變化，部分As(Ⅴ)轉變成As(Ⅲ)，DMA轉變成MMA，因此，需要對反萃取過程的條件進行改進。Xu等[68]采用XANES分析土壤在厭氧條件下砷形態(tài)的變化規(guī)律，結果顯示厭氧條件下土壤溶液中的砷主要以As(Ⅲ)存在，隨著厭氧時間的增加，溶解砷的濃度呈現(xiàn)出M型變化特性，即加入硫酸鹽后，砷的濃度在厭氧時間為24 h和240 h時最高。近年來，有學者將SRXAS法和分級提取法聯(lián)合應用于土壤樣品的分析。Kim等[69]將土壤樣品先進行分級提取分析，殘渣再進行SRXAS分析，結果顯示冶金和尾礦污染的土壤中砷主要與鐵氧化物和硫化物結合。Niazi等[70]采用分級提取法和SRXAS技術分析污染土壤中砷的形態(tài)和有效性，兩種方法分析結果均顯示土壤中砷主要以鐵氧化物結合態(tài)存在，且大部分樣品中砷為As(Ⅴ)，只有少數樣品為As(Ⅲ)。將分級提取法和SRXAS技術相結合，既可以對砷的不同價態(tài)及與礦物結合的不同形式進行分析，又可以對不同形態(tài)進行準確定量，是土壤砷形態(tài)分析發(fā)展的方向。

6 結語與展望

聯(lián)用分析法和分級提取法屬于表觀形態(tài)研究方法，可實現(xiàn)對砷形態(tài)的間接分析；SRXAS是一種微觀分析技術，可對砷形態(tài)進行直接分析。目前實驗室主流的分析方法是聯(lián)用技術分析法，其中應用最廣的是HPLC-ICP-MS和HPLC-HG-AFS聯(lián)用法，具有較高的靈敏度。由于土壤基質較復雜，聯(lián)用技術的前處理過程如何保持砷形態(tài)的穩(wěn)定性一直是分析的難點，提取率高且不改變砷形態(tài)的前處理方法還有待于進一步研究。分級提取法的優(yōu)點在于對儀器設備要求低，不受條件限制，但只能對土壤砷的賦存形態(tài)進行分析，且受土壤理化和生物因素影響大，重復性較差，因此主要應用于土壤砷的生物有效性分析。SRXAS法可同時分析砷的賦存形態(tài)和氧化還原態(tài)，無需對樣品進行預分離或化學處理，分析結果更可靠，但對儀器設備和操作人員的技術要求較高，一般實驗室還不具備分析條件。SRXAS法在研究元素吸附機理，元素形態(tài)轉化機理、規(guī)律和影響因素等方面具有獨特的優(yōu)勢，是最具發(fā)展前景的形態(tài)分析方法。另外，將聯(lián)用技術分析法、分級提取法和SRXAS法相結合是今后發(fā)展的趨勢。