童 圓， 彭西甜*,， 龔 艷， 韓雅荃， 呂江潮， 馮鈺锜

(1.生物醫(yī)學分析化學教育部重點實驗室，武漢大學化學系，湖北武漢 430072；2.湖北省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，湖北武漢 430064；3.長江大學生物工程系，湖北荊州 434020)

苯并[a]芘又稱3,4-苯并芘(3,4-Benzopyrene，Bap)，在食品煙熏、烘烤、油炸過程中容易產生[1]。當油溫達到270 ℃時，產生的油煙和油炸食品中含有的苯并[a]芘可誘發(fā)人體腫瘤和導致細胞染色體的損壞。而苯并[a]芘會在體內蓄積，剛開始接觸或吸入苯并[a]芘時沒有不適反應，但其有較長的潛伏期，可造成胎兒的畸形和DNA的突變等。苯并[a]芘是目前世界公認的三大強致癌物質之一[2]，因此，許多國家嚴格限制食品中苯并[a]芘的含量。德國對肉制品中苯并[a]芘的殘留限制標準為1 μg/kg，歐盟規(guī)定煙熏劑中苯并[a]芘的含量不超過0.03 μg/kg[3]。我國也對苯并[a]芘制定了限量標準，生活飲用水水質標準為0.01 μg/L以下，糧食和肉制品的食品衛(wèi)生標準為5 μg/kg以下，植物油中為10 μg/kg以下，熏烤動物源性食品為5 μg/kg以下[4]。方便面和烤腸在中國日常消費量很大，2008年韓國電視臺報道韓國農心公司生產的6款方便面中檢測出苯并[a]芘，因此，建立快速高效的方便面和烤腸中苯并[a]芘的檢測方法，對于保障消費者的身體健康和促進相關產業(yè)的發(fā)展非常重要。

目前，文獻報道了大氣[5]、肉類食品[6 - 9]、茶葉[10]、水[11]及水產品[12]、植物油[13 - 15]、反應香精[16]、香煙[17 - 19]和土壤[20]中苯并[a]芘的檢測方法，主要有熒光分光光度法、薄層層析法、高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯(lián)用法等[21]。其中，熒光分光光度法容易被其他物質干擾，氣相色譜法因其較高的柱溫和柱壓，引起苯并[a]芘構型變化，為定性和定量帶來較大的困難，而高效液相色譜-熒光法具有靈敏度高和分析速度快等優(yōu)點，是較常用的方法。然而，采用高效液相色譜-熒光法測定苯并[a]芘的國家標準和行業(yè)標準方法前處理步驟復雜，有機溶劑消耗較大，不利于批量樣品的分析。胡加文等[22]用固相萃取-液相色譜-熒光法測定方便面中苯并[a]芘，得到苯并[a]芘的檢出限為0.3 μg/kg，然而該方法中所用淋洗溶劑的體積較大，環(huán)境不友好。

本研究采用維泰克科技(武漢)有限公司的苯并[a]芘專用固相萃取柱，結合高效液相色譜-熒光檢測，建立了一種食品中苯并[a]芘的快速、高效的分析方法。該方法與傳統(tǒng)方法相比，簡單快速、有機溶劑消耗少，適于方便面和烤腸等食品中苯并[a]芘的批量分析檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與色譜條件

LC-20A型高效液相色譜儀(日本,島津公司)，配熒光檢測器。色譜條件：色譜柱：HiSep C18-T色譜柱 (150×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈∶水= 88∶12(V/V)；流量：1.0 mL/min；熒光檢測器：λex=384 nm,λem=406 nm；柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL。IKA MS1 Minishake漩渦振蕩器(德國,IKA公司)；Anke TDL-40B型離心機(上海安亭儀器廠)；BSA2202S電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；OA-SYS氮吹儀(美國,Organomation公司)；HiCapt Benzo苯并[a]專用固相萃取柱(500 mg,6 mL)。

1.2 試劑與材料

苯并[a]芘標準溶液(20.0 mg/L)購自農業(yè)部環(huán)境質量監(jiān)督檢驗測試中心(天津)；準確吸取100 μL苯并[a]芘標準溶液，置于10 mL容量瓶中，用正己烷定容，配制成200 μg/L的標準溶液，避光，4 ℃冰箱保存，用于制備標準曲線。色譜純的丙酮、乙腈、正己烷、異丙醇購自德國默克公司，其它試劑均為分析純。超純水由Milli-Q純水儀(Millipore,Billerica,MA,USA)制備。

不同的方便面和烤腸樣品購自武漢市場。

1.3 樣品制備

稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL正己烷，勻漿3 min，于 6 000 r/min下離心3 min，收集10 mL上清液，待凈化。在HiCapt Benzo苯并芘專用柱(500 mg，6 mL)中依次加入5 mL丙酮、2 mL正己烷活化，將10 mL待凈化液加入HiCapt Benzo柱中，待上樣液完全流出后，用6 mL體積比為1∶4的異丙醇-正己烷混合溶劑清洗固相萃取柱，棄去清洗液，將小柱抽干后，用6.0 mL丙酮將苯并[a]芘從固相萃取柱上解吸下來，收集解吸液，40 ℃氮氣吹干，加入1 mL異丙醇渦混定容，0.22 μm濾膜過濾至進樣瓶中，待上機分析。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

流動相中乙腈的比例對苯并[a]芘出峰位置有較大影響，乙腈比例較大時，洗脫能力較強，可以縮短苯并[a]芘的保留時間，但是基線漂移較大，且與樣品中其它雜質發(fā)生重疊；減小乙腈比例，基線相對平穩(wěn)，可以改善樣品溶液中各個色譜峰的分離度，卻延長了苯并[a]芘的保留時間，分析操作費時。綜合考慮上述因素，當 乙腈∶水=88∶12(V/V)，流速為 1.0 mL/min 時，苯并[a]芘出峰時間合適，基本沒有樣品基質的干擾，柱壓不高且峰形較好。

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

根據苯并[a]芘易溶于有機溶劑的化學性質，采用正己烷、二氯甲烷及乙酸乙酯作為提取溶劑，結果表明三種提取溶劑對苯并[a]芘都有較高的提取效率。然而，在下一步固相萃取過程中，采用極性較大的二氯甲烷和乙酸乙酯作為上樣溶劑時萃取效率分別只有15.5%和13.5%，而置換溶劑會使整個分析過程更加復雜，因此，選擇正己烷作為提取溶劑。

方便面和烤腸中基質較為復雜，一些干擾物也可能被萃取到HiCapt Benzo柱上，因此在解吸前選擇合適的清洗溶劑對其進行清洗，可以減少干擾物對目標分析物分離檢測的影響。清洗溶劑的選擇應該遵循在除去干擾物的同時保證目標物的回收率最高的原則。在正己烷中加入不同比例的異丙醇作為清洗溶劑，結果表明6 mL體積比為1∶4的異丙醇-正己烷混合溶劑作為清洗溶劑，苯并[a]芘回收率較好，同時也可以去除大部分的基質組分。

最后，實驗考察了甲醇、乙腈和丙酮對苯并[a]芘的解吸效率，發(fā)現6 mL的丙酮基本可以完全解吸HiCapt Benzo柱上的苯并[a]芘，而甲醇和乙腈的解吸效率都在70%以下，因此選擇6 mL的丙酮作為解吸溶劑。

在最優(yōu)化的實驗條件下，苯并[a]芘標準樣品色譜圖、方便面和烤腸空白樣品色譜圖和加標樣品色譜圖分別見圖1及圖2。從圖中可以看出，經過HiCapt Benzo柱處理后，方便面和烤腸提取液可以得到很好地凈化，苯并[a]芘的分析沒有基質的干擾。

圖1 5.0 μg/L苯并[a]芘標準溶液(a)、空白方便面樣品(b)以及加標5.0 μg/kg的苯并[a]芘的空白方便面樣品(c)的色譜圖Fig.1 Chromatograms of benzo[a]pyrene standard solution(a),blank instant noodles(b) and blank instant noodles spiked with benzo[a]pyrene at 5.0 μg/kg spiked level(c)

圖2 5.0 μg/L苯并[a]芘標準溶液(a)、空白烤腸樣品(b)以及加標5.0 μg/kg的苯并[a]芘的空白烤腸樣品(c)的色譜圖Fig.2 Chromatograms of benzo[a]pyrene standard solution(a),blank instant noodles(b) and blank instant noodles spiked with benzo[a]pyrene at 5.0 μg/kg spiked level(c)

2.3 方法學考察

2.3.1線性方程及檢出限將200 μg/L的苯并[a]芘標準溶液用異丙醇稀釋，配制質量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的系列標準溶液，從低濃度到高濃度進樣，按最優(yōu)的色譜條件進行測定，每個濃度進行三次平行測定，得出峰面積的平均值，以峰面積(X)為橫坐標，質量濃度(Y，μg/mL) 為縱坐標，制作標準曲線，其回歸方程為：Y=8.0×10-6X+0.1062，相關系數R2=0.9997。分別以3倍和10倍的信噪比(S/N)計算方法的檢出限和定量限，檢出限和定量限分別為0.13 μg/kg和0.40 μg/kg。我國規(guī)定苯并[a]芘在糧食和肉制品中的最大殘留限量為5 μg/kg，該方法的靈敏度可以很好地滿足苯并[a]芘分析檢測的要求。

2.3.2回收率和精密度準確稱取 2.0 g空白的方便面和烤腸樣品，分別加入1.0、5.0、10.0 μg/kg的苯并[a]芘，按照1.3的方法進行提取凈化，最優(yōu)的色譜條件進行測定，計算加標回收率，分析結果見表1。結果顯示，方便面和烤腸中苯并[a]芘低、中、高三種加標濃度的回收率分別在 92.2%～98.3%和95.9%～97.9%之間，日內和日間相對標準偏差(RSD)分別在 3.34%～5.01%和2.11%～4.07%之間，表明該方法的準確度和精密度良好，能夠滿足方便面和烤腸中苯并[a]芘日常檢測的要求。

表1 方便面和烤腸中苯并[a]芘分析的低中高添加回收率和日內、日間精密度Table 1 Recoveries at three different concentrations and intra-and inter-day precision for analysis of benzo[a]pyrene in instant noodles and sausage

2.4 實際樣品的測定

在市場上分別購買了10種不同品牌的方便面和烤腸樣品，在優(yōu)化的條件下采用本方法對這些樣品中的苯并[a]芘進行分析，在所有樣品中均未檢出苯并[a]芘殘留。對其中三種方便面和三種烤腸樣品進行了添加回收率的考察，結果如表2所示，所有樣品的回收率在83.4%～105.6%之間，RSD小于7.0%，表明該方法具有很好的適用性，在實際樣品分析中具有很好的應用前景。

表2 實際樣品分析的添加回收率及相對標準偏差Table 2 Recoveries and RSDs for the analysis of benzo[a]pyrene in real samples

3 結論

本文建立了一種固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定方便面和烤腸中苯并[a]芘含量的方法。樣品用正己烷提取后，采用苯并[a]芘專用固相萃取柱凈化富集，高效液相色譜熒光分析，回收率及精密度均獲得滿意的結果，同時將其應用到實際樣品的分析，取得了較好的效果。與傳統(tǒng)苯并[a]芘檢測方法相比，該方法大大縮短了檢測時間和有機溶劑的消耗量，提高了檢測效率，很適合用于油炸煙熏食品中苯并[a]芘的批量快速分析。