唐 建， 陳 述， 李春娟， 龍?jiān)骑w

(湖南科技大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，理論化學(xué)與分子模擬省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南湘潭 411201)

三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，其氮含量高達(dá)66%，將其添加到食品及飼料中可以提高蛋白質(zhì)的虛高含量[1]。因此，食品中三聚氰胺的檢測具有現(xiàn)實(shí)意義。目前，常用的三聚氰胺檢測方法有高效液相色譜法[2]、氣相色譜-質(zhì)譜法[3]、電化學(xué)方法[4]以及同位素法[5]等。這些方法中大多操作比較繁瑣，有些需要昂貴的儀器，不適于現(xiàn)場檢測。因此，開發(fā)簡單并能應(yīng)用于現(xiàn)場分析的三聚氰胺檢測方法，是該領(lǐng)域的重要發(fā)展方向?；诮饘偌{米粒子聚集而導(dǎo)致顏色變化的比色分析法引起了人們越來越多的關(guān)注[6]，該方法已廣泛用于檢測金屬離子[7]、小分子[8]和蛋白質(zhì)[9]。其中，金納米粒子(AuNPs)由于具有容易制備、穩(wěn)定、生物相容性好、尺寸可調(diào)及高的消光系數(shù)等特性而被廣泛應(yīng)用于比色分析[10]。銀納米粒子(AgNPs)和AuNPs相比，擁有更高的吸光系數(shù)，因而在比色分析中也具有自身的優(yōu)勢。但是由于銀表面容易氧化[11]，使其在比色分析中存在穩(wěn)定性相對較差的缺點(diǎn)，界面功能化和選擇合適的穩(wěn)定劑對提高AgNPs比色分析結(jié)果穩(wěn)定性具有很好的效果。比如用適當(dāng)配體穩(wěn)定的功能化AgNPs已成功的用于氨基酸[12]、DNA[13]的比色分析。

利用目標(biāo)分析物與納米粒子表面分子之間的相互作用，引起納米粒子聚集并導(dǎo)致顏色變化已用于檢測2,4,6-三硝基甲苯[14]、含巰基的氨基酸和肽[15]。Han等[16]用對硝基苯胺穩(wěn)定的納米銀，可視化檢測出0.1 mg/kg含量的三聚氰胺。本文采用低毒的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)穩(wěn)定的AgNPs為探針，通過富電子的三聚氰胺和AgNPs表面上的缺電子PVP發(fā)生相互作用后，引起AgNPs團(tuán)聚，導(dǎo)致吸收光譜的變化和溶液顏色的變化，從而建立了可視化檢測三聚氰胺的方法，該方法具有更好的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Lambda35型紫外-可見分光光度計(jì)(美國，鉑金埃爾默儀器公司)；Tecnai G20型透射電子顯微鏡(美國，F(xiàn)EI公司)；KQ2200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DF-101B型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

PVP(平均分子量：58000，Aladdin Chemistry Co.)，三聚氰胺、NaBH4(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，硼酸(長沙分路口塑料化工廠)，H3PO4(湖南匯虹試劑有限公司)，HCl(湖南省株洲市化學(xué)工業(yè)研究所)，NaOH、AgNO3、檸檬酸鈉(汕頭市西隴化工廠)，所有試劑均為分析純，在使用前均沒有進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1PVP保護(hù)的AgNPs的制備AgNPs的制備參照Sun等的實(shí)驗(yàn)[17]，具體做法為:將47.5 mL二次蒸餾水加入到錐形瓶中，通氮?dú)獬?0 min后，將錐形瓶置于磁力攪拌器中，依次加入0.5 mL檸檬酸三鈉(30 mmol/L)、1.0 mL AgNO3(5.0 mmol/L)、0.5 mL新制的NaBH4(50.0 mmol/L)，此時溶液由無色變?yōu)槲ⅫS，30 s后加入0.5 mL PVP(0.5 mg/mL)，反應(yīng)30 min后將錐形瓶取出，此時溶液為深黃色。

1.2.2三聚氰胺合成樣品的制備向含5.0×10-6mol/L三聚氰胺的1.4 mL溶液中分別加入200 μL Fe3+(5.0×10-5mol/L)、Cu2+(5.0×10-5mol/L)、半胱氨酸(5.0×10-5mol/L)，混勻后制得合成樣品1；向含5.0×10-6mol/L三聚氰胺的1.4 mL溶液中分別加入200 μL Al3+(5.0×10-5mol/L)、Co2+(5.0×10-5mol/L)、L-組氨酸(5.0×10-5mol/L)，混勻后制得合成樣品2。

1.2.3牛奶樣品前處理提取液的配制和牛奶樣品中三聚氰胺的提取參考文獻(xiàn)方法[5]，對溶劑用量進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整，具體方法如下：(1)提取液的配制：取750 mL 0.1%三氯乙酸溶液與750 mL乙腈混溶，避光保存。(2)牛奶樣品中三聚氰胺的提?。簻?zhǔn)確移取0.40 mL牛奶樣品于5.0 mL具塞塑料離心管中加入3.2 mL提取液和20.0 μmol/L的三聚氰胺內(nèi)標(biāo)溶液0.4 mL(相當(dāng)于提取液中加入的三聚氰胺的濃度為2.00 μmol/L)，超聲提取10 min，振蕩提取10 min，于10 000 r/min離心10 min，過濾，取上清液備用。

1.2.4紫外-可見光譜研究和三聚氰胺的檢測紫外-可見光譜通過Lambda35型紫外-可見分光光度計(jì)檢測。將200 μL不同濃度的三聚氰胺加入1.7 mL AgNPs中，搖勻后再加入100 μL的B-R緩沖溶液(pH=8.69)，搖勻，避光放置6 h 后進(jìn)行測試。

2 結(jié)果與討論

圖1 檢測三聚氰胺的原理Fig.1 Mechanism for detection of melamine

2.1 三聚氰胺的檢測原理

AgNPs的合成及對三聚氰胺檢測的原理如圖1所示。由于三聚氰胺中的氮原子含有孤對電子，因此三聚氰胺可以作為電子供體，可以向作為受體的缺電子的PVP提供電子，這種相互作用可引起AgNPs的聚集，最終導(dǎo)致溶液的紫外-可見光譜和溶液顏色的變化，這種變化與三聚氰胺濃度之間存在內(nèi)在聯(lián)系，從而可實(shí)現(xiàn)三聚氰胺的定量檢測。

2.2 AgNPs的紫外-可見吸收光譜

用PVP做保護(hù)劑制備的AgNPs呈深黃色，其局域表面等離子體特征峰位于396 nm處(圖2中曲線a)，將此納米粒子避光放置半個月后顏色和吸收峰位置都無明顯變化。當(dāng)往制得的AgNPs中加入pH值為8.69的B-R緩沖溶液后，AgNPs的黃色變淺，其局域表面等離子體特征峰會藍(lán)移至392 nm處(圖2中曲線 b)且吸收峰的強(qiáng)度增大、吸收峰變窄。這可能是由于B-R緩沖溶液將大粒徑的AgNPs溶解成小粒徑的AgNPs所致。當(dāng)往AgNPs中加入2.0 μmol/L的三聚氰胺后(圖2中曲線c)，AgNPs的吸光度降低、吸收波長紅移，并在530 nm附近出現(xiàn)一新的吸收峰，AgNPs顏色由黃色變?yōu)榛疑＿@些變化是由于AgNPs的團(tuán)聚引起的。

圖2 不同條件下AgNPs的紫外-可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of AgNPs under different conditions(a) AgNPs;(b) AgNPs+ B-R buffer;(c) AgNPs+ melamine+B-R buffer.

2.3 AgNPs與三聚氰胺反應(yīng)后的形貌表征

將制備的AgNPs和分別與0.5 μmol/L、2.0 μmol/L 三聚氰胺反應(yīng)后的AgNPs進(jìn)行透射電鏡(TEM)表征得到的形貌如圖3所示，單獨(dú)的AgNPs粒徑較小，且分散均勻(圖3a)，當(dāng)往AgNPs中加入0.5 μmol/L的三聚氰胺后，AgNPs 發(fā)生輕微團(tuán)聚并且粒徑有所增大(圖3b)；加入2.0 μmol/L 三聚氰胺后，AgNPs 發(fā)生明顯團(tuán)聚并且粒徑變得更大。這是由于三聚氰胺可以與AgNPs表面上的PVP發(fā)生相互作用，引起AgNPs的聚集，甚至發(fā)生顆粒間的融合，出現(xiàn)大量的大顆粒。

2.4 檢測三聚氰胺實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1pH值的優(yōu)化圖4是pH對檢測三聚氰胺的影響，結(jié)果表明在pH為8.69的B-R緩沖溶液中，AgNPs與三聚氰胺作用后的吸光度改變值最大，在其它pH條件下，AgNPs的吸光度改變較小，因此實(shí)驗(yàn)選擇pH值為8.69的B-R緩沖溶液作為工作條件。

圖3 AgNPs與不同濃度三聚氰胺反應(yīng)后的透射電鏡(TEM)圖 Fig.3 TEM images of AgNPs reacting with different concentrations of melamine(a) 0 μmol/L;(b) 0.5 μmol/L AgNPs;(c) 2.0 μmol/L.

2.4.2AgNPs濃度的優(yōu)化在三聚氰胺濃度不變的條件下，改變AgNPs的濃度，當(dāng)AgNPs濃度為0.4 mmol/L(以銀原子的濃度計(jì)算)時，AgNPs和三聚氰胺反應(yīng)后吸光度降低得最大，見圖5。這是因?yàn)樽鳛殡娮庸w的三聚氰胺的濃度一定時，AgNPs濃度越大，作為電子受體的PVP濃度也越大，電子供體和受體之間的相互作用就會減弱，從而不利于AgNPs團(tuán)聚。AgNPs的濃度降低時，雖然電子供體和受體之間的相互作用會增加，但是由于AgNPs間的間距增大也不利于AgNPs團(tuán)聚。因此，只有當(dāng)AgNPs濃度適當(dāng)，電子供體和受體間的相互作用較強(qiáng)時才能很好的引起AgNPs團(tuán)聚。

圖4 pH對檢測三聚氰胺的影響Fig.4 The influence of the pH on the melamine detection

圖5 AgNPs濃度對三聚氰胺檢測的影響Fig.5 The influence of the concentration of AgNPs on the melamine detection

2.4.3反應(yīng)時間優(yōu)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)制備的AgNPs與三聚氰胺要反應(yīng)一定時間后才能使AgNPs的吸光度降到最低。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時間的延長，AgNPs的吸光度逐漸下降，反應(yīng)時間為6 h時，AgNPs的吸光度降到最低。因此，我們確定實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)時間為6 h。

圖6 與三聚氰胺具有相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)對三聚氰胺檢測的影響Fig.6 The influence of the melamine analogues on the melamine detection

2.5 結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)對AgNPs吸光度的影響

為了考察該檢測方法對三聚氰胺的選擇性，在相同測試條件下，在與三聚氰胺濃度(2.0×10-6mol/L)相同的情況下，探討了幾種與三聚氰胺具有相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)與AgNPs反應(yīng)后引起的吸光度的變化情況。結(jié)果如圖6所示，在實(shí)驗(yàn)選定的條件下，三聚氰胺與AgNPs反應(yīng)后使AgNPs吸光度下降得最多，其它物質(zhì)的信號響應(yīng)值均小于三聚氰胺信號響應(yīng)值的5.0%。說明在該實(shí)驗(yàn)條件下，AgNPs對三聚氰胺的識別具有良好的選擇性。

2.6 三聚氰胺的檢測參數(shù)

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，按照實(shí)驗(yàn)方法，在300～600 nm波長范圍內(nèi)掃描紫外-可見吸收光譜(圖7a)。從圖中可以看出，隨著加入的三聚氰胺濃度的增大，AgNPs在392 nm處的吸光度降低，吸收峰位置紅移，并在530 nm處出現(xiàn)一個新吸收峰，AgNPs的顏色由淺黃變成深黃最后變成灰色，這些變化都是由于AgNPs的聚集引起的。濃度在5.0×10-8～2.0×10-6mol/L范圍內(nèi)，在392 nm處的吸光度降低值與三聚氰胺的濃度之間存在較好的線性關(guān)系(圖7b)，線性方程為：△A=0.01574+0.2266c，相關(guān)系數(shù)r為0.9951。另一方面，當(dāng)濃度在0.1～2.0×10-6mol/L范圍內(nèi)，顏色變化可以直接用肉眼分辨，由此可以建立一種三聚氰胺的半定量檢測方法。和同位素法[5]相比較，本方法更為簡單且靈敏度更高。

圖7 AgNPs與不同濃度三聚氰胺反應(yīng)的紫外-可見吸收光譜(a)和線性曲線(b)Fig.7 UV-Vis absorption spectra(a) and linear curve(b) of AgNPs reacting with different concentrations of melamine The concentration of melamine from line 1 to 7(μmol/L):0,0.05,0.1,0.5,1.0,1.5,2.0.

2.7 合成樣品中三聚氰胺含量的檢測

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，對1.2.2節(jié)中2個合成樣品中的三聚氰胺進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1所示。由表1可知，合成樣品的回收率在91.43%～105.70%之間，牛奶樣品中的加標(biāo)回收率在91.00%～97.50%范圍，說明選擇的牛奶樣品中不含有三聚氰胺，同時說明方法有一定的實(shí)際應(yīng)用價值。

表1 樣品的測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文利用富電子的三聚氰胺和缺電子的PVP在AgNPs界面上進(jìn)行電子相互轉(zhuǎn)換，從而引起AgNPs團(tuán)聚，團(tuán)聚前后AgNPs的顏色和吸光度都會發(fā)生明顯變化，且AgNPs在392 nm處的吸光度隨三聚氰胺濃度的增大呈梯度降低。據(jù)此，建立了一種定量檢測三聚氰胺的方法，當(dāng)三聚氰胺濃度在0.1×10-6～2.0×10-6mol/L范圍，溶液的顏色變化與三聚氰胺濃度關(guān)系可以直接用肉眼分辨，由此可以建立一種簡單的可視化檢測三聚氰胺方法。