盧坤，董仕鵬，高士祥，毛亮

南京大學環(huán)境學院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京210046

酶催化降解四溴雙酚A反應引起的碳納米管急性毒性變化

盧坤，董仕鵬，高士祥，毛亮*

南京大學環(huán)境學院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京210046

辣根過氧化物酶催化去除四溴雙酚A的反應能夠改變多壁碳納米管(multiwall carbon nanotubes, MWCNTs)在水環(huán)境中的穩(wěn)定性。為探究該反應對碳納米管生態(tài)毒性效應的影響，選擇大型蚤(Daphnia magna)和斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)作為受試生物，分別考察了反應前后MWCNTs對大型蚤的急性毒性以及對斜生柵藻的生長抑制和藻細胞色素的影響。結(jié)果表明，在1～10 mg·L-1的暴露濃度下，與原始的MWCNTs相比，反應后的MWCNTs對大型蚤的急性毒性明顯減弱。在10 mg·L-1的暴露劑量下，原始的MWCNTs造成大型蚤的死亡率高達65%，而反應后的MWCNTs引起大型蚤的死亡率僅為23%。此外，反應前后的MWCNTs對斜生柵藻的生長均有抑制作用。隨著暴露濃度的增大，藻細胞密度、葉綠素a和b的含量逐漸降低。與原始MWCNTs相比，反應后的MWCNTs對斜生柵藻的毒性明顯減弱。上述研究結(jié)果為評價MWCNTs的環(huán)境風險提供了基礎數(shù)據(jù)。

碳納米管；四溴雙酚A；大型蚤；斜生柵藻；毒性；環(huán)境風險

Received10 January 2017accepted10 March 2017

Abstract: The physicochemical properties of multiwall carbon nanotubes (MWCNTs) were modified by the tetrabromobisphenol A (TBBPA) radicals resulting from the reaction mediated by horseradish peroxidase. The Daphnia magna and Scenedesmus obliquus were selected in this study as the testing organisms to reveal the toxic response of the MWCNTs and the modified MWCNTs resulted from the enzymatic reaction. Our experimental results indicated that the mortality of Daphnia magna caused by the modified MWCNTs was much lower than that of the pristine MWCNTs did. Both the cell density and the pigment (chlorophyll a and b) content of Scenedesmus obliquus were decreased after the exposure of MWCNTs and modified MWCNTs. However, the above effects induced by the pristine MWCNTs were stronger than that the modified MWCNTs did. The above results suggest that the toxicity of MWCNTs was changed by the enzymatic reaction, providing a preliminary data for evaluating the risks of MWCNTs in the natural environment.

Keywords: MWCNTs; TBBPA; Daphnia magna; Scenedesmus obliquus; toxicity; environmental risks

碳納米管作為一種新興的功能納米材料，由于其優(yōu)良的物理化學性質(zhì)，目前已經(jīng)被廣泛應用在電子、光學、生物醫(yī)學、藥學、能源、催化和水處理等領域[1-3]。然而隨著其大量的生產(chǎn)和廣泛的應用，碳納米管會不可避免地釋放到環(huán)境中并且能夠影響環(huán)境中污染物的遷移、轉(zhuǎn)化行為以及生物可利用性[4-9]。目前大多數(shù)的研究側(cè)重于碳納米材料對污染物環(huán)境行為的影響，鮮有文獻報道污染物在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化行為對碳納米材料本身物理化學性質(zhì)的改變以及其環(huán)境行為的影響。碳納米材料物理化學性質(zhì)的微小變化都可能改變其環(huán)境行為以及毒性[10-12]。例如Hu等[11]研究發(fā)現(xiàn)在光照和水合作用下，石墨烯能夠被氧化且片層厚度減小，使得被氧化后的石墨烯更容易團聚，降低了石墨烯對藻細胞的毒性。此外，包裹了斑馬魚代謝物的石墨烯尺寸變小，能夠延遲斑馬魚胚胎的孵化，甚至造成畸形和死亡現(xiàn)象[12]。

在自然環(huán)境中，植物、動物和微生物能夠分泌多種多樣的酶[13-14]；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)是一種植物分泌出來的過氧化物酶、并廣泛存在于環(huán)境中，在過氧化氫或者其他有機過氧化物存在的條件下，可以催化去除含酚環(huán)的芳香族化合物，并產(chǎn)生自由基[15-17]。如Colosi等[18]報道，4-甲氧基苯酚在HRP催化作用下產(chǎn)生自由基，該類自由基能夠攻擊全氟化合物的碳-氟鍵，進而使其降解。四溴雙酚A (TBBPA)的全球使用量約為120 000至150 000噸每年，這使得其成為環(huán)境中最常被檢測到的溴代阻燃劑[19-20]。

本文在發(fā)現(xiàn)辣根過氧化物酶(HRP)催化去除四溴雙酚A(TBBPA)反應能夠改變多壁碳納米管物理化學性質(zhì)的基礎上，進一步利用實驗室培養(yǎng)的大型蚤和斜生柵藻為受試生物來評價該反應對碳納米管本身所造成的毒性變化，為進一步評價碳納米管對水生生物的毒性效應和環(huán)境風險提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與材料

儀器：紫外可見分光光度計(Cary 50，美國)，細胞超聲破碎機(JY88-II，南京以馬內(nèi)利儀器有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱(HZQ-F160，成都一科儀器設備有限公司)，離心機(Bisfuge Stratos，美國)，環(huán)境掃描電鏡(FEI Quanta x50，美國)，光照培養(yǎng)箱(PGX-35013，寧波海曙賽福實驗儀器廠)，LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)，真空抽濾機(SHZIII，南京科爾儀器有限公司)，動態(tài)激光散射儀(Nano ZS, Malvern)。

試劑：辣根過氧化物酶(HRP)和四溴雙酚A(TBBPA，> 97%)購自Sigma公司，多壁碳納米管購自深圳納米港。根據(jù)廠家提供的信息，原始的MWCNTs管徑為20～40 nm，長度< 5 μm，純度> 97%，比表面積為30～50 m2·g-1。丙酮、甲醇、過氧化氫等均為分析純。

1.2 試驗生物

大型蚤(Daphnia magna)由中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心提供，為實驗室條件下培養(yǎng)3代以上的單克隆品系。參照《水質(zhì)物質(zhì)對蚤類(大型蚤)急性毒性測定方法》(GB/T 132662—91)(國家環(huán)境保護局，1991)將大型蚤培養(yǎng)在曝氣72 h以上的稀釋水中，溫度控制在(23±1) °C，光暗比為12 h:12 h。每24 h給大型蚤喂食一定量濃縮的斜生柵藻。實驗前一天挑選懷卵的大型蚤放入已配好的稀釋水中，待母蚤產(chǎn)出足夠幼蚤后，取24 h內(nèi)游動活潑的幼蚤進行暴露實驗。

實驗用斜生柵藻(Scenedesmus obliquus, S. obliquus)購買于中國科學院水生生物研究所，并參照OECD 201標準方法進行培養(yǎng)。斜生柵藻培養(yǎng)在SE培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為26 °C，光暗比為12 h:12 h。

1.3 材料制備及表征

反應后的多壁碳納米管(modified MWCNTs)的制備參考筆者之前的文獻[21]。將10 μmol·L-1TBBPA、10 μmol·L-1H2O2、0.02 U·mL-1HRP和5 mg·L-1的MWCNTs置于250 mL錐形瓶中，反應60 min后，通過抽濾裝置將MWCNTs用0.22 μm的水相濾膜過濾出來，并依次用甲醇和超純水清洗3次以去除碳納米管表面吸附的有機物，最后將MWCNTs冷凍干燥處理以得到modified MWCNTs。分別對原始MWCNTs和modified MWCNTs進行掃描電鏡表征(圖2)。

分別稱取1 mg的MWCNTs和modified MWCNTs置于40 mL頂空瓶中，然后加入20 mL超純水配制成50 mg·L-1的溶液。將溶液進行超聲分散，然后分別取1 mL進行動態(tài)光散射測定[22]，剩下的19 mL溶液靜置在水平桌面上并進行遮光處理，在0、2、8、24、48、72、120和360 h進行拍照記錄其聚集狀態(tài)。

1.4 實驗方法

1.4.1 大型蚤急性毒性實驗

實驗設定MWCNTs和modified MWCNTs的暴露濃度為1、2.5、5、7.5、10 mg·L-1，同時設定空白組。每個處理設置4個平行，暴露試驗在100 mL燒杯中進行。每個燒杯中盛有30 mL暴露液，隨機投放入10只新生的大型蚤(< 24 h)。觀察并記錄48 h后大型蚤的受抑制個數(shù)。以玻璃棒輕觸燒杯壁，大型蚤不運動為實驗終點，僅觸角運動也視為受抑制。

1.4.2 斜生柵藻

實驗方法參考Li等[17]的研究。首先準備若干經(jīng)過高溫滅菌處理過的150 mL錐形瓶，每個錐形瓶中含有40 mL MWCNTs/modified MWCNTs溶液和10 mL對數(shù)期的斜生柵藻母液，最終使得S. obliquus的初始濃度為7.5×105cell·mL-1。設置的MWCNTs和modified MWCNTs溶液的暴露濃度設置為0.1、 1、5、10、20、25 mg·L-1。同時設置空白對照組，每組設置3個平行。將錐形瓶置于光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，分別在0、12、24、48、72、96 h測定藻液的細胞密度。藻液的細胞密度測量采用鏡檢法結(jié)合分光光度法，通過紫外可見分光光度計測定685 nm處的藻液的吸光度，用血球計數(shù)板鏡檢藻細胞密度，并繪制藻的細胞密度-吸光值標準曲線(見圖1)。

暴露96 h后，將40 mL斜生柵藻溶液3 600 r·min-1離心10 min，將上清液去除，加入10 mL 90%的丙酮溶液，搖勻，在暗處放置24 h以提取細胞色素，再以3 600 r·min-1離心10 min，取上清液至于比色皿中于664、647 nm處測定溶液的吸光度值。采用如下公式計算葉綠素a、b含量[23]。

圖1 斜生柵藻的藻細胞密度-吸光度值標準曲線Fig. 1 The standard curve of cell density of S. obliquus vs. absorption value

圖2 MWCNTs與辣根過氧化物酶-四溴雙酚 A(HRP-TBBPA)的自由基反應過程示意圖Fig. 2 Scheme of reaction between MWCNTs and the radioactive radicals resulting from horseradish peroxidase (HRP)-mediated 14C-labeled tetrabromobisphenol A (TBBPA)

圖3 反應前后MWCNTs的掃描電鏡(SEM)圖Fig. 3 Scan electron microscope (SEM) images of MWCNTs and modified MWCNTs

Chlorophyll a = 11.93 E664- 1.93 E647

Chlorophyll b = 20.36E667- 5.50 E664

其中Chlorophyll a表示葉綠素a的含量；Chlorophyll b 表示葉綠素b的含量。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 反應前后MWCNTs的理化性質(zhì)改變

在前期的研究工作中，我們已經(jīng)證明HRP催化TBBPA反應中產(chǎn)生的自由基能夠攻擊并修飾MWCNTs(稱為modified MWCNTs)[21]，如圖2所示。修飾后的MWCNs的水和動力學直徑在1 h內(nèi)基本維持在～200 nm，而原始的MWCNTs的水和動力學直徑在1 h內(nèi)從～1 200 nm 急劇增加到3 000 nm。此外，原始的MWCNTs在24 h幾乎全部團聚并沉積到容器底部，而modified MWCNTs可以保持長時間的穩(wěn)定，在360 h內(nèi)僅沉降～30%[21]。將原始的MWCNTs和modified MWCNTs進行掃描電鏡表征，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，與原始的MWCNTs相比，modified MWCNTs長度變短。

2.2 MWCNTs/modified MWCNTs對大型蚤的急性毒性

大型蚤暴露于不同濃度的MWCNTs和modified MWCNTs后，活動都明顯受到抑制，甚至會出現(xiàn)死亡的情況。MWCNTs和modified MWCNTs對大型蚤的急性毒性效應見圖4，實驗結(jié)果表明：1.0～10 mg·L-1的暴露濃度下，MWCNTs和modified MWCNTs都會對大型蚤的活動造成明顯的抑制作用，隨著暴露濃度的增加，大型蚤的抑制率升高。從圖4中可以看出大型蚤抑制率與暴露濃度存在明顯的劑量-效應關系。與原始的MWCNTs相比，modified MWCNTs的毒性明顯降低，例如在10 mg·L-1的暴露劑量下，

MWCNTs對大型蚤的抑制率高達65%，而modified MWCNTs引起的抑制率僅為23%。

對暴露48 h后的大型蚤進行光學顯微鏡觀察，結(jié)果如圖5。從圖中可以明顯看出，暴露于MWCNTs和modified MWCNTs的大型蚤腸道富集了大量的碳納米管。但是，與暴露于modified MWCNTs的大型蚤相比，暴露于MWCNTs的大型蚤的外殼、觸角以及綱毛等部位有大量團聚的碳納米管。因此我們推斷原始MWCNTs和modified MWCNTs引起的大型蚤急性毒性的差異主要是原始的MWCNTs在水體中不穩(wěn)定，容易發(fā)生團聚現(xiàn)象，當與大型蚤同時存在時，能夠大量聚集在大型蚤的外殼、觸角以及綱毛等部位，嚴重阻礙了大型蚤的活動，甚至引起死亡現(xiàn)象。Zhu等[24]也得到了類似的結(jié)論：碳納米材料在較高濃度下會團聚在大型蚤體表周圍，抑制其活動。而modified MWCNTs在可以較長時間的均勻的分散在水體中，雖然大型蚤體表可以吸附少量的modified MWCNTs，但是仍然沒有形成較為明顯的團聚現(xiàn)象(圖4)，因此對大型蚤的活動幾乎不會產(chǎn)生影響。但是從抑制率上來看，卻有7.5%～15%的大型蚤受到抑制，說明該毒性效應主要是由大型蚤體內(nèi)聚集的modified MWCNTs所引起的。其原因可能是大量的碳納米管存在與大型蚤的腸道內(nèi)能夠?qū)е缕淠c道細胞的損傷，從而引起大型蚤的死亡[25]。當modified MWCNTs的暴露濃度增加到10 mg·L-1后，就能夠在大型蚤體表看到少量吸附的modified MWCNTs，并且大型蚤的抑制率從15%增加到23%，說明當暴露濃度增大時，體表吸附逐漸成為抑制大型蚤活動的主要因素。

圖4 不同MWCNTs和modified MWCNTs濃度下 大型蚤的抑制率(對照組抑制率為0)Fig. 4 Inhibition rate of Daphnia magna at different exposure concentration of MWCNTs and modified MWCNTs (The inhibition rate in control is 0)

圖5 暴露于不同處理組(對照、10 mg·L-1MWCNTs和10 mg·L-1modified MWCNTs)下大型蚤的光學顯微鏡觀察結(jié)果Fig. 5 Light microscope pictures of Daphnia magna exposed to artificial freshwater (control), MWCNTs and modified MWCNTs (The concentrations of MWCNTs and modified MWCNTs were 10 mg·L-1)

2.3 MWCNTs/modified MWCNTs對斜生柵藻生物量的影響

暴露96 h后，不同濃度的MWCNTs和modified MWCNTs對斜生柵藻細胞密度的影響見圖6。實驗結(jié)果表明，在1.0～25.0 mg·L-1的暴露濃度下，兩者都會對斜生柵藻的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用。低濃度暴露下(0.1 mg·L-1)，處理組中S. obliquus的生長與對照組相比，沒有顯著差異(P>0.05)。隨著暴露濃度的增加，抑制作用會越來越明顯，存在顯著的劑量-效應關系。對比反應前后碳納米管對斜生柵藻生長的影響，可以發(fā)現(xiàn)相比于MWCNTs暴露組，modified MWCNTs對斜生柵藻生長的抑制作用明顯減弱。例如在20 mg·L-1的暴露劑量下，暴露于MWCNTs和modified MWCNTs的斜生柵藻細胞的密度分別為16×105個·mL-1和20×105個·mL-1。這

主要是由于斜生柵藻細胞的生長和繁殖需要光照，而由于MWCNTs在水體中不穩(wěn)定，容易發(fā)生團聚，因此形成的團聚體很容易將藻體包裹住，從而使藻細胞無法接觸到光照，從而抑制其生長和繁殖。楊曉靜等[26]報道了納米二氧化鈦和單壁碳納米管對普通小球藻生長抑制的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與納米二氧化鈦相比，單壁碳納米管能夠發(fā)生凝聚并吸附大量的小球藻細胞，因此嚴重抑制了小球藻的正常生長。modified MWCNTs能夠均勻的分散在水中，不會形成團聚體，因而對斜生柵藻細胞的生長和繁殖的影響明顯弱于原始的MWCNTs。

2.4 培養(yǎng)96 h后MWCNTs/modified MWCNTs對斜生柵藻細胞色素含量的影響

暴露96 h后，不同濃度MWCNTs和modified MWCNTs對斜生柵藻的葉綠素a和b的影響如圖7所示。從圖中可以看出，各暴露組葉綠素a和b均低于對照組(P<0.05)，隨著暴露濃度的增加葉綠素a和b的含量呈下降趨勢。但是無論對葉綠素a還是葉綠素b而言，modified MWCNTs的影響都要弱于MWCNTs的影響。

圖6 不同MWCNTs和modified MWCNTs濃度 下斜生柵藻細胞密度Fig. 6 The cell density of S. obliquus exposed to different concentrations of MWCNTs and modified MWCNTs

圖7 培養(yǎng)96 h后不同MWCNTs和modified MWCNTs濃度對斜生柵藻光和色素含量的影響Fig. 7 Effect of different concentrations of MWCNTs and modified MWCNTs on the photosynthetic pigment content of Scenedesmus obliquus after 96 h exposure

光合色素是客觀反映植物利用光照能力的一類重要指標，能夠作為判斷植物光合生理能力、反映環(huán)境脅迫狀況的依據(jù)，其含量的變化能夠較好地反映生物各階段生長發(fā)育正常與否[27]。根據(jù)以上結(jié)果可以看出，無論是原始的MWCNTs還是modified MWCNTs，都能夠影響到斜生柵藻細胞的正常生長，從而使得葉綠素a和葉綠素b的含量下降。但是與modified MWCNTs相比，原始的MWCNTs容易包裹住斜生柵藻細胞，對其攝取光照能力的影響較大，所以對其光合生理能力較大，從而葉綠素a和b的含量較低。此外，由于光合器官是植物細胞內(nèi)活性氧的主要來源之一，而光合色素極易受到活性氧的攻擊[28]，因此仍需進一步探索MWCNTs的暴露引起細胞內(nèi)活性氧含量的變化。

目前關于碳納米管對水生生物毒性的研究較多，但可能并未考慮到自然過程所引起的碳納米管自身物理化學性質(zhì)的變化以及對生物毒性的變化。我們的實驗結(jié)果表明辣根過氧化物酶催化去除四溴雙酚A的反應能夠改變多壁碳納米管(MWCNTs)在水環(huán)境中的穩(wěn)定性。并且以大型蚤和斜生柵藻作為水環(huán)境中的兩種典型生物來來進行毒性研究，可以發(fā)現(xiàn)相比于原始的MWCNTs，反應后的MWCNTs的毒性明顯減弱。因此，有必要加強研究碳納米管在自然環(huán)境中物理化學性質(zhì)的改變以正確評價其潛在的環(huán)境風險。

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◆

TheToxicEffectofMultiwallCarbonNanotubesModifiedbythePeroxidase-MediatedTetrabromobisphenolAReactiononDaphniamagnaandScenedesmusobliquus

Lu Kun, Dong Shipeng, Gao Shixiang, Mao Liang*

State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210046, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170110001

2017-01-10錄用日期2017-03-10

1673-5897(2017)3-597-07

X171.5

A

毛亮 (1984—)，男，環(huán)境科學與工程專業(yè)博士，副教授，主要研究方向為酶催化去除水中新興污染物的行為與機制。

江蘇省自然科學基金(BK2011576)

盧坤(1989-)，男，博士研究生，研究方向為碳納米材料的環(huán)境風險，E-mail: kunluay@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: lmao@nju.edu.cn

盧坤, 董仕鵬, 高士祥, 等. 酶催化降解四溴雙酚A反應引起的碳納米管急性毒性變化[J]. 生態(tài)毒理學報，2017, 12(3): 597-603

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