黃 敏 吳傳中 郝傳錚 沈 芳 朱立成

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科，江蘇 南通 226001)

柚皮素對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力及細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響

黃 敏 吳傳中1郝傳錚 沈 芳 朱立成2

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科，江蘇 南通 226001)

目的探討柚皮素對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力及細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表達(dá)的影響。方法以人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620為研究對(duì)象，分別用0、10、20、40、60、80、120 μg/ml的柚皮素作用于SW620細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力并計(jì)算半數(shù)抑制濃度。0、50 μg/ml的柚皮素作用于SW620細(xì)胞48 h后，Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1(Hes1)、Notch神經(jīng)同源蛋白1前體(Notch1)表達(dá)水平。結(jié)果10、20、40、60、80、120 μg/ml的柚皮素作用后的細(xì)胞存活率均明顯低于0 μg/ml柚皮素作用組(P<0.01)。計(jì)算半數(shù)抑制濃度為 (51.76±1.48)μg/ml。50 μg/ml柚皮素作用后的侵襲細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、Hes1、Notch1水平均明顯低于0 μg/ml柚皮素作用組(P<0.01)。結(jié)論柚皮素能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲能力，作用機(jī)制可能與Notch1信號(hào)通路有關(guān)。

結(jié)直腸癌；柚皮素；侵襲；增殖

結(jié)直腸癌是一種發(fā)生于消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，具有發(fā)病隱匿、發(fā)展速度快、惡性程度高等特點(diǎn)，其中男性的發(fā)病率高于女性〔1〕。常見的治療結(jié)直腸癌的方法為手術(shù)治療、放療及化療，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求。柚皮素是一種提取自柑橘類水果中的化合物，具有抗腫瘤作用〔2〕。有研究表明，柚皮素對(duì)胃癌、肝癌、鼻咽癌等癌癥均具有抑制作用〔3〕。用不同濃度的柚皮素作用于鼻咽癌和胃癌細(xì)胞，細(xì)胞的增殖能力均顯著下降〔4〕。本文旨在明確柚皮素對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖侵襲能力的作用。

1 材料與方法

1.1材料 細(xì)胞：人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620購于上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司。主要儀器及試劑：基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2單克隆抗體、MMP-9單克隆抗體、發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1(Hes1)單克隆抗體、Notch神經(jīng)同源蛋白1前體(Notch1)單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體均購于美國CTS；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)購于美國Sigma；柚皮素購自上海紫銘試劑廠；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白提取試劑盒均購自碧云天生物試劑研究所；HBS-1096C Pro 酶標(biāo)分析儀購自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 取出保存在液氮罐中的SW620細(xì)胞，迅速放到37℃的水浴鍋中，觀察細(xì)胞完全融化后，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，在室溫下1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞密度約為80%時(shí)，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，按照1∶2比例接種于細(xì)胞瓶中培養(yǎng)。

1.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)直腸癌細(xì)胞，消化后，以2×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，在細(xì)胞中加入不同濃度的柚皮素，使其終濃度為0、10、20、40、60、80、120 μg/ml，同時(shí)設(shè)置空白組，空白組中不加入細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入 MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，在37℃孵育4 h，棄上清液，每孔中加150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，在室溫下?lián)u床上緩慢震蕩6 min，觀察結(jié)晶物溶解后，放置于酶標(biāo)儀中，在波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)定并記錄各組的吸光度OD，以0 μg/ml柚皮素作用組為對(duì)照，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(柚皮素作用組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)。

1.4Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲 在24孔Transwell小室中加入基質(zhì)膠，每孔加入30 μl，放置于37℃孵育1 h。侵襲實(shí)驗(yàn)前分別用0、50 μg/ml柚皮素作用于結(jié)直腸癌細(xì)胞48 h，胰蛋白酶消化后，用不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞接種到Transwell小室的上室，在小室的下室加入含10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液30 μl，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。棉簽擦掉上室的細(xì)胞和基質(zhì)膠，用甲醇固定膜1 h后，加入龍膽紫染色1 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量。

1.5Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、Hes1、Notch1表達(dá)水平 用0、50 μg/ml的柚皮素作用于結(jié)直腸癌細(xì)胞48 h，按照細(xì)胞蛋白提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)提取的蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按照4∶1的比例混合后，放在100℃煮沸5 min。每組吸取30 μl加入到聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中，80 V電壓電泳30 min后，調(diào)整電壓為120 V至電泳結(jié)束。取出蛋白凝膠，在電壓100 V，4℃轉(zhuǎn)膜2 h至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉在37℃封閉2 h，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌3次，每次5 min，加入一抗(600倍稀釋，4℃孵育過夜)、二抗(1 000倍稀釋，37℃孵育2 h)反應(yīng)后，滴加顯色液，以GAPDH為內(nèi)參，分析目的蛋白表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果 10、20、40、60、80、120 μg/ml的柚皮素作用后的細(xì)胞存活率均明顯低于0 μg/ml(P<0.01)。見圖1。計(jì)算半數(shù)抑制濃度為(51.76±1.48)μg/ml。后期選用50 μg/ml的柚皮素作用于結(jié)直腸癌細(xì)胞。

2.2細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)結(jié)果 50 μg/ml的柚皮素作用后的結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲數(shù)目及MMP-9、MMP-2水平均明顯低于0 μg/ml的柚皮素作用組(P<0.01)。見圖2。

2.3細(xì)胞中Hes1、Notch1表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果 50 μg/ml的柚皮素作用后的細(xì)胞中Hes1、Notch1表達(dá)水平均明顯低于0 μg/ml的柚皮素作用組(P<0.01)。見圖3。

圖1 柚皮素對(duì)細(xì)胞增殖的影響

A：侵襲細(xì)胞數(shù)；B：Western印跡結(jié)果圖；C:蛋白相對(duì)表達(dá)量；與0 μg/ml組比較：1)P<0.01,下圖同圖2 柚皮素對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

A：Western印跡結(jié)果圖；B：蛋白相對(duì)表達(dá)量圖3 柚皮素對(duì)細(xì)胞中Hes1、Notch1表達(dá)影響結(jié)果

3 討 論

結(jié)直腸癌的發(fā)病率在全部惡性腫瘤中位居第3位，死亡率位居第5位〔5〕。職業(yè)、飲食習(xí)慣、遺傳等多種因素均可導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生。目前治療結(jié)直腸的方法主要為手術(shù)治療，但由于結(jié)直腸癌具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，尋找新的治療結(jié)直腸的方法是目前研究的重點(diǎn)。柚皮素具有抗菌、消炎、抗氧化、抗癌、降血脂、利膽等多種生物學(xué)作用〔6〕。柚皮素是一種提取自柑橘類水果中的二氫黃酮類化合物，具有價(jià)廉、取材方便、安全等特點(diǎn)〔7〕。柚皮素的抗腫瘤作用已經(jīng)在多種癌癥中得以證實(shí)。研究表明，柚皮素能夠呈劑量依賴型的抑制胃癌細(xì)胞增殖〔8〕。癌細(xì)胞侵襲是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，受到一系列細(xì)胞因子的共同作用。MMPs是目前研究最多的與細(xì)胞侵襲有關(guān)的蛋白家族。MMP-2、MMP-9是MMP家族的成員。有研究表明，MMP-2、MMP-9在宮頸癌、胃癌、食管癌、膠質(zhì)瘤等組織中異常激活〔9〕。柚皮素能夠通過降低MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平影響胃癌細(xì)胞的侵襲能力〔8〕。本研究結(jié)果提示，柚皮素能夠通過作用于MMP-2、MMP-9影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力。

Notch1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與生命機(jī)體的胚胎發(fā)育、器官形成等過程，在癌癥、糖尿病腎病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病形成過程中也有重要作用〔10〕。有研究表明，抑制Notch1信號(hào)通路能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，反之，激活Notch1信號(hào)通路能夠促進(jìn)增殖〔11〕。本研究提示，柚皮素可能作用于Notch1信號(hào)通路影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖侵襲能力。

1van Cutsem E,Lenz HJ,K?hne CH,etal.Fluorouracil,leucovorin,and irinotecan plus cetuximab treatment and RAS mutations in colorectal cancer〔J〕.J Clin Oncol,2015;33(7):692-700.

2Assini JM,Mulvihill EE,Burke AC,etal.Naringenin prevents obesity,hepatic steatosis,and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21〔J〕.Endocrinology,2015;156(6):2087-102.

3Kocyigit A,Koyuncu I,Taskin A,etal.Antigenotoxic and antioxidant potentials of newly derivatized compound naringenin-oxime relative to naringenin on human mononuclear cells〔J〕.Drug Chem Toxicol,2016;39(1):66-73.

4Koh RY,Sim YC,Toh HJ,etal.Cytotoxic and apoptogenic effects of Strobilanthes crispa Blume extracts on nasopharyngeal cancer cells〔J〕.Mol Med Rep,2015;12(4):6293-9.

5王 燕,趙月霞.PKC-a,K-Ras 蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2015;35(6):1499-500.

6季 鵬,趙文明,于 桐.柚皮素的最新研究進(jìn)展〔J〕.中國新藥雜志,2015;24(12):1382-6.

7Al-Rejaie SS,Aleisa AM,Abuohashish HM,etal.Naringenin neutralises oxidative stress and nerve growth factor discrepancy in experimental diabetic neuropathy〔J〕.Neurol Res,2015;37(10):924-33.

8Zhang H,Zhong X,Zhang X,etal.Enhanced anticancer effect of ABT-737 in combination with naringenin on gastric cancer cells〔J〕.Exp Ther Med,2016;11(2):669-73.

9Desmeules P,Trudel D,Turcotte S,etal.Prognostic significance of TIMP-2,MMP-2,and MMP-9 on high-grade serous ovarian carcinoma using digital image analysis〔J〕.Hum Pathol,2015;46(5):739-45.

10Baumgart A,Mazur PK,Anton M,etal.Opposing role of Notch1 and Notch2 in a KrasG12D-driven murine non-small cell lung cancer model〔J〕.Oncogene,2015;34(5):578-88.

11Alniaimi AN,Demorest-Hayes K,Alexander VM,etal.Increased Notch1 expression is associated with poor overall survival in patients with ovarian cancer〔J〕.Int J Gynecol Cancer,2015;25(2):208-13.

〔2017-03-05修回〕

(編輯 袁左鳴)

R735.3

A

1005-9202(2017)19-4750-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.025

南通市科技局科研基金資助項(xiàng)目(No.MS22015119)

1 南通市第三人民醫(yī)院老年科 2 南通市第三人民醫(yī)院呼吸科

黃 敏(1983-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤內(nèi)科研究。