陳 倩，陳蔭楠,2，陳東海，林海虹，石賢愛(ài),3,*

基于單鏈抗體的呋喃唑酮 酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立

陳 倩1，陳蔭楠1,2，陳東海1，林海虹1，石賢愛(ài)1,3,*

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；2.泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建 泉州 362000；3.福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350108）

目的：為快速檢測(cè)呋喃唑酮（furazolidone，F(xiàn)ZD）在動(dòng)物性食品中的殘留量。方法：基于單鏈抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法建立了FZD檢測(cè)方法。結(jié)果：最佳抗原工作質(zhì)量濃度為2 μg/mL，最佳抗體稀釋倍數(shù)為1∶500，一抗最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min，二抗最佳反應(yīng)時(shí)間為45 min，四甲基聯(lián)苯胺最佳顯色時(shí)間為20 min。FZD檢測(cè)試劑盒在10～100 ng/mL范圍具有較好的線性關(guān)系，IC50值為13.01 ng/mL，檢出限為1.28 ng/mL，回收率為73.38%～84.52%。結(jié)論：與抗FZD單克隆抗體相比，所建立的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)范圍更廣，且具有很高的靈敏度以及很好的特異性和穩(wěn)定性。

呋喃唑酮；單鏈抗體；酶聯(lián)免疫檢測(cè)

藥物殘留一直是影響食品安全的問(wèn)題之一。硝基呋喃類藥物是一種人工合成的廣譜抗菌藥物[1-2]，因具有良好的抗球蟲及抗菌作用[3]，曾被廣泛應(yīng)用于家禽、水產(chǎn)等動(dòng)物傳染病的預(yù)防與治療[4-5]。呋喃唑酮（furazolidone，F(xiàn)ZD）是硝基呋喃類藥物的一種，由于其具有嚴(yán)重的致癌、致突變等毒副作用[6]，我國(guó)在2002年將其列為在動(dòng)物飼養(yǎng)中禁止使用的藥物，規(guī)定在動(dòng)物性食品中不得檢出[7-8]。

目前，用于檢測(cè)FZD在動(dòng)物性食品中殘留量的方法主要有分光光度法、高效液相色譜法[9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-11]、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）[12-13]、熒光免疫法等。傳統(tǒng)的儀器法雖然能進(jìn)行精確的定量檢測(cè)，但成本高，前處理繁瑣、操作復(fù)雜，無(wú)法滿足快速檢測(cè)大批量樣品的要求[14]?；诳乖贵w反應(yīng)的ELISA等快速免疫分析方法因其操作簡(jiǎn)單、成本低和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[15]，成為快速檢測(cè)農(nóng)獸藥殘留相關(guān)研究的熱點(diǎn)。如Zhu Huaping等[16]通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA來(lái)檢測(cè)FZD及其代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ），檢測(cè)限為2.0 mg/L和2.5 mg/L。宋娟等[17]建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法來(lái)測(cè)定食品中呋喃它酮代謝物的含量，半抑制濃度（the half maximal inhibitory concentration，IC50）值為1.86 ng/mL，樣品加標(biāo)回收率為75.6%～112.2%。石賢愛(ài)等[18]在抗3-（4-羧基苯亞甲基）-氨基-2-惡唑烷酮（3-{[(4-carboxyphenyl)methylene]-amino}-2-oxazolidinone，CPAOZ）和抗AOZ的單克隆抗體的基礎(chǔ)上，分別建立了ELISA檢測(cè)試劑盒。其中CPAOZ檢測(cè)試劑盒在1.0～100.0 ng/mL范圍具有較好的線性，IC50值為14.6 ng/mL，檢測(cè)限為6.56 ng/mL；AOZ檢測(cè)試劑盒在0.5～12.5 ng/mL范圍具有良好線性，IC50值為3.9 ng/mL，檢測(cè)限為0.45 ng/mL。陳蔭楠等[19]建立了抗FZD單克隆抗體的ELISA檢測(cè)方法，其檢測(cè)范圍為10～500 ng/mL，IC50值為0.06 μg/mL，檢出限為6.92 ng/mL。

然而，使用該方法的前提是需要獲得相應(yīng)的抗體，其制備主要采用免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體血清或雜交瘤技術(shù)獲得單克隆抗體。但是，多克隆抗體其免疫球蛋白類別及亞類不均一，特異性較差，無(wú)法實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的大批量生產(chǎn)[4]。而單克隆抗體雖然具有組分單一、靈敏度高、特異性強(qiáng)等明顯優(yōu)勢(shì)[20]，但制備技術(shù)較復(fù)雜，周期長(zhǎng)，應(yīng)用范圍受到局限。單鏈抗體是通過(guò)人工合成的親水性、柔性連接肽（Linker）將抗體重鏈可變區(qū)（variable region of heavy chain，VH）和輕鏈可變區(qū)（variable region of light chain，VL）連接形成重組抗體[21-22]，它不包含抗體恒定區(qū)，但仍能表現(xiàn)出和抗原的結(jié)合活性。相比于完整的單克隆抗體，單鏈抗體具有分子質(zhì)量小[23]，免疫性低，穿透力強(qiáng)的特點(diǎn)[24-25]，使其應(yīng)用范圍更廣，經(jīng)濟(jì)效益更大，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[26-27]。如張倩[28]成功制備了具有良好免疫原性的抗鯽魚IgM單鏈抗體，并建立了間接ELISA檢測(cè)方法，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%，所建立的方法重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好。本實(shí)驗(yàn)建立了基于抗FZD單鏈抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)法，并將其與基于單克隆抗體的相關(guān)方法進(jìn)行比較，從而為實(shí)現(xiàn)FZD的低成本、可重復(fù)的免疫快速檢測(cè)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FZD單鏈抗體、呋喃唑酮雞卵清白蛋白偶聯(lián)物（furazolidone coupled with ovalbumin，F(xiàn)ZD-OVA）本實(shí)驗(yàn)室制備保存（單鏈抗體制備方法同文獻(xiàn)[29]）；FZD、呋喃它酮（furaltadone，F(xiàn)TD）、呋喃妥因（nitrofurantion，NFT）、呋喃西林（nitrofurazone，NFZ）、氨基脲（semicarbazide，SEM）、AOZ 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；HRP標(biāo)記的抗His-tag抗體英國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG（H+L） 美國(guó)Thermo公司；四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB） 北京天根公司；魚飼料 福建天馬公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SH-1000全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 日本Corona公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱、DHK-501A超級(jí)恒溫水槽 上海精宏公司；XH-C旋渦混合器 常州邁科諾儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 可溶性ScFv抗體的親和力分析

通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法分析純化后的單鏈抗體的親和力。1）用10 μg/mL FZD-OVA包被酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜；傾去包被液，含0.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline with 0.05% Tween-20，PBST）洗滌3 次，5 min/次；5%的脫脂奶封閉過(guò)夜，洗滌。2）加一抗：將標(biāo)準(zhǔn)品溶液倍比稀釋后與經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）稀釋的ScFv抗體等體積混合，37 ℃孵育2 h后加板，100 μL/每孔，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照組，37 ℃孵育2 h；傾去混合液，洗滌3 次；3）加二抗：每孔加入HRP標(biāo)記的抗His-tag抗體（1∶5 000）100 μL，37 ℃孵育1 h，洗滌方法同上。4）顯色：每孔加入100 μL TMB，37 ℃避光反應(yīng)30 min。每孔加入100 μL 2 mol/L H2SO4溶液，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處吸光度（A450nm）。5）結(jié)果判定：結(jié)合率為縱坐標(biāo)，以FZD的質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制競(jìng)爭(zhēng)曲線，以A450nm值判斷抗FZD單鏈抗體與FZD的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)情況，判斷單鏈抗體的特異性。以抗FZD特異性抗體對(duì)FZD的競(jìng)爭(zhēng)抑制率為縱坐標(biāo)，以FZD質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)曲線上計(jì)算出抑制率為50%時(shí)混合液中FZD的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度作為競(jìng)爭(zhēng)抑制率IC50。結(jié)合率、抑制率按公式（1）、（2）計(jì)算：

式中：A為加入不同質(zhì)量濃度的底物FZD的吸光度（A450nm）；A0為不加底物FZD的吸光度（A450nm）；A空白為不加底物FZD、不加抗血清的吸光度（A450nm）。

抑制率/%=100%-結(jié)合率 （2）

1.3.2 ScFv抗體的交叉反應(yīng)性分析

分別將FTD、NFT、NFZ、SEM以及AOZ這5 種結(jié)構(gòu)類似物標(biāo)準(zhǔn)液倍比稀釋，每個(gè)質(zhì)量濃度取50 μL與等體積的ScFv抗體于37 ℃反應(yīng)2 h，其余步驟同間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA。最后以FTD、NFT、NFZ、SEM和AOZ的IC50與FZD的IC50百分比可得該單鏈抗體與各結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率按公式（3）計(jì)算：

式中：IC50,FZD為當(dāng)FZD對(duì)抗血清抑制率為50%時(shí)，F(xiàn)ZD的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度/（ng/mL）；IC50,結(jié)構(gòu)類似物為當(dāng)FZD結(jié)構(gòu)類似物對(duì)抗血清抑制率達(dá)到50%時(shí)，F(xiàn)ZD結(jié)構(gòu)類似物的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度/（ng/mL）。

1.3.3 抗FZD酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立

1.3.3.1 最佳包被抗原及單鏈抗體工作質(zhì)量濃度的確定

采用方陣實(shí)驗(yàn)法，將重氮法制備的FZD-OVA作為包被抗原和抗FZD單鏈抗體分別做系列稀釋，抗原質(zhì)量濃度分別稀釋為10、5、2、1、0.2 μg/mL，按100 μL/孔包被在酶標(biāo)板中，4 ℃過(guò)夜；用脫脂奶37 ℃封閉3 h；將單鏈抗體作100、200、500、1 000、2 000倍稀釋后加入酶標(biāo)板中。其余步驟同1.3.1節(jié)。根據(jù)檢測(cè)得到的A值，確定實(shí)驗(yàn)最佳的包被抗原和單鏈抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

1.3.3.2 一抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定

包被酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜，洗滌3 次后加脫脂奶封閉3 h。洗滌后，分別加入高濃度抗體（稀釋5倍）、低濃度抗體（稀釋20 倍）、陰性抗體（空質(zhì)粒表達(dá)的蛋白）、空白（PBS）（均設(shè)3 個(gè)平行）。設(shè)定一抗反應(yīng)時(shí)間分別為30、60、120 min。其余步驟同間接ELISA方法。根據(jù)讀取的A450nm，比較各個(gè)時(shí)間段對(duì)結(jié)果的影響，確定一抗的最佳作用時(shí)間。

1.3.3.3 二抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定

包被，封閉，選擇一抗的最佳反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行反應(yīng)，一抗的梯度與1.3.3.2節(jié)中相同。分別設(shè)定二抗的反應(yīng)時(shí)間為30、45、60 min。其余步驟同間接ELISA方法。根據(jù)讀取的A450nm，比較各個(gè)時(shí)間段對(duì)結(jié)果的影響，確定二抗最佳時(shí)間。

1.3.3.4 TMB顯色時(shí)間的確定

在最優(yōu)的抗原抗體工作質(zhì)量濃度、一抗反應(yīng)時(shí)間、二抗反應(yīng)時(shí)間條件下，分別設(shè)定顯色時(shí)間為加入TMB后37 ℃反應(yīng)5、10、20、30 min。

1.3.3.5 檢測(cè)方法的檢出限分析

從包被的10 塊板中隨機(jī)選擇10 個(gè)孔，加入50 μL零標(biāo)準(zhǔn)品和50 μL稀釋到工作質(zhì)量濃度的抗FZD單鏈抗體，應(yīng)用建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行測(cè)定。求得10 個(gè)孔的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)差，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)3倍標(biāo)準(zhǔn)差/A0的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度即為此方法的檢出限，標(biāo)準(zhǔn)差按公式（4）、（5）計(jì)算：

式中：Ai為第i孔底物FZD的吸光度（A450nm）；A0為i 個(gè)孔吸光度（A450nm）的平均值。

1.3.3.6 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的精密度測(cè)試

取3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的FZD標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析，每個(gè)質(zhì)量濃度每天做1 次分析，綜合5 次測(cè)定的抑制率，求出變異系數(shù)。

1.3.3.7 樣品加標(biāo)回收率

高血壓（hypertension）是體循環(huán)中的動(dòng)脈血壓升高為主要特點(diǎn)，（收縮壓≥140毫米汞柱，舒張壓≥90毫米汞柱），可以出現(xiàn)靶器官的損害，如心、腦、腎等器官的功能出現(xiàn)器質(zhì)性損害的臨床綜合征[1-2]。高血壓患者大多數(shù)與自身體質(zhì)密切相關(guān)，體質(zhì)學(xué)說(shuō)屬于中醫(yī)范疇，頁(yè)數(shù)與辨證論治理論，先天性缺陷和體質(zhì)與后天吸收氣血精津液共同組成人的本源，直接影響人的疾病的預(yù)后情況[3-5]。所以必須根據(jù)患者自身?xiàng)l件和體質(zhì)采取特異性中醫(yī)護(hù)理方式對(duì)患者疾病的控制有著不可忽視的作用。本研究以辨體論治作為護(hù)理的基礎(chǔ)和前提，觀察體質(zhì)護(hù)理對(duì)高血壓病患者護(hù)理效果的評(píng)估，現(xiàn)報(bào)道如下。

將空白魚飼料樣本研磨粉碎，過(guò)篩備用。取適量樣品于50 mL離心管中，按10.0、50.0、100.0 μg/g的添加量分別加入適量的FZD標(biāo)準(zhǔn)品。然后加入甲醇-乙腈（3∶7，V/V）提取液，劇烈振蕩30 min。靜置一段時(shí)間后，離心取上清液進(jìn)行還原（方法同文獻(xiàn)[19]）。待冷卻至室溫后采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。最后，根據(jù)FZD競(jìng)爭(zhēng)抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 ScFv抗體的親和力分析

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，檢測(cè)ScFv抗體的親和力。以FZD-OVA作為檢測(cè)抗原，與游離抗原FZD競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)FZD質(zhì)量濃度在10～100 ng/mL之間時(shí)，抑制率呈較好的線性關(guān)系，以FZD添加質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線后得到線性方程：y=42.24x+2.930 2（R2=0.990 2）。當(dāng)抑制率為50%時(shí)，IC50值為13.01 ng/mL。陳蔭楠等[19]制備的單克隆抗體，其線性范圍為10～500 ng/mL，IC50值為60 ng/mL，與之相比（所采用的計(jì)算方法、樣品種類及樣品前處理方法均一樣），本實(shí)驗(yàn)中所制備的單鏈抗體IC50值較小，靈敏度更高。

2.2 ScFv抗體的交叉反應(yīng)性分析

以FZD-OVA作為包被抗原，將FTD、NFT、NFZ、SEM和AOZ分別倍比稀釋，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)，得出抗FZD單鏈抗體FZD-ScFv與各FZD結(jié)構(gòu)類似物的IC50值，計(jì)算出交叉反應(yīng)率，如表1所示，得出抗FZD單鏈抗體FZD-ScFv對(duì)5 種硝基呋喃抗生素的交叉反應(yīng)率均低于1%，有較好的特異性。但與陳蔭楠等[19]制備的單克隆抗體相比（交叉反應(yīng)率均低于0.01%），特異性稍差。

表1 抗體與FZD結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)性的對(duì)比Table 1 Comparison in the cross-reactivity of antibodies against analoogguueess

2.3 最佳反應(yīng)條件的確定

2.3.1 最佳包被抗原及單鏈抗體工作質(zhì)量濃度的確定

采用方陣滴定法來(lái)確定最佳的包被抗原濃度與抗體稀釋倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)采用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定，得出最佳抗原工作質(zhì)量濃度為2 μg/mL，在此包被質(zhì)量濃度條件下，抗體稀釋倍數(shù)在1∶500時(shí)吸光度（A450nm）在1.0附近，故選擇1∶500作為抗體最佳稀釋倍數(shù)。

2.3.2 一抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確立

用2 μg/mL的FZD-OVA包被酶標(biāo)板，一抗分別為FZD-ScFv稀釋5 倍、FZD-ScFv稀釋20 倍、陰性對(duì)照（空質(zhì)粒表達(dá)的蛋白）、空白（PBS）4 個(gè)梯度。分別在37 ℃反應(yīng)30、60、120 min，二抗孵育1 h，TMB顯色30 min，如圖1所示。

圖1 一抗反應(yīng)時(shí)間的考察Fig. 1 Optimum reaction time for primary antibody

從圖1可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度也不斷升高。令RAbs=（A1-A0）/（A2-A0），其中A1為稀釋5 倍的吸光度，A2為稀釋20 倍的吸光度，A0為陰性的吸光度。陰性空質(zhì)粒表達(dá)的蛋白吸光度也隨時(shí)間增加，30min的吸光度為0.147，120min的吸光度為0.223。30、60、120 min時(shí)，RAbs值分別為1.34、1.52、1.42。RAbs,60min值最大，且空白對(duì)照低，因此，一抗反應(yīng)60 min最佳。

2.3.3 二抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確立

一抗反應(yīng)60 min后，加入二抗37 ℃分別反應(yīng)30、45、60 min，如圖2所示。在這3 個(gè)時(shí)間段中，隨著二抗反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度不斷升高，60 min時(shí)吸光度達(dá)到最高值，但比較RAbs值發(fā)現(xiàn)，RAbs,45min值最大，因此二抗最佳反應(yīng)時(shí)間為45 min。

圖2 二抗反應(yīng)時(shí)間的考察Fig. 2 Optimum reaction time for secondary antibody

2.3.4 TMB顯色時(shí)間的確立

圖3 TMB反應(yīng)時(shí)間的考察Fig. 3 Optimum reaction time for TMB

一抗反應(yīng)60 min，二抗反應(yīng)45 min，分別顯色5、10、20、30 min后，如圖3所示，單鏈抗體稀釋5 倍時(shí)，30 min時(shí)吸光度最高，為1.906。隨著顯色時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度也出現(xiàn)了較大幅度的增加，但顯色20 min和30 min的吸光度差別不大，但RAbs,20min大于RAbs,30min，同時(shí)鑒于該試劑盒是用于快速檢測(cè)的，選擇20 min即可。

2.3.5 檢出限分析

從包被好的酶標(biāo)孔板中隨機(jī)挑選10 孔，按建立好的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA模式做零標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)，求所得10 個(gè)A值的標(biāo)準(zhǔn)差，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)3 倍標(biāo)準(zhǔn)差/A0的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度即為此方法的檢出限。由此得到3 倍標(biāo)準(zhǔn)差/A0位置相應(yīng)的抑制率和檢出限為7.47%和1.28 ng/mL，并與陳蔭楠等[19]制備的抗FZD單克隆抗體的相應(yīng)數(shù)值比較如表2所示。本實(shí)驗(yàn)制備的抗FZD單鏈抗體檢出限更低，檢測(cè)范圍更廣，效果更佳。

表2 檢出限測(cè)試對(duì)比Table 2 Comparison in the detection limit of detection kit among different antibodies

2.3.6 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的精密度結(jié)果

重復(fù)做5 次FZD的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，每次做3 個(gè)質(zhì)量濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度做3 個(gè)平行孔，以平行孔的均值作為每次每個(gè)質(zhì)量濃度條件下的抑制率，對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 精密度測(cè)試結(jié)果Table 3 Test of detection precision of detection kit based on single chain fragment antibody

表4 精密度對(duì)比結(jié)果Table 4 Comparison in detection precision of detection kit among different antibodies

結(jié)合表3、4可以看出，每個(gè)質(zhì)量濃度條件下的變異系數(shù)均小于10%，平均誤差為3.83%。這比陳蔭楠等[19]建立的檢測(cè)方法的平均誤差小，重復(fù)性更好。

2.3.7 樣品加標(biāo)回收率的測(cè)定結(jié)果

往不含F(xiàn)ZD的飼料中分別加入FZD使其添加量為10.0、50.0、100.0 μg/g，樣品經(jīng)提取后進(jìn)行ELISA檢測(cè)，每個(gè)添加量重復(fù)檢測(cè)3 次，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)ZD樣品的加標(biāo)回收率為73.38%～84.52%，變異系數(shù)6.81%～9.41%。而陳蔭楠等[19]所制得單克隆抗體的FZD樣品加標(biāo)回收率為76.84%～88.31%，變異系數(shù)9.36%～15.79%，二者相比樣品加標(biāo)回收率差別不大，但本實(shí)驗(yàn)所制得FZD單鏈抗體變異系數(shù)更小。

表5 FZD加標(biāo)回收率結(jié)果Table 5 Recovery rates of FZD from samples of detection kit based on single chain fragment antibody

表6 加標(biāo)回收率對(duì)比結(jié)果Table 6 Comparison in recovery rate of detection kits among different antibodies

3 結(jié) 論

用純化后獲得的單鏈抗體建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的檢測(cè)范圍為10～100 ng/mL，IC50值為13.01 ng/mL。與FZD結(jié)構(gòu)類似物（FTD、NFT、NFZ、SEM、AOZ）的交叉反應(yīng)率均小于1%，說(shuō)明單鏈抗體的靈敏度和特異性均很高。

建立了基于抗FZD單鏈抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，最佳抗原工作質(zhì)量濃度為2 μg/mL，最佳抗體稀釋倍數(shù)為1∶500。在一抗反應(yīng)60 min、二抗反應(yīng)45 min、TMB顯色20 min條件下，計(jì)算得到檢出限為1.28 ng/mL。所建立的方法重現(xiàn)性較好，平均誤差為3.83%，加標(biāo)回收率為73.38%～84.52%，變異系數(shù)為6.81%～9.41%。

綜上所述，相比單克隆抗體，本實(shí)驗(yàn)制備的單鏈抗體IC50值和檢出限較小，平均誤差較小，變異系數(shù)較小，樣品加標(biāo)回收率差別不大，雖然交叉反應(yīng)率稍低于單克隆抗體，但足以滿足檢測(cè)的要求，且靈敏度更高，檢測(cè)范圍更廣，穩(wěn)定性較好。

利用基因工程手段制備單鏈抗體免疫原性低，對(duì)人體不會(huì)引起抗異種蛋白反應(yīng)，半衰期短，且分離純化方法簡(jiǎn)單，制備所需時(shí)間短[30-31]，同時(shí)抗體易于改造以用于不同用途。因此，基于單鏈抗體的免疫檢測(cè)方法具有更廣的應(yīng)用范圍和應(yīng)用前景。

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Establishment of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Method for Detecting Furazolidone Based on Single Chain Fragment Antibody

CHEN Qian1, CHEN Yinnan1,2, CHEN Donghai1, LIN Haihong1, SHI Xian’ai1,3,*
(1. College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China;2. Basic Medicine Programme, Quanzhou Medical College, Quanzhou 362000, China;3. Fujian Key Laboratory of Medical Instrument and Pharmaceutical Technology, Fuzhou 350108, China)

Aim∶ This study aimed to develop an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method for detecting the residues of furazolidone (FZD) in animal food. Method∶ The indirect competitive ELISA method based on single chain fragment antibody was established. Result∶ The optimal antigen mass concentration was 2 μg/mL, and the optimal antibody dilution ratio was 1∶500, and the optimal reaction time of primary antibody, the optimal reaction time of secondary antibody and the optimal reaction time of TMB were 60 min, 45 min, and 20 min, respectively. The good linearity was seen in the range of 10-100 ng/mL of FZD, with the IC50value being 13.01 ng/mL, and the lowest detection limit (LOD) being 1.28 ng/mL, and the recovery rates being 73.38%-84.52%. Conclusion∶ Compared with the monoclonal antibody against FZD, the detection kit based on single chain fragment antibody displayed wider detection range, higher sensitivity, better specifi city and detection stability.

furazolidone; single chain fragment antibody; enzyme-linked immunosorbent assay

TS207.3

A

1002-6630（2017）20-0242-06

陳倩, 陳蔭楠, 陳東海, 等. 基于單鏈抗體的呋喃唑酮酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(20): 242-247.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720035. http://www.spkx.net.cn

CHEN Qian, CHEN Yinnan, CHEN Donghai, et al. Establishment of enzyme-linked immunosorbent assay method for detecting furazolidone based on single chain fragment antibody[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 242-247. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720035. http∶//www.spkx.net.cn

2017-01-06

國(guó)家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201205022-3）；福建省科技重大專項(xiàng)（2013NZ0003）；福建省海洋與漁業(yè)廳重點(diǎn)項(xiàng)目（閩海漁合同[2010]2-27號(hào)）

陳倩（1991—），女，碩士，研究方向?yàn)榭贵w研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化。E-mail：121131347@qq.com

*通信作者：石賢愛(ài)（1971—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楦哽`敏度生物檢測(cè)。E-mail：shixa@fzu.edu.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720035