聶文強，吳天祥,2,*，鐘 敏，蘆紅云

真菌灰樹花菌絲體轉錄組測序及分析

聶文強1，吳天祥1,2,*，鐘 敏1，蘆紅云1

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學明德學院，貴州 貴陽 550025）

灰樹花多糖具有抗腫瘤、抗HIV、抗氧化等作 用，為探明灰樹花多糖合成的遺傳基礎，采用Illumina高通量測序技術對灰樹花轉錄組進行測序，獲得74 575 910 個reads，10.4 G數(shù)據(jù)量；將測序數(shù)據(jù)進行de novo拼接后得到18 077 個Unigene。對所得Unigene進行不同數(shù)據(jù)庫比 對，在Nr數(shù)據(jù)庫中有11 651 個Unigene被注釋到，其中灰樹花轉錄組與變色栓菌相似序列最多（18.74%）；有8 332 個Unigene在GO數(shù)據(jù)庫中注釋到，分為細胞組分、分子功能及生物學過程等3 大類59 個分支；與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，共有5 200 個Unigene被注釋，分屬376 條代謝通路。從18 077 個Unigene中共找到1 155 個簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）位點，其中單核苷酸重復最高，六核苷酸重復最少，A/T出現(xiàn)頻率最高。本研究中在KEGG數(shù)據(jù)庫注釋到115 個Unigene與灰樹花多糖合成有關，這些Unigene及其注釋信息為今后深入開展灰樹花多糖代謝途徑及相關功能基因等研究提供了依據(jù)。

灰樹花；菌絲體；轉錄組測序；功能注釋

灰樹花（Grifola frondosa）是一種營養(yǎng)豐富的藥食兩用真菌。多糖是灰樹花的主要活性成分，具有抗腫瘤[1-4]、抗HIV[5]、抗氧化[6-8]、清除自由基[8]、降血糖[9]、促進膠原蛋白合成[10]、提高機體免疫力[11-12]等生物活性。

轉錄組測序是基于Illumina HiSeq等測序平臺，對特定組織或細胞在某個時期轉錄出來的所有mRNA進行測序。近年來，隨著轉錄組測序技術不斷發(fā)展和完善，為研究功能基因、生物學性狀的分子機制提供了全新的方法[13-14]。Yu Guojun等[15]對靈芝菌絲體進行轉錄組測序，獲得了18 892 個Unigene，其中1 389 個Unigene被京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）注釋到，分屬16 類代謝途徑；Huang Yating等[16]對藥用真菌桑黃的菌絲體轉錄組進行測序分析，獲得25 811 個Unigene，并發(fā)現(xiàn)23 個候選基因可能與甾醇的生物合成有關；Yang Fang等[17]對白蟻蘑菇進行轉錄組測序，獲得6 494 個Unigene，并發(fā)現(xiàn)在白蟻蘑菇中許多已知的酶類和三萜皂苷的生物合成有關；Shu Shaohua等[18]對茯苓的菌絲體和菌核進行轉錄組測序，分別獲得40 939 個Unigene和37 220 個Unigene，并發(fā)現(xiàn)在茯苓中萜類化合物的生物合成只能通過甲戊二羥酸（mevalonic acid pathway，MVA）途徑；在草菇[19]、牛樟芝[20]、酵母[21]、紫背天葵[22]等多個物種的研究中都應用了轉錄測序技術。

本課題組前期研究結果表明，在灰樹花液體發(fā)酵體系中添加天麻提取物或其主要成分均可顯著促進灰樹花多糖的合成[23-27]?；谔炻樘崛∥锏却龠M灰樹花多糖合成的機理尚不明確，本研究以真菌灰樹花菌絲體為材料，進行轉錄組測序，并對所有Unigene進行生物信息學分析，探明灰樹花細胞生長過程中的相關基因，為研究天麻提取物促進灰樹花多糖的合成的機理、進一步挖掘功能基因及開發(fā)分子標記提供科學方法的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花菌株（Grifola frondosa，菌種編號：51616）中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心；Total RNA Extractor（Trizol） 生工生物工程（上海）股份有限公司；Qubit2.0 RNA檢測試劑盒、Qubit2.0 DNA檢測試劑盒美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器與設備

BXM-30R立式滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SW-CJ-1D凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；TG2-16G低速離心機 上海安亭科學儀器廠；Qubit2.0熒光計 美國Thermo Fisher公司；微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器 廠有限公司；聚合酶鏈式反應儀美國Bio-Rad公司；電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母膏6 g/L，蛋白胨2 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L；pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨5 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L；pH值自然。

1.3.2 樣品制備

于母種試管中挑取黃豆粒大小菌絲塊接種于斜面中部，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲長滿整個斜面。在培養(yǎng)好的斜面菌種切取蠶豆大小于液體培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝液量為100 mL，置于25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)7d。按10%的接種量，用移液槍量取液體種子于發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝液量為100 mL，置于25 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)12 d，過濾得灰樹花菌絲體。

1.3.3 總RNA的提取

總RNA提取方法按照試劑盒說明書進行。利用Qubit 2.0 RNA試劑盒檢測RNA濃度及瓊脂糖凝膠檢測RNA完整性以及基因組污染情況。檢測合格的RNA用于后續(xù)測序。

1.3.4 轉錄組測序數(shù)據(jù)處理及分析

將測序得到的原始數(shù)據(jù)去除3’端測序接頭序列，去除融合后的reads尾部質量在20以下的堿基，切除reads中含N部分序列并進行污染評估。利用Trinity軟件（版本trinityrnaseq_rr20140717）通過序列之間的Overlap將序列延伸成Contig，再根據(jù)序列的Paired-end信息，將Contig連接成轉錄本序列；對拼接序列去重復，取長度大于200 bp的序列，通過組裝的Component從潛在的可變剪接轉錄本選取組裝最長的轉錄本作為該樣品的Unigene序列，最后將Unigene序列進行簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）分析并與Nr、Nt、SwissProt、TrEMBL、CDD、PFAM、GO（gene ontology）、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫比對，取相似度大于30%且e小于10-5的注釋，獲得Unigene的注釋信息。

2 結果與分析

2.1 Unigene拼接

利用Trinity軟件對測序得到的原始reads數(shù)據(jù)進行拼接，獲得的contig再次組裝得到33 898 個轉錄本，序列信息達54 167 696 bp（51.66 M），平均長度1 597.96 bp，N50（判斷灰樹花菌絲體基因組拼接結果優(yōu)劣的依據(jù)）為2 969 bp，N90為718 bp。所得轉錄本進一步拼接獲得18 077 個Unigene，Unigene總長度為23 615 260 bp，平均組裝長度為1 306.37 bp；最長Unigene為19 899 bp，最短Unigene為201 bp；N50為2 885 bp，N90為445 bp。其中不小于500 bp和不小于1 000 bp分別占總數(shù)的50.33%和36.38%。

圖1 Unigene GC含量分布圖Fig. 1 GC content distribution of Unigene

圖2 Unigene長度分布圖Fig. 2 Length distribution of Unigene

由圖1中Un igene GC含量分布可知，Unigene的GC含量主要分布在40～60 對之間。由圖2可以看出，Unigene主要集中在200～300 bp之間和2 000 bp以上，其中在200～300 bp的最多為5 682 個，占總數(shù)的31.4%；大于2 000 bp為3 889 個，占總數(shù)的21.5%。

2.2 SSR分析

對灰樹花菌絲體轉錄組進行SSR位點分析，篩選標準為：1～6 個核苷酸序列重復次數(shù)分別為大于等于10、6、5、5、5和5，兩個SSR間最大間隔長度100 bp。從18 077 個Unigene中共找到1 155個SSR位點，占總Unigene的6.39%，其中單核苷酸重復重復最高為780 個，占總重復序列的67.53%，其次是三核苷酸序列，共249 個，占總重復序列的21.56%，最少為五核苷酸序列，只有2 個，僅占0.17%（表1）。在檢出的SSR位點中，出現(xiàn)頻率最高的是A/T（721 個），其次是C/G（59 個）、AGC/CTG（53 個）、ACG/CGT（51 個）。上述SSR特征分析，有助于開展灰樹花及其同屬物種的基因組差異分析、通用性標記開發(fā)和遺傳圖譜構建的研究。

表1 灰樹花菌絲體SSR不同重復基序分布Table 1 Distribution of different repeat motifs in SSR analysis

2.3 Unigene的功能注釋

表2 Unigene 的功能注釋在各數(shù)據(jù)庫分布情況Table 2 Database distribution of Unigene functional annotation

通過BLAST程序將Unigene序列分別與Nr、Nt、SwissProt、TrEMBL、CDD、PFAM、GO、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫比對。由表2可以看出，18 077 個Unigene全部成功比對，其中12 025 個Unigene至少在一個數(shù)據(jù)庫中被注釋到，占總數(shù)的66.52%；1 766 個Unigene在所有的數(shù)據(jù)庫中都被注釋到，占總數(shù)的9.77%。在Nr和TrEMBL數(shù)據(jù)庫中被注釋到的Unigene最多，分別為11 651和11 507，占總數(shù)的64.45%和63.66%；在數(shù)據(jù)庫Nt中被注釋到的最少為3 643 個，僅占20.15%。

2.3.1 Unigene的Nr數(shù)據(jù)庫比對分析

通過BLAST程序，將 Unigene序列與Nr數(shù)據(jù)庫比對，有11 651 個Unigene與Nr數(shù)據(jù)庫中記錄相同，占總Unigene的64.45%?；覙浠ㄞD錄組測序組裝的Unigene與變色栓菌的相似性最多，為2 184 個，占18.74%；其次是木質素降解菌，比對上的Unigene為1 321 個，占11.34%。值得注意的是，有24.93%的Unigene屬于其他序列，可能包含了灰樹花菌絲體與大多數(shù)物種不同的、自身特有的基因序列（表3）。

2.3.2 Unigene的KOG數(shù)據(jù)庫比對分析

將灰樹花菌絲體轉錄組所有的Unigene與KOG數(shù)據(jù)庫進行比對，有6 461 個Unigene與KOG數(shù)據(jù)庫比對上，占總Unige ne的35.74%。根據(jù)功能劃分，本研究中所獲灰樹花菌絲體轉錄組功能注釋的Unigene可分25 類（圖3）；其中一般功能預測類基最多，有816 個，占12.63%；其次為翻譯后修飾、蛋白質轉換、伴侶和翻譯，核糖體結構和生物合成相關的基因，分別有763 個和723個，占11.81%和11.19%。而與細胞運動有關只有5 個，與核結構有關的只有6 個。

圖3 灰樹花Unigene的KOG分類Fig. 3 KOG functional classifi cation of maitake Unigene

2.3.3 Unigene的GO數(shù)據(jù)庫注釋分析

GO分類是國際標準化分類體系，適用于各個物種，能對基因進行限定和描述。對灰樹花菌絲體Unigene進行GO功能分析，有8 332個Unigene被注釋到，分為生物過程、細胞組成、分子功能3 大類59 個分支（圖4）。統(tǒng)計每一類的基因數(shù)量發(fā)現(xiàn)，在細胞組成類的19 個分支中，涉及本轉錄組的Unigene最多，為26 962 個；生物過程類次之，為26 051 個；分子功能類最少，為11 573 個。其中代謝過程（5 272 個）、細胞過程（5 714 個）、細胞（6 016 個）、細胞器（4 532 個）、細胞組分（6 014 個）、催化活性（4 651 個）及連接（4 742 個）功能組中涉及的Unigene較多，病毒（3 個）、病毒組分（3 個）、通道調節(jié)活性（2 個）、金屬伴侶活性（6 個）、受體調節(jié)活性（1 個）、蛋白標簽（3 個）及轉錄調節(jié)因子活性（7 個）功能組涉及的Unigene較少（表4）。

表4 灰樹花菌絲體轉錄組GO功能分類的Unigene分布TTaabbllee 44 MMaaiittaakkee UUnniiggeennee ddiissttrriibbuuttiioonn iinn ggeennee oonnttoollooggyy

2.3.4 Unigene的KEGG數(shù)據(jù)庫注釋分析

KEGG數(shù)據(jù)庫能夠系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細胞中的代謝途徑以及功能。將灰樹花菌絲體的Unigene注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫進行代謝分類分析，有5 200個Unigene被注釋到，占總Unigene的28.77%。被注釋到的通路有376 條，其中核糖體（400 個）、碳代謝（313 個）、氨基酸生物合成（245 個）通路涉及的Unigene較多（表5）。灰樹花多糖具有抗腫瘤、抗HIV、抗氧化等作用，本研究中在KEGG代謝途徑數(shù)據(jù)庫注釋到115 條Unigene與灰樹花多糖合成有關。這些Unigene及其注釋信息為今后深入開展灰樹花多糖代謝途徑及相關功能基因等研究提供了理論支持。

表5 KEGG注釋Unigene最多的前20 位代謝通路Table 5 Top 20 pathways with the largest number of annotated Unigenes in KEGG

2.4 Unigene的CDS預測

圖4 灰樹花轉錄組CDS長度分布圖Fig. 4 CDS length distribution for digital transcriptome of maitake

獲取Nr數(shù)據(jù)庫最佳比對結果，通過該結果確定Unigene的ORF的讀碼框，然后根據(jù)標準碼子表確定其CDS及編碼氨基酸序列，未比對上的Unigene通過OrfPredict軟件預測其CDS序列。最終得到CDS序列片段18 040 個，其中長度為200 bp最多，為5 522 個；長度為100 bp的次之，為3 198個；長度為1 900 bp的最少，為155 個，序列長度分布見圖4。

3 討論與結論

本研究采用高通量測序技術對灰樹花菌絲體進行轉錄組測序。采用生物信息學軟件對測序結果組裝得到18 077 個Unigene，在所有的Unigene中共檢測到1 155 個SSR位點，并對其進行了特征分析，這為灰樹花及其同屬物種的基因組差異分析、通用性標記開發(fā)和遺傳圖譜構建的研究提供了依據(jù)。

將Unigene與Nr數(shù)據(jù)庫比對，與變色栓菌的相似序列最 多，為2 184 個，在Swissprot數(shù)據(jù)庫中檢測到蛋白同源序列有7 777 條；與KOG數(shù)據(jù)庫比對，注釋到的6 461 個Unigene在真核生物功能系統(tǒng)中分為25 類，其中一般功能預測類最多；利用GO數(shù)據(jù)庫進行功能注釋，可將注釋到的8 332個Unigene分為生物過程、細胞組成、分子功能3 大類59 個分支；KEGG通路注釋，注釋到5 200個Unigene涉及376 條代謝通路，其中有115 個Unigene與灰樹花多糖合成有關，這些數(shù)據(jù)為研究灰樹花多糖合成途徑提供了依據(jù)。

袁衛(wèi)東等[28]2015年采用高通量測序技術對灰樹花子實體進行轉錄組測序，獲得了63 137個Unigene。將Unigene與Nr數(shù)據(jù)庫比對，與變色栓菌的相似序列最多；在GO數(shù)據(jù)庫中注釋到3 大類35 個分支，其中最多的是生物過程分支；有27 472 個Unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫中被注釋到239 條代謝途徑。與上述研究結果相比本實驗建立的灰樹花菌絲體轉錄組數(shù)據(jù)庫，獲得的Unigene相對較少，但Unigene的GO功能分類有生物過程、細胞組成、分子功能3 大類59 個分支，KEGG通路注釋，注釋到376 條代謝通路。

本研究采用高通量測序技術對灰樹花菌絲體進行轉錄組測序，獲得了大量灰樹花菌絲體轉錄組信息，并進行了生物信息學分析，為深入開展灰樹花多糖合成機理、灰樹花分子標記開發(fā)等研究提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。

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Transcriptome Sequencing and Analysis of Grifola frondosa Mycelia

NIE Wenqiang1, WU Tianxiang1,2,*, ZHONG Min1, LU Hongyun1
(1. School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China;2. Mingde College of Guizhou University, Guiyang 550025, China)

The exopolysaccharide of Grifola frondosa possesses anti-tumor, anti-HIV, and anti-oxidant effects. In order to investigate the genet ic basis for polysaccharide synthesis by G. frondosa, the transcriptome of G. frondosa was sequenced by high-throughput sequencing technology. A total of 74 575 910 reads and 10.4 G data were generated, which formed 18 077 Unigenes after de novo splicing. A total of 11 651 Unigenes we re annotated in the Nr database. Among them, G. frondosa transcriptome had the most similar sequence (18.74%) to M. tumefaciens. A total of 8 332 Unigenes were annotated in the GO database, which were divided into 3 major categories∶ molecular composition, molecular function and biological processes, including 59 branches. Compared with the KEGG database, 5 200 Unigenes were annotated which belonged to 376 metabolic pathways. A total of 1 155 simple sequence repeat (SSR) loci were found in 18 077 Unigenes, among which the highest repeat was single nucleotide whereas the repetition of hexanucleotide was the least, and the frequency of A/T was the highest. In this s tudy, 115 unigenes which have been annotated in the database of KEGG were related to the biosynthesis of polysaccharide by G. frondosa. These annotated Unigenes and the information about them can lay the foundation for further studies on polysaccharide metabolism pathways and related functional genes in G. frondosa.

Grifola frondosa; myce lium; transcriptome sequencing; functional annotation

Q939.99

A

1002-6630（2017）20-0006-06

聶文強, 吳天祥, 鐘敏, 等. 真菌灰樹花菌絲體轉錄組測序及分析[J]. 食品科學, 2017, 38(20)∶ 6-11. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720002. http∶//www.spkx.net.cn

NIE Wenqiang, WU Tianxiang, ZHONG Min, et al. T ranscriptome sequencing and analysis of Grifola frondosa mycelia[J].Food Science, 2017, 38(20)∶ 6-11. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720002. http∶//www.spkx.net.cn

2016-10-24

國家自然科學基金地區(qū)科學基金項目（31460537）

聶文強（1993—），男，碩士研究生，研究方向為生物信息學。E-mail：648462055@qq.com

*通信作者：吳天祥（1965—），男，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程和生物轉化。E-mail：txwu@gzu.edu.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720002