張培東

（高密市畜牧局，山東高密 261500）

大腸桿菌的分離及生化鑒定

張培東

（高密市畜牧局，山東高密 261500）

大腸桿菌病是危害世界養(yǎng)雞業(yè)的重要傳染病。大腸桿菌是定居在人和動(dòng)物腸道內(nèi)的正常菌群，正常情況下是不致病的。在特定的條件下，某些血清型的大腸桿菌能夠引起一系列的感染，但是隨著抗生素在各個(gè)領(lǐng)域中的頻繁、超量使用引起了大腸桿菌高耐藥性和多重耐藥性，給臨床治療帶來(lái)了難度，使得多種抗生素在治療大腸桿菌的效果也不盡人意；文章針對(duì)濰坊某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)病情況，采集病死雞的病料進(jìn)行致病性大腸桿菌的分離鑒定，為今后指導(dǎo)該養(yǎng)殖場(chǎng)的臨床治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

從濰坊某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)無(wú)菌采集疑似大腸桿菌?。ò陌危┑牟∷离u肝臟，連續(xù)采集3批次，每次共8個(gè)雞舍，每舍采6～10只不等。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥康凱、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、三糖鐵、營(yíng)養(yǎng)肉湯；葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽等微量發(fā)酵管均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；

1.1.3 試劑

0.5%苯酚生理鹽水、吲哚試劑、M-R試劑、V-P試劑均為實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.1.4 主要儀器

醫(yī)用凈化工作臺(tái)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、空氣浴振蕩器、冰箱、電熱恒溫水浴鍋、六聯(lián)電子調(diào)溫萬(wàn)用電爐、臺(tái)式離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、電子天平、可調(diào)式微量移液器。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

無(wú)菌采集肝臟病料，分別接種于普通培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基上，劃線分離，37℃培養(yǎng)18～24h，在麥康凱培養(yǎng)基上形成圓形、扁平、邊緣整齊、表面光滑濕潤(rùn)的紅色菌落，在普通培養(yǎng)基上形成灰白色邊緣整齊的菌落為大腸桿菌可疑菌落；選擇可疑菌落繼續(xù)進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)，得到純化好的單個(gè)菌落后，用白槍頭接種到盛有5mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，37℃空氣浴振蕩器中200rpm振蕩培養(yǎng)8h，得到呈均勻渾濁細(xì)菌菌液。挑選符合特征的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，革蘭氏陰性短桿菌者為疑似，進(jìn)行后續(xù)的生化鑒定。

1.2.2 生化鑒定

用五糖發(fā)酵、IMViC、三糖鐵、尿素酶試驗(yàn)進(jìn)行生化鑒定。按照常規(guī)方法用滅菌接種環(huán)挑取一環(huán)事先保存的菌液，接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24h，得到單一菌落后，進(jìn)行純培養(yǎng)，進(jìn)行三糖鐵、五糖發(fā)酵、IMViC、尿素酶試驗(yàn)進(jìn)行生化鑒定；能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解蔗糖，三糖鐵斜面和底部均為黃色，且有氣體產(chǎn)生，不產(chǎn)H2S，IMViC的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為“++--”的細(xì)菌判定為大腸桿菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

麥康凱培養(yǎng)基上形成圓形、扁平、邊緣整齊、表面光滑濕潤(rùn)的紅色菌落，在普通培養(yǎng)基上形成灰白色邊緣整齊的菌落，普通肉湯中呈均勻渾濁生長(zhǎng)；革蘭氏染色鏡檢可見(jiàn)多是散在排列的粉紅色、兩端鈍圓的短桿菌。共分離130株菌株。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

將分離到130株菌株按照常規(guī)方法采用五糖發(fā)酵、三糖鐵、IMVIC試驗(yàn)，進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 130株大腸桿菌的生化鑒定結(jié)果

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)乳糖發(fā)酵試驗(yàn)，以及吲哚試驗(yàn)及乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，分離到的130株菌株，其中120株符合大腸桿菌的生化特性。

3 討論

通常大腸桿菌的測(cè)定是通過(guò)在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，顯微鏡鏡檢，以及生化實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定的。生化實(shí)驗(yàn)通常用五糖發(fā)酵、IMViC、三糖鐵等試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。大腸桿菌大部分能夠分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇并產(chǎn)酸產(chǎn)氣；三糖鐵斜面和底部均為黃色，且底部有氣體產(chǎn)生，但不產(chǎn)H2S，不能利用枸櫞酸鹽，吲哚試驗(yàn)為陽(yáng)性，M-R試驗(yàn)陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)陰性，即IMViC為“++--”。但在上述結(jié)果中并不是每個(gè)菌株都符合大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從不符合標(biāo)準(zhǔn)的菌株中挑選了兩株進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果證明這兩株是大腸桿菌，故除可以用生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行大腸桿菌的鑒定之外，還可以配合16Sr RNA測(cè)序進(jìn)行細(xì)菌的鑒定。

4 小結(jié)

經(jīng)分離鑒定得到120株大腸桿菌，為以后篩選敏感的治療藥物和血清型鑒定奠定基礎(chǔ)。