楊文華

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000）

不同測(cè)定因素對(duì)凱氏定氮法粗蛋白測(cè)定的影響

楊文華

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000）

本試驗(yàn)依據(jù)凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白含量的步驟，研究了不同消化溫度、消化時(shí)間、催化劑用量、硼酸吸收液是否加減、蒸餾時(shí)間以及鹽酸濃度等對(duì)飼料中粗蛋白含量測(cè)定值的影響。

測(cè)定因素 凱氏定氮法 粗蛋白

蛋白質(zhì)是飼料中含氮化合物的總稱，是支持生命活動(dòng)的先決條件，更是構(gòu)成生命體細(xì)胞和抗體等不可或缺的關(guān)鍵成分[1]。飼料中蛋白質(zhì)含量的高低直接影響到動(dòng)物個(gè)體生長(zhǎng)和新陳代謝速度，因而，準(zhǔn)確測(cè)定飼料中的蛋白質(zhì)含量顯得尤為重要[2]。

粗蛋白質(zhì)的測(cè)定方法很多，包括凱氏定氮法、過(guò)氧化氫測(cè)定法、國(guó)標(biāo)法和雙縮脲法等[3]。由于凱氏定氮法測(cè)定簡(jiǎn)單，試劑和試驗(yàn)條件容易獲得，因而在實(shí)際中使用最多、應(yīng)用范圍最廣。諸多實(shí)踐證明，凱氏定氮法較適用于單一飼料粗蛋白、濃縮飼料粗蛋白等測(cè)定。凱氏定氮法的原理是用濃硫酸對(duì)試樣進(jìn)行消化，使試樣中的蛋白質(zhì)等含氮物的氮素轉(zhuǎn)化為氨[4]，被硫酸吸收生成硫酸銨，其后加入堿液進(jìn)行蒸餾，當(dāng)氨逸出后用硼酸予以吸收，最后用酸標(biāo)準(zhǔn)溶液完成滴定得到含氮量進(jìn)行粗蛋白質(zhì)換算。由于測(cè)定時(shí)涉及消化、吸收、蒸餾和滴定等眾多環(huán)節(jié)，因而凱氏定氮法的影響因素相應(yīng)較多，如消化溫度、消化時(shí)間、催化劑、蒸餾時(shí)間、鹽酸濃度等。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用進(jìn)口魚(yú)粉、玉米秸稈和大豆粕為試驗(yàn)材料，試樣粉碎并通過(guò)0.45mm分樣篩，分別混合均勻后置于密封容器中保存待用。試劑按照《GB/T6432-1994飼料中粗蛋白測(cè)定方法》[5]準(zhǔn)備。粗蛋白測(cè)定儀器為KDN-08凱氏定氮儀。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別研究不同消化溫度、消化時(shí)間、催化劑用量、硼酸吸收液加堿量、蒸餾時(shí)間、鹽酸濃度對(duì)凱氏定氮測(cè)定結(jié)果的影響。

1.2.1 消化溫度的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)過(guò)程中選用材料為大豆粕。將消化溫度設(shè)為380 ℃、400 ℃、420 ℃、440 ℃、460 ℃共5個(gè)處理，使用凱氏定氮法對(duì)樣品進(jìn)行消化蒸餾滴定，比較在不同消化溫度條件下的測(cè)量結(jié)果。

1.2.2 消化時(shí)間的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)過(guò)程中選用材料為大豆粕。將消化時(shí)間設(shè)為30min、60min、120min、180min、240min、300min共6個(gè)處理，使用凱氏定氮法對(duì)樣品進(jìn)行消化蒸餾滴定，比較在不同消化時(shí)間條件下的測(cè)量結(jié)果。

1.2.3 不同催化劑用量的影響試驗(yàn) 選用大豆粕為試驗(yàn)樣品，選用硫酸銅和硫酸鉀兩種混合催化劑進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，其比例為1：15，催化劑用量設(shè)為3.4 g、4.4 g、5.4 g、6.4 g、7.4 g共5個(gè)處理，使用凱氏定氮法對(duì)樣品進(jìn)行消化蒸餾滴定，比較在不同催化劑用量條件下的測(cè)量結(jié)果。

1.2.4 硼酸吸收液加堿的影響試驗(yàn) 在試驗(yàn)過(guò)程中參照《GB/T6432-1994飼料中粗蛋白測(cè)定方法》[5]中硼酸的配置方法，同時(shí)設(shè)置2個(gè)處理，分別在1000 ml硼酸吸收液中加入0.5 ml 4%氫氧化鈉和不加氫氧化鈉。每個(gè)處理測(cè)定3個(gè)平行。

1.2.5 蒸餾時(shí)間的影響試驗(yàn) 選用大豆粕為試驗(yàn)樣品，試驗(yàn)過(guò)程中將蒸餾時(shí)間設(shè)為3min、4min、5min、6min、7 min共5個(gè)處理，依據(jù)凱氏定氮法進(jìn)行消化蒸餾滴定。

1.2.6 鹽酸濃度的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)過(guò)程中分別選用魚(yú)粉、大豆粕、玉米秸稈為試驗(yàn)樣品，每個(gè)試驗(yàn)樣品的鹽酸濃度依次設(shè)為0.10、0.05、0.01 mol/L共3個(gè)處理，依據(jù)凱氏定氮法進(jìn)行消化蒸餾滴定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)采用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件中的廣義線性模型（GLM）進(jìn)行方差分析和多重比較（SNK）。

2 結(jié)果

2.1 消化溫度的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，在380℃和400℃的消化管中的溶液為不透明的黑色，意味著其未能完全消化，其他溫度下消化試管中均為藍(lán)色透明。各處理的凱氏定氮法測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1，圖1表明，消化溫度為420℃時(shí)所測(cè)得的粗蛋白相對(duì)含量高于其他處理，測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確。

圖1 不同消化溫度對(duì)凱氏定氮測(cè)定結(jié)果的影響

2.2 消化時(shí)間的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，30min消化后的樣品為黑色，而60min消化的樣品為淡藍(lán)色，其他消化時(shí)間的樣品顏色均為藍(lán)色透明。各處理的凱氏定氮法測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2，當(dāng)樣品消化時(shí)間為30min時(shí)，其蛋白質(zhì)含量偏低，隨著消化時(shí)間的逐漸增加，蛋白質(zhì)測(cè)定值逐漸提高。當(dāng)其消化時(shí)間為2h時(shí)，到達(dá)臨界點(diǎn)增長(zhǎng)速度放緩，甚至和消化5h后的蛋白質(zhì)含量無(wú)明顯差異，由此可以得出結(jié)論，消化時(shí)間控制在2h時(shí)最為適中。

圖2 不同消化溫度對(duì)凱氏定氮測(cè)定結(jié)果的影響

2.3 催化劑用量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)催化劑用量為3.4g和4.4g時(shí)，消化后試驗(yàn)樣品顏色為黑色。當(dāng)催化劑用量為6.4g時(shí)，消化后試驗(yàn)樣品為藍(lán)色透明，當(dāng)催化劑用量為7.4g時(shí)，試驗(yàn)組消化管內(nèi)存有黑色物體。

圖3 不同催化劑用量對(duì)凱氏定氮測(cè)定結(jié)果的影響

2.4 硼酸吸收液加堿的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，硼酸吸收液加堿與否對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有直接影響。從表1中可知，硼酸加堿所測(cè)得的空白值大于不加堿的處理，但對(duì)樣品粗蛋白的測(cè)定結(jié)果的影響極小，可以忽略不計(jì)。

表1 硼酸吸收液加堿對(duì)粗蛋白相對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響

2.5 蒸餾時(shí)間的影響

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，由圖可知，當(dāng)蒸餾時(shí)間在5～7min時(shí)，粗蛋白測(cè)定值較為接近，可認(rèn)為試驗(yàn)消化管中存有的游離氨可被全部蒸餾出來(lái)，被硼酸完全吸收；當(dāng)蒸餾時(shí)間為3～4min時(shí)，粗蛋白測(cè)定值偏低，可認(rèn)為消化管內(nèi)游離氨未蒸發(fā)完全；表明當(dāng)蒸餾時(shí)間控制在5min時(shí)，消化管內(nèi)的游離氨完全蒸發(fā)。

圖4 不同蒸餾時(shí)間對(duì)凱氏定氮測(cè)定結(jié)果的影響

2.6 鹽酸濃度的影響

試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，在魚(yú)粉粗蛋白的測(cè)定中，鹽酸的濃度越低，試驗(yàn)測(cè)定差異就越大。在豆粕粗蛋白的測(cè)定中，鹽酸的濃度越低，試驗(yàn)測(cè)定差異就越大。而玉米秸稈粗蛋白的測(cè)定中，鹽酸濃度越高，測(cè)定誤差越大。

表2 不同樣品鹽酸滴定的平均消耗用量，ml

3 討論

3.1 消化溫度的影響

凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白過(guò)程中，消化溫度會(huì)直接影響樣品的消化速度，一般要求控制消化溫度不使消化速度過(guò)快，剛開(kāi)始時(shí)以小火為宜，等到樣品焦化后再提高溫度。必要時(shí)可以晃動(dòng)瓶身消除因消化而產(chǎn)生的泡沫，避免消化不完全。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)消化溫度低于420℃時(shí)，數(shù)據(jù)結(jié)果偏小。但若溫度升溫過(guò)快，部分含氨物質(zhì)無(wú)法在規(guī)定時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化為硫酸銨，甚至是以氣體形式損失掉，則容易造成測(cè)定結(jié)果偏低?！禛B/T6432-1994飼料中粗蛋白測(cè)定方法》[5]中規(guī)定消化溫度為360℃～410℃，但實(shí)際消化時(shí)可針對(duì)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，當(dāng)然消化溫度一般不超過(guò)450℃，否則造成蛋白質(zhì)分解，影響試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性[6]。

3.2 消化時(shí)間的影響

凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白的消化時(shí)間比較容易控制，根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，樣品消化時(shí)間大于2h，即可消化完全。若消化時(shí)間超過(guò)2h，粗蛋白質(zhì)含量不僅不會(huì)增加，反而降低，因此建議將消化時(shí)間控制在2h為宜。

3.3 催化劑用量的影響

試驗(yàn)表明，當(dāng)催化劑用量為6.4g時(shí)消化最為徹底，所獲取數(shù)據(jù)也最為準(zhǔn)確。催化劑用量要求適宜，過(guò)少會(huì)致使消化不完全，過(guò)多則會(huì)留有難以消化的黑色物體，兩者都會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生不利影響。

3.4 硼酸吸收液加堿的影響

就粗蛋白測(cè)定結(jié)果總體而言，硼酸對(duì)于粗蛋白測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生的影響較小，很大程度上是因?yàn)榕鹚嵛找旱乃釅A度對(duì)飼料樣品和對(duì)空白對(duì)照組的作用是相同的，這樣便可將這一影響消除。硼酸加堿的意義在于，加堿之后進(jìn)行滴定試驗(yàn)，所觀察到的顏色反應(yīng)更加明顯，有利于試驗(yàn)者進(jìn)行滴定終點(diǎn)的判斷。

3.5 蒸餾時(shí)間的影響

盡管蒸餾時(shí)間為5min時(shí)，消化管內(nèi)游離氨均可完全蒸發(fā)。但隨著蒸餾時(shí)間的延長(zhǎng)，錐形瓶中的溶液體積逐漸加大，當(dāng)蒸餾時(shí)間超過(guò)7min時(shí)，蒸餾液將超過(guò)試驗(yàn)錐形瓶的三分之二，體積過(guò)大將影響后續(xù)滴定試驗(yàn)。因而，以控制蒸餾時(shí)間為5min為宜。

3.6 鹽酸濃度的影響

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)鹽酸在滴定量小于5ml或者大于40ml時(shí)，所造成的滴定誤差相對(duì)較大。因此，鹽酸的濃度選擇需要參照試樣大體的粗蛋白含量進(jìn)行選擇，若蛋白質(zhì)含量較高時(shí)，應(yīng)當(dāng)選用高濃度鹽酸予以滴定，反之亦然，這樣能夠保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性[7]。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白時(shí)，消化溫度以420℃效果最好，消化時(shí)間最好控制在2h，催化劑用量以6.4g為宜，硼酸吸收液是否加堿對(duì)測(cè)定結(jié)果影響比較小，蒸餾時(shí)間在5min為宜，粗蛋白的大體含量則為鹽酸濃度的主要決定因素?？傮w而言，消化溫度、消化時(shí)間和催化劑用量為影響消化結(jié)果的主要因素。

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