韓超　王麗娟　李海濤

摘要：從海南地區(qū)土壤中分離得到1株蘇云金芽孢桿菌（Bt）BJH705。經(jīng)PCR鑒定結(jié)果顯示，該菌中含有cry7Ab類基因，其晶體形態(tài)為雙錐形；以全長引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，得到大小為3 417 bp的片段；通過SDS-PAGE結(jié)果顯示，此菌株Cry7Ab殺蟲晶體蛋白分子量約為130 ku，編碼1 139個(gè)氨基酸殘基，等電點(diǎn)為4.83；序列已提交GenBank注冊(cè)，登錄號(hào)為KX010669；對(duì)Cry7Ab蛋白的跨膜區(qū)域進(jìn)行分析，得到此蛋白由親水域和疏水域形成跨膜區(qū)，其跨膜區(qū)大約由19個(gè)疏水氨基酸組成，經(jīng)Cry7Ab蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；cry7Ab基因；克隆；表達(dá)；殺蟲晶體蛋白

中圖分類號(hào)： Q786文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）14-0085-03

在世界范圍內(nèi)廣泛分布著一種革蘭氏陽性菌——蘇云金芽孢桿菌（Bt），其歸類于芽孢桿菌科芽孢桿菌屬[1]。它的母細(xì)胞會(huì)在形成芽孢的同時(shí)伴隨著形成晶體蛋白，稱之為伴胞晶體，伴胞晶體呈現(xiàn)立方體、球形、菱形、鑲嵌形、無定形，是具有殺傷活力的殺蟲晶體蛋白。

由cry7類基因編碼的蛋白的分子量約為130 ku，晶體一般為雙錐形。到目前為止，Crickmore（http：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/）上已經(jīng)登錄了cry7類21種基因，共37個(gè)，其中包含9個(gè)cry7Ab基因。但是關(guān)于cry7類基因的殺蟲活性卻很少被報(bào)道，有研究發(fā)現(xiàn)，cry7類基因可以編碼對(duì)鞘翅目害蟲有活性的蛋白；據(jù)相關(guān)的研究表明，Cry7Ab3蛋白對(duì)馬鈴薯甲蟲有較高的殺蟲活性[2]。Cry7Ab4蛋白胰蛋白酶（trypsin）酶解液對(duì)鞘翅目的大猿葉甲（Colophellus bowringi）顯示出一定的殺蟲活性，但對(duì)鱗翅目的小菜蛾（Plutella xylostella）、甜菜夜蛾（Spadoptera exigua）、亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）、榆藍(lán)葉甲（Pyrrhalta aenescens）和直翅目的東亞飛蝗（Locusta migraloria manilensis）基本無殺蟲活性[3]。Cry7Ab8蛋白對(duì)馬鈴薯瓢蟲2齡幼蟲具有較高毒力，但對(duì)黃粉蟲沒有殺蟲活性，這可能是由于馬鈴薯瓢蟲和黃粉蟲的中腸所含的蛋白酶不同[4]。Cry7Ca1蛋白對(duì)飛蝗有殺蟲活性[5]。由于鞘翅目害蟲的危害日益嚴(yán)重，而長期以來我國采用農(nóng)藥的防治方法給環(huán)境帶來了嚴(yán)重危害[6-9]，因此篩選和鑒定對(duì)鞘翅目害蟲有活性的基因極為重要。

1材料與方法

1.1材料

液體LB培養(yǎng)基：0.5%酵母粉，1.0%胰蛋白胨，1.0% NaCl，pH值為7.0，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。

固體LB培養(yǎng)基：0.5%酵母粉，1.0%胰蛋白胨，1.0% NaCl，1.3%瓊脂，pH值為7.0，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。

Taq DNA聚合酶、KOD酶、pMD19-T 載體、氨芐青霉素、X-Gal、IPTG、DNA marker、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購自美國Axygen公司；引物由金維智生物工程（北京）有限公司合成；分析純化學(xué)試劑均為市售。

1.2方法

1.2.1土樣來源及Bt菌株的分離

土樣采自中國海南地區(qū)，采用溫度法[10]進(jìn)行Bt菌株的篩選。

1.2.2Bt基因組的提取

分離純化后的Bt菌株在固體LB培養(yǎng)基上30 ℃過夜培養(yǎng)12 h，采用張彥蕊等的方法[11]提取基因組。

1.2.3cry7Ab基因的鑒定與克隆

根據(jù)GenBank上公布的cry7類基因的序列，利用primer 5設(shè)計(jì)cry7基因的鑒定引物cry7-F/cry7-R及cry7Ab全長的引物cry7Ab-F/cry7Ab-R，序列見表1（金唯智合成）。

利用cry7-F/cry7-R引物對(duì)，用Taq DNA聚合酶進(jìn)行cry7基因的鑒定，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。利用cry7Ab-F/cry7Ab-R引物對(duì)，用KOD酶進(jìn)行cry7Ab全長基因擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性 15 s，52 ℃復(fù)性30 s，68 ℃延伸 3.5 min，30個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min。將上述PCR產(chǎn)物均用0.7%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測，利用ChampGel 6000全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（gel documentation and image analysis system）成像。

按照Axygen公司的膠回收試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的回收純化。將回收的PCR產(chǎn)物分別連接pMD19-T克隆載體和pEB表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌（Escherichia coli） JM109中，篩選陽性克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證，以便確認(rèn)是否連有目的片段。提取連接正確重組細(xì)菌的質(zhì)粒送金維智生物工程（北京）有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.4cry7Ab基因在大腸桿菌中的表達(dá)

提取上述陽性轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。首先低溫離心收集誘導(dǎo)物并棄上清，用20 mmol/L Tris HCl（pH值為8.0）緩沖液懸浮細(xì)胞并進(jìn)行超聲波破碎，取樣用于 SDS-PAGE 分析。大腸桿菌質(zhì)粒DNA提取、連接、轉(zhuǎn)化方法參照王立光等的方法[12-14]，殺蟲晶體蛋白樣品制備和SDS-PAGE電泳檢測方法參見束長龍等的方法[15-17]，并進(jìn)行蛋白分析。

1.2.5Cry7Ab蛋白的結(jié)構(gòu)分析

首先通過DNAMAN分析Cry7Ab的氨基酸含量、蛋白的大小、等電點(diǎn)。再利用Expasy的ProtScale程序計(jì)算蛋白質(zhì)的疏水性圖譜，運(yùn)用www.cbs.dtu.dk/services/TMHMMM網(wǎng)站的在線工具TMHMMM分析蛋白的跨膜區(qū)。

2結(jié)果與分析

2.1菌株分離

將從采集的土樣中分離得到的菌株接種于1/2LB固體培養(yǎng)基中，36～48 h進(jìn)行光學(xué)顯微鏡鏡檢觀察。培養(yǎng)到24 h后，菌落呈乳白色，46 h后晶體完全裂解。從圖1中可以看出，這個(gè)菌株的晶體形態(tài)為雙錐形（箭頭所指）。

2.2蘇云金芽孢桿菌cry7Ab基因的克隆

以實(shí)驗(yàn)室保存菌株提取的基因組為模板，以引物對(duì)cry7-F/cry7-R 進(jìn)行PCR鑒定，得到大小1 500 bp左右的片段（圖2）。以全長引物cry7Ab-F/cry7Ab-R對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，通過測序得到3 417 bp的片段（圖3），與經(jīng)報(bào)道過已知的cry7Ab基因的堿基相似度為98.30%，與已知Cry7Ab蛋白氨基酸的相似度為99.91%。

2.3Cry7蛋白的表達(dá)和結(jié)構(gòu)分析

2.3.1Cry7Ab蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)

將引物對(duì) cry7Ab-F/cry7Ab-R擴(kuò)增產(chǎn)物回收、連接pEB表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆命名為705-Cry7Ab，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果見圖4。cry7Ab基因在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果表明，該基因編碼130 ku左右的殺蟲晶體蛋白Cry7Ab，與推測的蛋白大小一致。

2.4氨基酸序列分析

用ExpasyProtParam工具預(yù)測cry7Ab編碼1 139個(gè)氨基酸殘基，表達(dá)的蛋白質(zhì)大小約為130 ku，與已知的Cry7Ab蛋白氨基酸的相似度為99.91%。等電點(diǎn)pI為4.83，與預(yù)測結(jié)果相符。其中，Ala、Glu、Leu、Arg、Ser氨基酸含量最多，Asp、Phe、Lys、Gln、Trp這5種氨基酸含量為0。

2.5Cry7Ab蛋白的跨膜區(qū)域分析

利用expasy站點(diǎn)的氨基酸序列親水性和疏水性分析功能對(duì)Cry7Ab蛋白進(jìn)行研究。Expasy的ProtScale程序計(jì)算蛋白質(zhì)的疏水性，見圖5。1 000位點(diǎn)以前為主要的疏水區(qū)和親水交替區(qū)域，說明該區(qū)域的氨基酸可能為跨膜區(qū)域，可能形成了α螺旋束。再運(yùn)用www.cbs.dtu.dk/services/TMHMMM網(wǎng)站的在線工具TMHMMM分析蛋白的跨膜區(qū)[18-20]，Cry7Ab蛋白的跨膜區(qū)分析結(jié)果如圖6所示，其跨膜區(qū)大約由19個(gè)疏水氨基酸組成。

2.7Cry7Ab蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

[JP+1]通過NCBI Conserved Domain分析結(jié)果表明，δ-內(nèi)毒素的C-末端結(jié)構(gòu)域可能與碳水化合物結(jié)合功能相關(guān)，δ-內(nèi)毒素的C-末端結(jié)構(gòu)域是δ-內(nèi)毒素活性區(qū)的一部分，這是由芽孢桿菌殺蟲毒素的細(xì)菌芽孢在形成過程中產(chǎn)生的?；罨膬?nèi)毒素與中腸上皮細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡。此激[CM（25]活區(qū)域的δ-內(nèi)毒素由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，N-末端的螺旋結(jié)構(gòu)域（Ⅰ）涉及膜插入和孔的形成，而第2、3個(gè)結(jié)構(gòu)域（Ⅱ、Ⅲ）參與受體結(jié)合，結(jié)構(gòu)域Ⅲ的結(jié)構(gòu)類似于碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

3結(jié)論與討論

已知的cry7Ab3對(duì)馬鈴薯甲蟲有殺蟲活性，其中cry7Aa殺馬鈴薯甲蟲（LC50為13.1 μg/mL）[17]，cry7Ba1殺小菜蛾（3 d LC50為0.095 7 μg/ mL，5 d LC50為0.039 9 μg/mL）[18]，cry7Ca1對(duì)飛蝗有殺蟲活性（48 h LC50為4.73 μg/mL，72 h LC50為3.19 μg/mL）[19]，cry7Ab8對(duì)馬鈴薯瓢蟲2齡幼蟲具有較強(qiáng)的殺蟲活性，Cry7Ab4胰蛋白酶酶解液對(duì)鞘翅目害蟲的大猿葉甲有一定的殺蟲活性，其野生菌蛋白及表達(dá)蛋白酶解液LC50分別為231.59、293.79 μg/mL。

本研究以筆者所在實(shí)驗(yàn)室從海南地區(qū)不同地點(diǎn)采集的土樣中分離得到的96株Bt野生菌為材料，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得出Bt的分布可能與土樣采集的密集程度、植被覆蓋種類等原因相關(guān)，并對(duì)這96株Bt菌株進(jìn)行cry7Ab基因的鑒定。其中，從編號(hào)為BJH705菌株中成功克隆得到1株晶體形態(tài)為雙錐形的含有cry7Ab全長基因的菌株，片段大小為3 417 bp，克隆得到的cry7Ab基因與已知的cry7Ab3基因相似性為98.30%。序列已提交GenBank注冊(cè)，登錄號(hào)為KX010669。成功構(gòu)建表達(dá)載體后，在大腸桿菌BL21中表達(dá)了130 ku左右大小的新型殺蟲蛋白，與預(yù)測結(jié)果大小相符，與已知的Cry7Ab蛋白氨基酸的相似度為99.91%，其中Asp、Phe、Lys、Gln、Trp這5種氨基酸的的含量為0，可能與Cry7Ab蛋白的活性相關(guān)。對(duì)Cry7Ab蛋白的跨膜區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)親水域與疏水域是相互交替的，大約由19個(gè)疏水氨基酸組成跨膜區(qū)。分析Cry7Ab蛋白保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，由此可以對(duì)此基因的結(jié)構(gòu)及功能有進(jìn)一步的了解[20-21]。

因此，本研究克隆得到的cry7Ab基因編碼的蛋白也許會(huì)對(duì)鞘翅目害蟲有較高的殺蟲活性，可以為Bt基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)基因植物、Bt工程菌的構(gòu)建提供新材料，為Bt新型基因的發(fā)掘及擴(kuò)大殺蟲譜奠定基礎(chǔ)[22]。

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