姚舜，靳安民，張輝，閔少雄，黃帥，周治來

(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院，廣州510282)

低氧預處理對臍帶間充質(zhì)干細胞表型、增殖及神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌功能的影響

姚舜，靳安民，張輝，閔少雄，黃帥，周治來

(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院，廣州510282)

目的探討低氧預處理對臍帶間充質(zhì)干細胞表型、增殖、神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌功能的影響。方法收集分娩過程中丟棄的臍帶組織，分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞，將原代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞進行傳代。取傳至第3代的臍帶間充質(zhì)干細胞，隨機分為低氧組和常氧組，分別置于氧濃度為5%、21%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天。取對數(shù)生長期的兩組細胞，采用流式細胞術(shù)檢測CD44、CD45、CD90、HLA-DR表達，細胞免疫熒光法檢測CD34及層粘連蛋白、波形蛋白表達，實時熒光定量PCR法檢測腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)、睫狀節(jié)神經(jīng)細胞營養(yǎng)因子(CNTF)mRNA表達。兩組培養(yǎng)1～6天進行細胞計數(shù)，并采用CCK-8法檢測細胞增殖活性。結(jié)果兩組均高表達CD44、CD90、層粘連蛋白、波形蛋白，低表達CD45、HLA-DR、CD34，證實兩組細胞均具備間充質(zhì)干細胞表型特性；兩組上述細胞表型相關(guān)指標表達比較P均>0.05。兩組培養(yǎng)1～6天細胞計數(shù)及細胞增殖活性均先升高后降低；低氧組培養(yǎng)1～6天細胞計數(shù)均高于常氧組，培養(yǎng)2～6天細胞增殖活性均高于常氧組(P均<0.05)。低氧組BDNF、VEGF、HGF、CNTF mRNA相對表達量均高于常氧組(P均<0.05)。結(jié)論低氧預處理對臍帶間充質(zhì)干細胞的表型特征無明顯影響，但可提高其增殖能力及神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌功能。

間充質(zhì)干細胞；臍帶；低氧；細胞增殖；細胞表型；神經(jīng)營養(yǎng)因子

Abstract:ObjectiveTo investigate the influences of hypoxic preconditioning on cell phenotype, proliferation, and secretion of neurotrophic factors of human umbilical cord mesenchymal stem cells (UCMSCs).MethodsThe discarded umbilical cord tissues during delivery process were collected for UCMSCs culture, and the primary cultured mesenchymal stem cells were passaged. Cells at passage 3 were randomly divided into the normoxia group and hypoxia group, which were growing in 21% and 5% O2, respectively. Cells in logarithmic growth phase were used. The expression of CD44, CD45, CD90, and HLA-DR was detected by flow cytometry; the expression of CD34, laminin, and vimentin was determined by immunocytochemistry; the mRNA expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF), vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), and ciliary neurotrophic factor (CNTF) was determined by real-timer fluorescent quantitative PCR. After the cells were cultured for 1 to 6 days, we did the cell counting, and determined the cell proliferation by CCK-8.ResultsCD44, CD90, laminin, and vimentin were highly expressed, and CD45, HLA-DR, and CD34 were low expressed in both of the two groups, which showed that cells in the two groups had the characteristics of mesenchymal stem cells. There was no significant difference in expression of phenotype-related indexes between the two groups (allP>0.05). The CCK-8 results indicated that the cell counting and proliferation rate first increased and then decreased in 1-6 days′ culture in the two groups. When the cells were cultured for 1-6 days, the cell counting in the hypoxia group was higher than that in the normoxia group; when the cells were cultured for 2-6 days, the proliferation activity of the hypoxia group was higher than that of the normoxia group (allP<0.05). The mRNA expression of HGF, BDNF, VEGF, and CNTF in the hypoxia group was higher than that of the normoxia group (allP<0.05).ConclusionHypoxic preconditioning has little effect on the phenotypic features of UCMSCs, but can significantly enhance the proliferation rate and the secretion of neurotrophic factors.

Keywords: mesenchymal stem cells; umbilical cord; hypoxia; cell proliferation; cell phenotype; neurotrophic factors

間充質(zhì)干細胞最早是從人骨髓中提取，但之后研究發(fā)現(xiàn)人體許多組織均能分離、培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞，包括脂肪、臍帶、牙髓、韌帶、皮膚、肌肉等[1]。不同組織來源的間充質(zhì)干細胞在細胞形態(tài)、表型、免疫源性等方面大體相同，但增殖速度及分泌功能等則差別較大。臍帶組織為分娩過程中丟棄的組織，取材方便；臍帶間充質(zhì)干細胞增殖速度較快[2,3]，但存活率較低，分泌能力、炎癥調(diào)節(jié)能力有限。體外分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的氧濃度一般為20%，而宿主體內(nèi)氧濃度為1.5%～8%，細胞移植到宿主體內(nèi)后氧濃度急劇下降，細胞適應(yīng)能力差，可能是導致細胞移植效率低的一個重要原因。部分研究在體外對細胞進行低氧預處理，試圖提高其對低氧環(huán)境的耐受能力[4,5]。但是，目前關(guān)于低氧預處理對臍帶間充質(zhì)干細胞生物學行為影響的研究較少。為此，我們于2015年7月～2016年7月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM/F12完全培養(yǎng)液購于美國Gibco公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司，培養(yǎng)瓶購于美國Corning公司。

1.2 臍帶間充質(zhì)干細胞分離與培養(yǎng) 收集產(chǎn)婦分娩過程中丟棄的臍帶組織，以含1%青霉素-鏈霉素的PBS沖洗3次。用眼科剪去除血管組織，并將臍帶組織剪成碎片，接種于DMEM/F12完全培養(yǎng)液(含10%FBS、100 IU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)的25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后換液，去除懸浮細胞，細胞逐漸長出，即為原代臍帶間充質(zhì)干細胞。待原代細胞融合至80%時進行細胞傳代，消化離心后用培養(yǎng)基重懸細胞，輕柔吹打形成單細胞懸液，按1∶4進行傳代，并接種于新的25 cm2培養(yǎng)瓶中。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核，產(chǎn)婦及其家屬均簽署知情同意書。

1.3 細胞分組處理 取傳至第3代的臍帶間充質(zhì)干細胞，制備細胞懸液，調(diào)整密度為1×105個/mL。將細胞隨機分為低氧組和常氧組，37 ℃條件下分別置于氧濃度為5%、21%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天。

1.4 細胞表型相關(guān)指標檢測 ①CD44、CD45、CD90、HLA-DR表達：采用流式細胞術(shù)。取對數(shù)生長期的兩組細胞，消化后調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，用含0.1%疊氮鈉和0.5% BSA的PBS沖洗2遍，PBS重懸細胞。加入一抗，4 ℃條件下孵育30 min，PBS沖洗2遍。加入異硫氰酸熒光素或藻紅蛋白標記的小鼠抗人IgG二抗，4 ℃條件下孵育30 min，PBS沖洗2遍。用不含BSA的PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測CD44、CD45、CD90、HLA-DR表達。②CD34及層粘連蛋白、波形蛋白表達：采用細胞免疫熒光法。取對數(shù)生長期的兩組細胞，吸除培養(yǎng)液，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS沖洗5 min×3次，0.3% Triton X-100室溫破膜5 min，山羊血清封閉液37 ℃封閉1 h。分別加入血清稀釋液稀釋的一抗兔抗CD34、兔抗層粘連蛋白、鼠抗波形蛋白(稀釋比例分別為1∶100、1∶200、1∶200)，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，吸除一抗，PBS沖洗5 min×3次；滴加二抗Alexa Fluor 594標記羊抗兔IgG(1∶200)和Alexa Fluor 488標記羊抗鼠IgG(1∶200)，室溫孵育1 h；去除二抗后，PBS沖洗5 min×3次。DAPI復染細胞核，封片。同時設(shè)陰性對照，以抗體稀釋液代替一抗。熒光顯微鏡下隨機選取5～20個高倍視野，計數(shù)DAPI染色細胞數(shù)，隨后改變觀察波長，計數(shù)相同視野下CD34、層粘連蛋白、波形蛋白陽性染色的細胞數(shù)量，計算陽性表達率。

1.5 細胞增殖活性檢測 ①細胞計數(shù)：取兩組培養(yǎng)1～6天的細胞，消化后重懸于2 mL DMEM/F12培養(yǎng)基中，將計數(shù)板放在低倍鏡下(10×10)觀察并進行計數(shù)。每組取4皿，每皿重復計數(shù)3次，取平均值。②細胞增殖活性：采用CCK-8法。取兩組培養(yǎng)1～6天的細胞，制成單細胞懸液，以2×103個/孔接種于96孔板，共200 μL。每孔加入10 μL CCK-8溶劑，采用酶聯(lián)免疫檢測儀于450 nm波長下讀取吸光度(OD)值。每組3個復孔，取平均值。

1.6 神經(jīng)修復相關(guān)因子mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。取對數(shù)生長期的兩組細胞，棄去培養(yǎng)液，預冷PBS洗滌單層細胞。采用TRIzol試劑提取總RNA，檢測總RNA濃度和純度合格后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)、睫狀節(jié)神經(jīng)細胞營養(yǎng)因子(CNTF)及內(nèi)參基因β-actin引物序列見表1，PCR反應(yīng)過程參照前期研究[6]。PCR反應(yīng)體系：Q-PCR Mix 10 μL，ddH2O 4 μL，上下游引物各2 μL，cDNA(1∶5) 2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預變性5 min、95 ℃變性45 s、56 ℃退火45 s、72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

表1 各基因引物序列及擴增長度

2 結(jié)果

2.1 兩組細胞表型相關(guān)指標表達比較 兩組均高表達CD44、CD90、層粘連蛋白及波形蛋白，低表達CD45、HLA-DR、CD34，證實兩組細胞均具備間充質(zhì)干細胞表型特征；兩組CD44、CD45、CD90、HLA-DR、CD34、層粘連蛋白、波形蛋白等細胞表型相關(guān)指標表達比較P均>0.05。見表2。

2.2 兩組細胞增殖能力比較 兩組培養(yǎng)1～6天細胞計數(shù)及細胞增殖活性均先升高后降低； 低氧組培養(yǎng)1～6天細胞計數(shù)均高于常氧組，培養(yǎng)2～6天細胞增殖活性均高于常氧組(P均<0.05)。見表3、4。

表2 兩組細胞表型相關(guān)指標表達

表3 兩組培養(yǎng)1～6天細胞計數(shù)比較

注：與常氧組同時間點比較，*P<0.05。

表4 兩組培養(yǎng)1～6天細胞增殖活性比較

注：與常氧組同時間點比較，*P<0.05。

2.3 兩組神經(jīng)修復相關(guān)因子mRNA表達比較 低氧組BDNF、VEGF、HGF、CNTF mRNA相對表達量均高于常氧組(P均<0.05)。見表5。

表5 兩組細胞神經(jīng)修復相關(guān)因子mRNA表達比較(相對表達量

注：與常氧組比較，*P<0.05。

3 討論

間充質(zhì)干細胞移植治療在神經(jīng)損傷的修復中發(fā)揮越來越重要的作用，臍帶間充質(zhì)干細胞移植后可調(diào)節(jié)宿主炎癥反應(yīng)及凋亡等，有助于促進神經(jīng)生長[7]。但任何細胞移植發(fā)揮治療作用均需以一定的細胞數(shù)量為基礎(chǔ)，目前臍帶間充質(zhì)干細胞移植領(lǐng)域的一個瓶頸就是移植后細胞存活率較低，尤其是神經(jīng)損傷患者。由于血管損傷、組織撕裂、血栓形成等導致局部缺血、炎癥、壞死，組織含氧量進一步下降，細胞生長環(huán)境惡劣，間充質(zhì)干細胞移植后往往大量死亡，難以發(fā)揮其修復作用[8]。

生理狀態(tài)下，女性生殖系統(tǒng)組織氧濃度為1.5%～8%，胎兒體內(nèi)循環(huán)氧濃度不超過5%[9]。正常情況下體外培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞的氧濃度是21%，將其移植到低于1%的損傷局部勢必會導致部分細胞無法適應(yīng)驟然下降的氧濃度而大量死亡。為了解決細胞移植后存活率低的問題，有學者提出在移植前對細胞進行低氧預處理，以適應(yīng)移植后宿主體內(nèi)的低氧狀態(tài)[10,11]。目前有研究證實，低氧預處理能減少細胞內(nèi)活性氧自由基的生成，低氧預處理的間充質(zhì)干細胞對心肌梗死的修復效果更強[12]。在脊髓損傷的修復實驗中，低氧預處理臍帶間充質(zhì)干細胞的移植存活率高于常氧細胞，且能進一步下調(diào)損傷局部ED-1、caspase-3陽性細胞數(shù)量，表明低氧預處理的臍帶間充質(zhì)干細胞對損傷組織炎癥的調(diào)控能力更強[13]。有研究證實，低氧刺激會降低樹突狀細胞的遷移能力，氧分壓越低，其遷移能力越低[14]。但間充質(zhì)干細胞的生物學行為與樹突狀細胞差別較大，低氧是否影響臍帶間充質(zhì)干細胞的遷移仍需進一步研究。本研究選用低氧濃度為5%，該濃度與體內(nèi)生理氧濃度，尤其是女性生殖系統(tǒng)組織氧濃度更接近。結(jié)果顯示，兩組均高表達干細胞相關(guān)標志物CD90、CD44及間充質(zhì)干細胞的標志性蛋白波形蛋白、層粘連蛋白，低表達血管內(nèi)皮細胞相關(guān)標志物CD34、CD45及HLA-DR，證實兩組細胞均為間充質(zhì)干細胞；兩組上述表型相關(guān)指標表達比較差異均無統(tǒng)計學意義，表明低氧預處理對臍帶間充質(zhì)干細胞的表型特征無明顯影響。

劉林奇等[15]研究顯示，低氧刺激可提高脂肪間充質(zhì)干細胞的增殖速度。本研究結(jié)果顯示，兩組培養(yǎng)1～6天細胞計數(shù)及細胞增殖活性均先升高后降低，低氧組培養(yǎng)1～6天細胞計數(shù)均高于常氧組，培養(yǎng)2～6天細胞增殖活性均高于常氧組；說明低氧預處理可提高臍帶間充質(zhì)干細胞的增殖能力，對于在短期內(nèi)收集足夠移植所需數(shù)量的細胞具有重要意義。臍帶間充質(zhì)干細胞在神經(jīng)修復中具有重要作用，與其神經(jīng)因子分泌功能密切相關(guān)，其中BDNF、VEGF、HGF、CNTF均為重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子。本研究結(jié)果顯示，低氧組BDNF、VEGF、HGF、CNTF mRNA相對表達量均高于常氧組，說明低氧預處理可提高臍帶間充質(zhì)干細胞的神經(jīng)因子分泌功能，對于其修復神經(jīng)損傷具有重要作用。

綜上所述，低氧預處理對臍帶間充質(zhì)干細胞的表型特征無明顯影響，但可提高其增殖能力及神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌功能。本研究為提高干細胞移植效率提供了新的實驗和理論基礎(chǔ)。臍帶間充質(zhì)干細胞移植修復神經(jīng)損傷除了對移植細胞的存活率、分泌功能有要求外，還涉及宿主體內(nèi)細胞的增殖、分化等方面。低氧預處理臍帶間充質(zhì)干細胞的氧濃度及其對宿主細胞炎癥、凋亡、增殖的影響仍需進一步研究。

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Effects of hypoxic preconditioning on cell phenotype, proliferation, and secretion of neurotrophic factors of umbilical cord mesenchymal stem cells

YAOShun,JINAnmin,ZHANGHui,MINShaoxiong,HUANGShuai,ZHOUZhilai

(ZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510282,China)

國家自然科學基金青年科學基金資助項目(81400996)；廣東省自然科學基金博士啟動項目(2014A030310100)。

姚舜(1990-)，男，住院醫(yī)師，研究方向為脊柱脊髓損傷的基礎(chǔ)與臨床。E-mail: yaoshun810@163.com

周治來(1983-)，男，主治醫(yī)師，研究方向為脊柱脊髓損傷的基礎(chǔ)與臨床。E-mail: 273344078@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.007

R329.2

A

1002-266X(2017)32-0025-04

2017-02-15)