潘麗娟，蔣玉鳳，李強(qiáng)

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

IL-2聯(lián)合肝細(xì)胞生長因子體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的效果觀察

潘麗娟，蔣玉鳳，李強(qiáng)

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

目的觀察白細(xì)胞介素2(IL-2)聯(lián)合肝細(xì)胞生長因子(HGF)體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化為肝細(xì)胞的效果。方法將大鼠P3代BMSCs隨機(jī)分為5組，M0組不處理，M1組加20 μg/L HGF，M2、M3、M4組分別加5、10、20 μg/L IL-2和20 μg/L HGF。于第7、14、21天倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測細(xì)胞中的白蛋白及甲胎蛋白。結(jié)果M0組細(xì)胞呈長梭形，在誘導(dǎo)過程中細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生改變；而M1～M4組由長梭形細(xì)胞逐漸向三角形、類圓形轉(zhuǎn)化，隨著時(shí)間延長逐漸增多，類似肝細(xì)胞。M0組細(xì)胞各時(shí)點(diǎn)均未檢測到甲胎蛋白和白蛋白；M1～M4組隨誘導(dǎo)時(shí)間延長甲胎蛋白表達(dá)逐漸減少(P均<0.05)而白蛋白表達(dá)逐漸增加(P均<0.05)，且同一時(shí)間點(diǎn)甲胎蛋白、白蛋白表達(dá) M1～M4組逐漸增加 (P均<0.05)。結(jié)論IL-2聯(lián)合HGF可體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為肝細(xì)胞,IL-2濃度越高誘導(dǎo)生成的肝細(xì)胞越多。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；白細(xì)胞介素2；肝細(xì)胞生長因子；肝細(xì)胞；甲胎蛋白；白蛋白

肝臟是人體重要的合成及代謝器官，一旦發(fā)生病變將嚴(yán)重影響人們的生活。肝移植是治療終末期肝衰竭最有效的療法，但存在肝源難求、花費(fèi)高昂、免疫排斥反應(yīng)及終身服藥等缺點(diǎn)；然而，成熟的肝細(xì)胞移植后活性低，不能再生，存活時(shí)間短。因此，干細(xì)胞移植由此產(chǎn)生。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)屬于多能干細(xì)胞，具有自我復(fù)制、多向分化潛能，沒有免疫排斥和倫理沖突，且研究證實(shí)體內(nèi)外能夠被誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞，故被認(rèn)為是細(xì)胞移植最有前途的干細(xì)胞[1]。但是，BMSCs向肝細(xì)胞分化的最佳誘導(dǎo)試劑及誘導(dǎo)條件目前尚不清楚。大量研究證明，肝細(xì)胞生長因子(HGF)能夠誘導(dǎo)BMSCs分化為肝細(xì)胞[2]。李偉等[3]實(shí)驗(yàn)研究證明，瘀膽血清中含有的白細(xì)胞介素2(IL-2)能在肝細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)代償性產(chǎn)生，其能促進(jìn)肝細(xì)胞再生以及肝干細(xì)胞分化。目前，尚無將IL-2用于誘導(dǎo)BMSCs向肝細(xì)胞分化的研究。2015年3～12月，我們采用不同濃度IL-2和HGF聯(lián)合誘導(dǎo)BMSCs分化為肝細(xì)胞，為干細(xì)胞移植進(jìn)一步尋找適宜的誘導(dǎo)方案。

1 材料與方法

1．1 材料 健康清潔級SD大鼠6只，雄性，4周齡，體質(zhì)量80～100 g，西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。DMEM低糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，重組鼠HGF(美國R&D公司)，BMSCs鑒定表型兔抗大鼠CD45、CD90、CD29抗體 (武漢博士德公司)，IL-2(Peprotech公司),小鼠抗大鼠白蛋白(成熟肝細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白)及甲胎蛋白(不成熟肝細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白)單克隆抗體(武漢博士德公司)

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分離培養(yǎng)及傳代 脫頸處死大鼠，無菌條件下獲得股骨和脛骨，然后反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液。接種細(xì)胞懸液于含有10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，72 h后首次換液，第10～14 天細(xì)胞融合80%～90%時(shí)按1∶3傳代。

1.2.2 BMSCs的鑒定 將P3代的BMSCs用0.25%的胰蛋白酶和0.02% EDTA按1∶1混合消化，用PBS洗滌后制成1.5×106/mL單細(xì)胞懸液；分為4組試管，每管20 μL,其中3組為實(shí)驗(yàn)組，另一組為對照組；試驗(yàn)組中依次加入一抗抗體CD29、CD45、CD90，對照組中加入PBS，同時(shí)設(shè)立陰性對照；室溫下避光孵育30 min，PBS洗滌3次；各組試管中分別加入PE標(biāo)記二抗IgG(1∶40)混勻；4 ℃下避光孵育30 min；PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×106/mL；上采用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組CD29、CD45、CD90陽性細(xì)胞比例分別為95.25%、1.95%、96.21%，符合BMSCs表型。

1.2.3 BMSCs的誘導(dǎo)分化及形態(tài)觀察 取P3代BMSCs，以1×105/孔接種于6孔板 (孔中預(yù)先放置細(xì)胞爬片)，加入含10%胎牛血清低糖培養(yǎng)基，24 h后隨機(jī)分為5組。M0組不處理，M1組加20 μg/L HGF，M2、M3、M4組分別加5、10、20 μg/L IL-2和20 μg/L HGF。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每3天換液1次，于第7、14、21天在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.4 細(xì)胞中甲胎蛋白及白蛋白檢測 采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法。于誘導(dǎo)培養(yǎng)第7、14、21 天取出細(xì)胞爬片，10%中性甲醛固定15 min，PBS液沖洗3次。3% H2O2溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶后PBS沖洗。然后用0.25% Triton X-100處理10 min后再次用PBS液沖洗。非免疫動(dòng)物血清室溫下封閉30 min，然后加入甲胎蛋白、白蛋白一抗(甲胎蛋白1∶200稀釋；白蛋白1∶200稀釋)；37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS液沖洗3次。DAB顯色，3～10 min后用自來水沖洗，蘇木素復(fù)染5～10 min。充分水洗3 min后用鹽酸乙醇分化，自來水沖洗至細(xì)胞核變藍(lán)。用不同梯度乙醇脫水后封片。鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞所占比例。胞質(zhì)含有棕黃色(甲胎蛋白)、黃色(白蛋白)顆粒為陽性細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)非重復(fù)視野計(jì)算陽性細(xì)胞所占百分比。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 M0組細(xì)胞呈長梭形，在誘導(dǎo)過程中細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生改變。而M1～M4組加入各種誘導(dǎo)因子后，長梭形細(xì)胞逐漸向三角形、類圓形轉(zhuǎn)化；隨著時(shí)間延長，類圓形或三角形細(xì)胞逐漸增多，類似肝細(xì)胞。

2.2 各組細(xì)胞甲胎蛋白和白蛋白表達(dá)比較 M0組細(xì)胞各時(shí)點(diǎn)均未檢測到甲胎蛋白和白蛋白。M1～M4組隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長甲胎蛋白表達(dá)逐漸降低(P均<0.05)而白蛋白表達(dá)逐漸增高 (P均<0.05)，且同一時(shí)間點(diǎn)甲胎蛋白、白蛋白表達(dá) M1～M4組逐漸增加 (P均<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞中甲胎蛋白、白蛋白表達(dá)比較

注:與 M0組比較，AP<0.05；與 M1組比較，BP<0.05；與 M2組比較，CP<0.05；與 M3組比較，DP<0.05；與同組第7天比較，aP<0.05；與同組第14天比較，bP<0.05。

3 討論

自從Friedenstein等[4]首次成功地分離、培養(yǎng)出BMSCs并證實(shí)在一定條件下具有多向分化能力后，BMSCs的研究備受關(guān)注。BMSCs在骨髓中含量很少，因此如何分離培養(yǎng)純化BMSCs是主要問題。目前，獲得BMSCs的方法有貼壁培養(yǎng)法、免疫磁珠法、密度梯度離心法及流式細(xì)胞儀分離法，后3種分離法對BMSCs的活性都有一定影響。因此，我們采取全骨髓貼壁法獲得純化的BMSCs，流式細(xì)胞結(jié)果顯示BMSCs高表達(dá)CD29、CD90，不表達(dá)或低表達(dá)CD45，表型標(biāo)志符合BMSCs特點(diǎn)。Erices等[5]研究報(bào)道，BMSCs表面有堿性成纖維細(xì)胞生長因子、IL-2、IL-3、IL-6等多種細(xì)胞因子受體。BMSCs誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞機(jī)制復(fù)雜且不明確，但是通過加用影響肝臟生長的細(xì)胞因子例如HGF、表皮生長因子、IL-6、制瘤素M等，可顯著誘導(dǎo)BMSCs向肝細(xì)胞分化[6，7]。

白蛋白和甲胎蛋白均為肝細(xì)胞較特異的標(biāo)志蛋白。本實(shí)驗(yàn)研究中，BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后生成的細(xì)胞表達(dá)白蛋白及甲胎蛋白，證明誘導(dǎo)生成的細(xì)胞為肝細(xì)胞。其中，白蛋白是成熟肝細(xì)胞分泌的，隨著肝細(xì)胞的成熟分泌逐漸增加，是肝細(xì)胞合成、分泌最多的蛋白質(zhì)類型；其他細(xì)胞很少分泌白蛋白，用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法基本測不到[8]。甲胎蛋白為胚胎時(shí)期分泌的一種特殊的糖蛋白，在肝細(xì)胞成熟的時(shí)候少量合成，屬于不成熟肝細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白。本研究第7天時(shí)處于胚肝時(shí)期，甲胎蛋白分泌較多；其后隨著肝細(xì)胞不斷成熟，甲胎蛋白表達(dá)逐漸減少，而白蛋白表達(dá)逐漸增加。

HGF是正常肝細(xì)胞最強(qiáng)的促有絲分裂劑，它在BMSCs分化為肝細(xì)胞所起的作用是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。參考陳鵬飛等[9]的實(shí)驗(yàn)，5～100 μg/L的HGF有促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的作用，在低至1 μg/L時(shí)HGF仍存在促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的能力。因此，本實(shí)驗(yàn)選用20 ng/mL的HGF作為干預(yù)基礎(chǔ)[10]。1976年，Morgant等首先在人脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)IL-2。范寶晶[11]研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者血清中與肝臟發(fā)育和再生密切相關(guān)的因子如HGF、TNF、IL-2及NO等均高于正常值。Wang等[12]將HGF用于大鼠BMSCs的誘導(dǎo)分化，成功分化為肝細(xì)胞。Ishikawa等[13]證明，成纖維生長因子2能促進(jìn)小鼠BMSCs成功向肝細(xì)胞分化并促進(jìn)白蛋白的分泌。目前，尚未有實(shí)驗(yàn)將IL-2用于BMSCs誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的研究，因此本實(shí)驗(yàn)選用不同濃度IL-2聯(lián)合HGF誘導(dǎo)分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-2能夠加強(qiáng)HGF的誘導(dǎo)效果，并且隨著濃度的增加誘導(dǎo)效果加強(qiáng)。然而，兩者聯(lián)合的誘導(dǎo)作用究竟是相加作用還是協(xié)同作用，需要我們下一步進(jìn)行深入研究。

目前，BMSCs分化的肝細(xì)胞已經(jīng)移植入動(dòng)物體內(nèi)，取得良好的療效。但是，移植入人體內(nèi)還需要大量實(shí)驗(yàn)證明，還有很多問題需要解決。首先，BMSCs缺乏特異監(jiān)測標(biāo)志，如何獲得活性度好的BMSCs；其次，目前對于BMSCs誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞具體機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步研究；最后，BMSCs分化的肝細(xì)胞移植入人體內(nèi)是否會(huì)癌變尚不清楚[14，15]。上述問題需要進(jìn)一步的研究解決，以為今后肝衰竭的治療提供新的方法。

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A

1002-266X(2017)34-0030-03

2017-03-12)

四川省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(110358)。

蔣玉鳳(E-mail: jyf872@126.com)； 李強(qiáng)(E-mail: 1583269597@qq.com)