吳文亮，黃建安，劉仲華*，楊新河，袁 勇，黃 浩，楊文波

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128；2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，湖南 長沙 410125；3.湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000；4. 湖南省茶業(yè)集團(tuán)股份有限公司，湖南 長沙 410126）

LDLR激動劑模型的建立及上調(diào)LDLR功能的黑茶品類篩選

吳文亮1,2，黃建安1，劉仲華1*，楊新河3，袁 勇4，黃 浩2，楊文波2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128；2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，湖南 長沙 410125；3.湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000；4. 湖南省茶業(yè)集團(tuán)股份有限公司，湖南 長沙 410126）

建立低密度脂蛋白受體（Low density lipoprotein receptor ,LDLR）激動劑藥物篩選模型，并用該模型篩選出具有上調(diào)LDLR功能的黑茶品類。合成LDLR啟動子片端（189bp），克隆入含有螢火蟲熒光素梅報告基因的pGL3-basic載體中，構(gòu)建了重組報告基因質(zhì)粒pGL3-LDLR，以pRL-TK為內(nèi)參質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2；以降脂藥物辛伐他汀作為陽性對照物，優(yōu)化反應(yīng)條件，再應(yīng)用該模型對8種黑茶水提取物進(jìn)行了初步篩選。結(jié)果表明，辛伐他汀對熒光素酶的表達(dá)具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，且呈一定劑量的依賴性，Z′因子為0.72，表明該模型具有很好的靈敏性和穩(wěn)定性，成功地建立了靶向LDLR轉(zhuǎn)錄活性的雙報告基因篩選體系，并發(fā)現(xiàn)待測黑茶均有一定的激動活性，其中金花天成茶對模型的激活值最高，激活值達(dá)1.761。

低密度脂蛋白受體；雙熒光素酶報告基因；藥物篩選模型；黑茶

低密度脂蛋白受體(Low density lipoprotein receptor, LDLR) 是一種表達(dá)豐富的膜糖蛋白，在肝細(xì)胞中含量較多。血漿中大部分膽固醇被肝細(xì)胞表面的LDLR清除，與脂代謝關(guān)系密切[1]。人類的冠心病、動脈粥樣硬化等疾病與LDLR結(jié)構(gòu)及功能的紊亂有關(guān)聯(lián)[2]，因此上調(diào)LDLR的表達(dá)成為治療高膽固醇血癥等疾病的藥物靶標(biāo)。

我國邊疆少數(shù)民族同胞長期食用高脂食物，卻少見患肥胖和高脂血癥疾病的報道，黑茶是邊疆游牧民族生活必需品，具有悠久的飲用歷史，有“寧可三日無食，不可一日無茶”之說，可見黑茶對他們的重要性?，F(xiàn)有研究表明黑茶對調(diào)節(jié)高脂血癥具有顯著的效果[3-6]，但對黑茶在上調(diào)LDLR功效方面的研究還鮮見報道。本研究是以LDLR啟動子為靶點(diǎn)建立新型降血脂藥物的篩選模型，篩選出具有上調(diào)LDLR功能的黑茶品類，并為黑茶的綜合開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞株和質(zhì)粒

HepG2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；E.coli DH5α（用于質(zhì)粒DNA的遺傳操作）由本實(shí)驗(yàn)室提供；引物及含LDLR基因的啟動子序列質(zhì)粒pLDLR由北京三博遠(yuǎn)志生物公司合成；pRLTK載體為含有啟動子的海腎熒光素酶編碼基因的內(nèi)參質(zhì)粒，pGL3-Basic為含無啟動子的螢火蟲熒光素酶編碼基因報告基因載體，均購自Promega公司。

1.1.2 黑茶

茯磚茶（2010年），湖南益陽茶廠；千兩茶（2010年），天尖茶（2010年），湖南省白沙溪茶廠有限責(zé)任公司；六堡茶（2010年），廣西梧州茂圣茶業(yè)有限公司；青磚茶（2010年），湖北趙李橋茶廠；金花天成茶（2010年），湖南省安化縣晉豐厚茶行有限公司；金尖茶（2010年），四川吉祥茶業(yè)有限公司（雅安市茶廠）；普洱熟茶（2010年），云南龍潤茶業(yè)集團(tuán)。

1.1.3 藥品與試劑

限制性內(nèi)切酶Bgl II、HindⅢ，TOYOBO公司產(chǎn)品；Pfu-DNA聚合酶、T4DNA連接酶，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000，Invitrogen公司產(chǎn)品；雙熒光素酶檢測試劑盒，Promega公司產(chǎn)品；大型質(zhì)粒抽提試劑盒EndoFree Plasmid Maxi Kit （10），Qiagen 公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒，北京天根公司產(chǎn)品；二甲基亞礬（DMSO），Amreso公司產(chǎn)品；辛伐他汀，上海施貴寶產(chǎn)品；OPTi-MEM，Gibco公司產(chǎn)品。

胰酶、L-谷氨酞胺，Gibco公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，Gibco公司產(chǎn)品。

1.1.4 儀器

PCR擴(kuò)增儀（德國Biometra公司）；Varioskan Flash多功能讀數(shù)儀（Thermo Scienti fi c）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pGL3-LDLR的構(gòu)建

據(jù)文獻(xiàn)[1]報道，人LDLR基因啟動子最大活性調(diào)控區(qū)域，合成189bp片段的 LDLR啟動子（其序列－187～＋2）并構(gòu)建在pGL3-Basic質(zhì)粒上，用PCR擴(kuò)增得到大量該片段，利用Primer設(shè)計(jì)上游引物P1：GGTAGATCTCTCGA GGCCTGCCCTGGCGACACT （下劃線表示Bgl II酶切位點(diǎn)）和下游引物P2：CCCAAGCTTGC CCACGTCATTTACAGCATTTCA（下劃線表示Hind III酶切位點(diǎn)）擴(kuò)增靶基因。PCR反應(yīng)體系以質(zhì)粒pLDLR為模板，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min；94℃變性10 s，61℃退火10 s，72℃延伸1 min（30個循環(huán)）；72℃再延伸20 min。

將PCR擴(kuò)增的目的片段與經(jīng)過相同雙酶切的pGL3-Basic質(zhì)粒相連，將LDLR基因啟動子序列定向插入到質(zhì)粒pGL3-Basic的熒光素酶基因上游，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-LDLR，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α受體菌，然后做菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒pGL3-LDLR；將鑒定為陽性的菌液加入含氨芐LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用BglII /Hind III雙酶切鑒定重組質(zhì)粒并進(jìn)行序列測定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基用于HepG2細(xì)胞株培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前用胰酶消化。參考Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒提供的方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，具體方法為：96孔培養(yǎng)板每孔接入3×105個生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長至90%時開始轉(zhuǎn)染，按操作說明加入適量的質(zhì)粒和脂質(zhì)體[7]。

1.2.3 熒光素酶活性的測定

細(xì)胞熒光素酶表達(dá)活性的測定采用熒光素酶雙報告基因檢測試劑盒，在酶標(biāo)儀下自動檢測相對熒光素酶活性（relative luciferase unit，RLU），即螢火蟲螢光素酶活性值與海腎螢光素酶活性值的比值，海腎螢光素酶為內(nèi)參[8]。

熒光素酶的誘導(dǎo)表達(dá)率=陽性對照物的RLU/陰性對照物（DMSO）的RLU。

1.2.4 模型穩(wěn)定性的考察

細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染后，設(shè)置陽、陰性對照各30次試驗(yàn)，辛伐他汀按最佳濃度加入給藥孔中，24 h后測RLU。

Z'因子值大于0.4時，表示該篩選模型具有可重復(fù)性及很高的靈敏度[9]，本試驗(yàn)公式中的Luc值= RLU

1.2.5 黑茶水提物的初步篩選

應(yīng)用已建立的模型對8種黑茶水提取物進(jìn)行初步篩選，以0.2 μg/mL濃度的辛伐他汀作為陽性對照，0.1%DMSO為陰性對照[7,10-11]，24 h后測定細(xì)胞內(nèi)的Fluc與Rluc的比值即RLU，并計(jì)算激活模型的激活值（即實(shí)驗(yàn)組RLU與陰性對照組RLU的比值），當(dāng)待測黑茶水提取物的激活值≥1即可判定為陽性結(jié)果[12-14]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

原始數(shù)據(jù)用 SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析。*P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**P＜0.01為顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 LDLR啟動子的克隆

以pLDLR為模板，PCR擴(kuò)增LDLR啟動子。電泳分析如圖1所示，泳道2有一條210 bp帶，這與含有雙酶切位點(diǎn)的LDLR啟動子大小相符。

水分狀況是影響植物分布、生長發(fā)育的環(huán)境因子，植物對環(huán)境水分的需求有其臨界值和最高點(diǎn)。土壤過濕，水分處于飽和狀態(tài)，土壤含水量超過田間最大持水量，這種現(xiàn)象成為濕害。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，植物的濕害不如干旱普遍，但是在某些地區(qū)或某個時期，濕害可能造成嚴(yán)重的危害。如在雨量大、排水不良或地下水位過高的土壤和低洼、溫室設(shè)施等常會出現(xiàn)水分過多、空氣濕度過大造成對植物的危害。

圖1 LDLR啟動子擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Ampli fi cation results of LDLR promoter

2.2 重組質(zhì)粒pGL3-LDLR的構(gòu)建

構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-LDLR后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，做菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒pGL3-LDLR，結(jié)果如圖2，第2、3泳道內(nèi)的PCR產(chǎn)物與第4泳道陽性對照質(zhì)粒pLDLR擴(kuò)增的LDLR啟動子大小一致，為210 bp左右。

圖2 重組質(zhì)粒pGL3-LDLR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR identi fi cation of recombinant plasmids pGL3-LDLR

將鑒定為陽性菌落的菌液接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，雙酶切重組質(zhì)粒pGL3-LDLR，瓊脂糖凝膠電泳。由圖3可見：第2、3泳道的酶切產(chǎn)物均出現(xiàn)大小兩個片段，大片段與pGL3-Basic（4818bp）大小一致，小片段與LDLR啟動子一致。

將重組質(zhì)粒pGL3-LDLR送往上海生工公司測序，測序結(jié)果與報道的序列[1]一致，由此獲得pGL3-LDLR重組質(zhì)粒。

2.3 陽性藥物辛伐他汀對細(xì)胞增殖功能的影響（CCK8法）

將HepG2細(xì)胞接種于96孔板，完全貼壁后用不同濃度的辛伐他汀處理細(xì)胞24 h后，采用CCK8法在450 nm處檢測吸光度（OD值），每個樣品重復(fù)5次。結(jié)果如圖4所示：在2×10-4～2 μg/mL范圍內(nèi)，OD值與對照組相比差異無顯著性（P＞0.05），說明在此劑量范圍內(nèi)辛伐他汀對細(xì)胞增殖無影響。辛伐他汀在20 μg/mL濃度時，OD值與對照組相比具有顯著性差異（*P＜0.05）。

圖3 重組質(zhì)粒的雙酶切分析Fig.3 Restriction enzymatic analysis of recombinant plasmid

圖4 辛伐他汀對HepG2細(xì)胞增殖的影響Fig. 4 The effect of simvastatin on the proliferation of HepG2 cells

圖5 不同質(zhì)粒比對轉(zhuǎn)染效率的影響Fig. 5 The effect of different ratios of plasmids on transfection ef fi ciency

2.4 共轉(zhuǎn)染過程中質(zhì)粒比的優(yōu)化

2.5 模型的靈敏性

加入 2×10-4、 2×10-3、 2×10-2、 2×10-1、2 μg/mL系列濃度的辛伐他汀，24 h后測定細(xì)胞內(nèi)的RLU，如圖6所示：各組值與對照組相比RLU值差異顯著（**P＜0.01），螢光素酶基因表達(dá)與辛伐他汀的濃度有高度關(guān)聯(lián)性，誘導(dǎo)表達(dá)率與辛伐他汀濃度在一定程度上呈劑量依賴性，體現(xiàn)了濃度依賴性，說明該模型具有較高的靈敏度。

2.6 模型的穩(wěn)定性

為評估該模型是否穩(wěn)定，在96孔板上同時重復(fù)陽、陰性對照各30次，按上述最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行，結(jié)果如圖7所示：

圖6 不同濃度的辛伐他汀對熒光素酶表達(dá)率的影響Fig .6 The effect of different concentrations of simvastatin on induction rate of luciferase expression

圖7 96孔板Z′因子檢測Fig.7 Z′factor determination in 96-well plate forma

Z′因子=0.72，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，陽性和陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果區(qū)別明顯，篩選模型的分辨率較高。在30次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，偶爾出現(xiàn)假陽性和假陰性，這是大規(guī)模篩選中難以避免的。

2.7 陽性樣品的篩選

對8種黑茶水提取物進(jìn)行初步篩選，以檢測它們是否為LDLR模型的激動劑，結(jié)果如表1，8種黑茶水提取物激活值均≥1，其中6種樣品的激活值達(dá)1.5以上，分別為茯磚茶、金花天成茶、普洱熟茶、青磚茶、天尖茶和六堡茶，其中金花天成茶對模型的激活值最高，為1.761。金尖茶和千兩茶對模型也呈現(xiàn)一定的激動活性，激活值接近1.5。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)[15-16]報道，細(xì)胞內(nèi)的膽固醇負(fù)反饋調(diào)節(jié)LDLR基因轉(zhuǎn)錄，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度降低時，膽固醇與SRE位點(diǎn)（結(jié)合在LDLR基因啟動子）的結(jié)合蛋白結(jié)合，進(jìn)而上調(diào)LDLR的表達(dá)，使細(xì)胞攝取胞外膽固醇，血漿正常膽固醇水平正是在這種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制下進(jìn)行。本研究合成了LDLR啟動子片端，構(gòu)建重組報告基因質(zhì)粒pGL3-LDLR，通過轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞HepG2，并對各種反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，成功地建立了靶向LDLR轉(zhuǎn)錄活性的雙報告基因篩選體系。

表1 8種樣品對LDLR模型的影響（mean±SD，n=5）Table1 The effect of eight samples on the activity of LDLR models（mean±SD，n=5）

篩選體系穩(wěn)定性的Z'因子與兩個參數(shù)有關(guān)，其一是陽性對照和陰性對照平均值的差值，該值越大，說明試驗(yàn)對樣品的活性反應(yīng)越靈敏；其二是陽性對照和陰性對照標(biāo)準(zhǔn)差的和，此值越小則說明試驗(yàn)穩(wěn)定，可重復(fù)性好，試驗(yàn)的精確度高，數(shù)據(jù)越可靠[9]。因此，具有可重復(fù)性及高靈敏度的篩選模型Z'因子值一般要求大于0.4，這樣可有效的減少假陽性和假陰性率[9]。為確保試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度，本次篩選所有板的Z'因子均大于0.4，符合結(jié)果分析要求。

為了排除由于黑茶水提物對HepG2細(xì)胞的增殖作用而引起的報告基因誘導(dǎo)表達(dá)率增高的可能性，同樣采用CCK8法，結(jié)果表明黑茶水提取物對細(xì)胞增殖均無明顯影響。篩選的8種黑茶水提取物在上調(diào)LDLR方面均有效果，且8種黑茶水提物的作用與辛伐他汀相近，但其作用物質(zhì)基礎(chǔ)尚未確定，有待進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)8種黑茶品類中的金花天成茶（散茯茶）與茯磚茶對LDLR模型的激活值較高，這可能與這兩類黑茶中所獨(dú)有的“金花”菌有關(guān)，而有關(guān)“金花”菌的化學(xué)成分及其藥理作用的研究報道較少，目前已有研究表明冠突散囊菌具有產(chǎn)生洛伐他汀的能力[17]，對非酒精性脂肪肝細(xì)胞有降脂效果[18]。

[1]Kamal DM, Ruixin, Joey, et al. Identi fi cation of a Novel cis-Acting Element Participating in Maximal Induction of the Human Low Density Lipoprotein Receptor Gene Transcription in Response to Low Cellular Cholesterol Levels [J]. Biol Chem,1996, 271(271)：33616-33622.

[2]Broussean ME, Kauffman RD, Herderick EE, et al. LCAT modulates atherogenic plasma lipoproteins and the extent of atherosclerosis only in the presence of normal LDL receptors in transgenic rabbits[J]. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology, 2000,20(2)：450-458.

[3]趙麗萍, 邵宛芳. 普洱茶對高脂血癥大鼠的降脂和預(yù)防脂肪肝作用[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2010, 23(2)：579-583.

[4]肖文軍, 任國譜, 傅冬和, 等. 茯茶輔助調(diào)節(jié)血脂作用研究[J].茶葉科學(xué) , 2007, 27(3)：211-214.

[5]劉勤晉, 司輝清. 黑茶營養(yǎng)保健作用的研究[J]. 中國茶葉,1994(6)：36-37.

[6]宋魯彬. 中國黑茶藥理功能評價及活性物質(zhì)研究[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[7]鄧婷, 紀(jì)偉, 連霽虹, 等. 人apoA-Ⅰ基因啟動子轉(zhuǎn)錄上調(diào)劑篩選系統(tǒng)的建立與應(yīng)用 [J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2007,19(5)：776-780.

[8]吳文亮. LDLR激動劑模型的建立及其在黑茶降脂作用研究中的應(yīng)用[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[9]司書毅, 張?jiān)虑? 藥物篩選--方法與實(shí)踐[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2007.

[10]王少鵬, 李際仙, 彭志剛, 等. 高通量篩選瞬時受體勢V3通道調(diào)節(jié)劑細(xì)胞模型的建立[J]. 生物工程學(xué)報, 2008,24(11)：1895-1901.

[11]劉曉輝, 洪斌, 王麗非, 等.人高密度脂蛋白受體表達(dá)上調(diào)劑篩選模型的建立[J]. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報, 2004,26(4)：354-358.

[12]傅冬和, 劉仲華, 黃建安, 等. 高通量篩選研究茯磚茶降脂減肥功效[J]. 茶葉科學(xué), 2006, 26(3)： 209-214.

[13]傅冬和, 劉仲華, 黃建安, 等. 高通量篩選研究茯磚茶對FXR模型的作用[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(5)： 331-334.

[14]傅冬和, 劉仲華, 黃建安, 等. 茯磚茶中幾種單體成分功效的高通量篩選研究 [J]. 茶葉科學(xué), 2008, 28(1)：39-42.

[15]Rudenko G, Henry L, Henderson K, et al. Structure of the LDL receptor extracellular domain at endosomal pH[J]. Science,2002, 298(20)： 2353-2358.

[16]LL Rudel, JS Pakrs, FL Johnson, et al. Low density lipoproteins in atherosclerosis[J]. Lip Res, 1986, 27(5)： 465-474.

[17]鄭欣欣. 茯磚茶中“金花”菌產(chǎn)孢機(jī)制及其功能性研究[D].西安：陜西科技大學(xué), 2015.

[18]袁勇, 黃建安, 劉仲華, 等. 茯茶中“金花”孢子粉提取物對體外誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯代謝的影響[J]. 茶葉科學(xué) , 2011, 31(2)：129-135.

Establishment of LDLR Agonist Model & Screening of Up—regulating LDLR Level Tea from the Different Varieties of Dark Tea

WU Wen-liang1,2，HUANG Jian-an1，LIU Zhong-hua1*，YANG Xin-he3，YUAN Yong4，
HUANG Hao2，YANG Wen-bo2

（1. Key Lab of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agricultural University, National Research Center of Engineering & Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanical, Collaborative Innovation Center of Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China; 2. Tea Research Institute of Hunan Academy of Agricultural, Changsha 410125, China; 3. School of Life Science and Technology, Hubei Engineering University, Xiaogan 432000, China; 4. Hunan Tea Group Co. , LTD, Changsha 410126, China）

In order to screen up—regulating LDLR level tea from the different varieties of dark tea, the LDLR agonist model was constructed. LDLR promoter(189bp) was cloned and ligated into the pGL3-basi vector contained luciferase reporter gene, then the recombinant reporter plasmid pGL3-LDLR was constructed. HepG2 cells were transfected with pGL3-LDLR and internal reference plasmid TK, we used the simvastatin lowering cholesterol as a positive control, and optimized various experimental conditions. The results showed that the simvastatin can induce the expression of luciferase reporter markedly and in a dependent manner, the Z′factor of this model was 0.72. The experiment results illustrated thismodel was sensitive and stable. And found that the various dark teas have a certain activity through the model, but the"Golden Flower" Tiancheng tea has the highest up—regulating activity to this model, activated values was 1.761.

Low density lipoprotein receptor, Dual-luciferase reporter gene, Drug screening, Dark tea

S571.1

A

1009-525X（2017）03-07-12, 16

2017-04-07

2017-08-18

梧州市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（201501028）、2015年梧州市六堡茶產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目、湖南省自然科學(xué)基金（2016JJ6058）

吳文亮（1984-），男，湖南茶陵人，在讀博士研究生，研究方向：茶葉加工及茶葉功能成分化學(xué)。

*通訊作者：劉仲華（1965-），男，湖南衡陽人，教授，主要從事茶葉加工及功能成分化學(xué)研究。E-mail： lark-liu@163.com