王 偉, 張瑞蓮, 玄立印, 王海連

(1.河北省承德市疾病預(yù)防控制中心微生物室， 河北 承德 067000 2.河北省豐寧縣黃旗鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院， 河北 豐寧 067000 3.河北省寬城縣疾病預(yù)防控制中心， 河北 寬城 067000)

環(huán)介導(dǎo)技術(shù)在細(xì)菌性痢疾檢測(cè)中的應(yīng)用

王 偉1, 張瑞蓮2, 玄立印3, 王海連1

(1.河北省承德市疾病預(yù)防控制中心微生物室， 河北 承德0670002.河北省豐寧縣黃旗鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院， 河北 豐寧0670003.河北省寬城縣疾病預(yù)防控制中心， 河北 寬城067000)

目的建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)檢測(cè)腸道門診感染性腹瀉病例志賀菌。方法應(yīng)用Primer Explorer V5軟件設(shè)計(jì)針對(duì)志賀菌的保守區(qū)引物，建立LAMP檢測(cè)方法，采用熒光定量PCR法、LAMP法和分離培養(yǎng)法三種方法，對(duì)760例承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腸道門診腹瀉患者糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)建立的方法進(jìn)行特異度、靈敏度試驗(yàn),與熒光定量PCR、培養(yǎng)法進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果3種方法的檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LAMP檢測(cè)方法具有良好的敏感度和特異度。結(jié)論LAMP法使用水浴鍋進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，結(jié)果可在可見光或紫外燈下直接肉眼觀察。LAMP檢測(cè)方法靈敏特異，簡(jiǎn)單快速，無需特殊儀器，可廣泛用于基層疾控醫(yī)療機(jī)構(gòu)志賀菌的檢測(cè)。

志賀菌； 熒光定量PCR法； 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)； 檢 測(cè)

志賀菌(Shigella)是腸桿菌科一種傳染性較強(qiáng)、危害嚴(yán)重、可在人和動(dòng)物腸道內(nèi)寄生的革蘭陰性無芽胞桿菌，屬于常見食源性致病菌，所致的細(xì)菌性痢疾(Shigellosis)是世界上尤其是發(fā)展中國家重要的傳染病之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年細(xì)菌性痢疾患者高達(dá)1.65億，發(fā)展中國家的病例人數(shù)占98%,每年約110萬死亡病例,其中5歲以下兒童為60%。目前，在我國，國標(biāo)法(GB/T4789.5-2013)仍然是志賀氏菌檢驗(yàn)的最常用的方法，但耗時(shí)長(zhǎng)，敏感性差，PCR方法具有靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)成本較高，儀器昂貴，不適于基層單位應(yīng)用[2,3]。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法對(duì)疾病診斷、控制和流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是 2000年由日本榮研株式會(huì)社 Notomi 等[4]研發(fā)的一種新的核酸擴(kuò)增方法。其方法依賴于能夠識(shí)別靶DNA上6個(gè)特定區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下反應(yīng)1 h～2 h高效完成目的基因擴(kuò)增。本研究運(yùn)用LAMP技術(shù)原理，根據(jù)以志賀菌侵襲性質(zhì)?？乖?H 基因(ipaH)中的保守區(qū)，設(shè)計(jì)4條特異性引物，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株痢疾志賀菌進(jìn)行檢測(cè)，建立的LAMP檢測(cè)技術(shù),并對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化后，應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，與熒光PCR法進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本：2016年承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腸道門診腹瀉患者糞便標(biāo)本；

1.2菌株：福氏志賀菌、宋氏志賀菌、痢疾志賀菌、腸炎沙門桿菌、鼠傷寒沙門桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌由河北省CDC提供。

1.3儀器：ABI7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；電熱恒溫水浴鍋(美國熱電公司)；BIO-RAD電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)；Eppendorf mini spain離心機(jī)(德國艾本德公司)。

1.4試劑：志賀氏菌增菌肉湯-新生霉素、麥康凱(MAC)瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽(XLD)瓊脂、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基、三糖鐵(TSI)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面均購自北京陸橋公司；API20E生化鑒定試劑購自青島新元生物技術(shù)有限公司；Bst DNA聚合酶(批號(hào)：0000128457)購自Promega公司；志賀氏菌核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)購自江蘇碩世生物科技股份有限公司，所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.5方 法

1.5.1DNA模板制備：按照志賀氏菌核酸檢測(cè)試劑盒要求，便標(biāo)本取黃豆粒大小用0.5mL生理鹽水稀釋，標(biāo)準(zhǔn)菌株取其增菌液lmL至離心管中，振蕩后，13000rpm離心2min，棄上清，沉淀中加入DNA提取液100μL混勻，沸水浴10min，13000 rpm離心5 min，上清液即為模板。

1.5.2LAMP引物設(shè)計(jì)：針對(duì)GenBank上公布的志賀菌 ipaH 基因序列中的保守區(qū)，用Primer 5.0設(shè)計(jì)2條外引物(F3、B3)和2條內(nèi)引物(FIP、BIP)，見表1，均由上?？萍加邢薰竞铣?。

表1 志賀菌LAMP法引物

1.5.3優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系：建立初始反應(yīng)體系，通過調(diào)整鎂離子、內(nèi)外引物、甜菜堿濃度及反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度，對(duì)志賀菌校準(zhǔn)菌珠提取的標(biāo)準(zhǔn)模板，進(jìn)行LAMP檢測(cè)，最終確定LAMP反應(yīng)體系為25μL，包括：外引物F3、B3(10mmoL/L)各0.5μL，內(nèi)引物FIP、BIP(10μmoL/L)各2μL；betaine(5mmoL/L)，2.5μL；BstDNA聚合酶(8U/L)，1μL；Bstbufer(10×)，2.5μL；dNTP(10mmoL/L)，2.5μL；MgCl2(2.5mmoL/L)，5μL；DNA模板，2μL；ddH2O4.5μL。反應(yīng)條件為65℃恒溫1h，80℃滅活10min。肉眼直接觀察是否有白色沉淀產(chǎn)生，或添加熒光染料SYBR Green I 1μL，在紫外透射儀下觀察是否有綠色熒光反射，也可取5μL的產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)LAMP反應(yīng)是否發(fā)生，從而判斷設(shè)計(jì)的LAMP擴(kuò)增引物是否有效。

2 結(jié) 果

2.1臨床實(shí)際樣品檢測(cè)：分離培養(yǎng)方法為金標(biāo)準(zhǔn)，檢出志賀菌陽性90份，熒光定量PCR法與LAMP法均檢出志賀菌陽性105份，3種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率為100%，LAMP靈敏度為100%，特異度為97.8%。比較3種方法的檢出率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.35，P>0.05)(見表2)。

表2 3種檢測(cè)方法檢出情況

圖1 志賀菌特異度實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果

2.2LAMP法的特異度:使用建立的志賀菌LAMP檢測(cè)方法對(duì)福氏志賀菌、宋氏志賀菌、痢疾志賀菌、鼠傷寒沙門桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行檢測(cè)，志賀菌屬有特征性梯狀條帶產(chǎn)生，最小DNA片段位于150bp處，檢測(cè)結(jié)果均為陽性，其余無條帶，擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，說明LAMP法具備良好的特異度(圖1)。

2.3LAMP法的靈敏度：將痢疾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于志賀氏菌增菌肉湯，經(jīng)平板計(jì)數(shù)法得出此原始菌液濃度為4.7×108，將原始菌液10倍倍比稀釋，分別取各稀釋度菌液1mL，提取DNA模板，進(jìn)行LAMP法和熒光PCR檢測(cè)。LAMP結(jié)果顯示當(dāng)菌液濃度為4.7×101CFU/mL～4.7×108CFU/mL時(shí)，管底有白色沉淀產(chǎn)生，當(dāng)菌液濃度低于4.7×101CFU/mL時(shí)，無沉淀產(chǎn)生。如在LAMP反應(yīng)體系中加入SYBR Green I染料，反應(yīng)完成后，在紫外燈下觀看顏色變化，呈現(xiàn)綠色熒光為陽性，橙色熒光為陰性，使結(jié)果觀察更加方便。熒光PCR結(jié)果表明當(dāng)菌液濃度4.7×102CFU/mL～4.7×108CFU/mL時(shí)，有明顯S擴(kuò)增曲線，當(dāng)菌液濃度為低于4.7×102CFU/mL時(shí)，呈陰性反應(yīng)。LAMP法敏感性高于熒光PCR法10倍。

3 討 論

志賀菌檢測(cè)是腸道門診檢測(cè)工作的主要項(xiàng)目，本研究建立的LAMP方法為志賀菌提供了很好的檢測(cè)方法，從DNA提取到實(shí)驗(yàn)結(jié)束全過程只需1.5h，操作簡(jiǎn)便、成本低廉，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)的效率。LAMP技術(shù)可在等溫條件下實(shí)現(xiàn)基因快速擴(kuò)增，具有擴(kuò)增反應(yīng)快、靈敏度高、特異度強(qiáng)、不需要昂貴的儀器等優(yōu)點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物量大，形成白色的焦磷酸鎂鹽沉淀，因此肉眼也可進(jìn)行結(jié)果判別[4]。

目前，國標(biāo)中傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法為檢測(cè)志賀菌的金標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用此方法，報(bào)告陽性病例并獲取到志賀氏菌株至少需要5d的時(shí)間，整個(gè)檢測(cè)過程易受人為主觀因素影響，且血清學(xué)分型鑒定試劑普便存在效價(jià)低、保質(zhì)期短等缺點(diǎn)，常常導(dǎo)致假陰性造成漏檢。熒光PCR法雖然耗時(shí)短，但此方法必需特殊的儀器、嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)環(huán)境和昂貴的試劑，不適用于基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)。而LAMP法擺脫了對(duì)儀器的依賴，操作簡(jiǎn)單，具有更高的敏感性，更適合于基層實(shí)驗(yàn)室。但LAMP法檢測(cè)的是志賀菌的通用核酸，檢測(cè)結(jié)果為陽性時(shí)，僅能說明標(biāo)本中含有某種志賀菌，不能直接分離到菌株進(jìn)行同源性分析。如果將LAMP法與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法有效結(jié)合，先把標(biāo)本用LAMP進(jìn)行篩查，再將陽性標(biāo)本用分離培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)，必能大大也提高檢出率。LAMP方法僅適合作為分離培養(yǎng)方法的有益補(bǔ)充而不能代替它[5]。

LAMP技術(shù)，不需要特殊的儀器設(shè)備，在普通實(shí)驗(yàn)室條件下即可實(shí)現(xiàn)[6,7]。LAMP方法的建立為腸道門診腹瀉病例志賀菌檢測(cè)及診斷提供了一種更快速、有效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段，具有較好的推廣應(yīng)用前景[8]。

[1] Osorio JJ,Roman AR,Torre-Cisneros J.Spectrum and risk factors of invasive fungal infection[J].Enferm Infecc Microbiol Clin,2007,25(7):467～476.

[2] Peman J,Salaver M.General epidemiology of invasive fungal disease[J].Enferm Infecc Microbiol Clin,2012,30(2):90～98．

[3] Nucci M,Marr KA.Emerging fungal diseases[J].Clin Infect Dis,2005,41(4):521～526．

[4] Mayr A,Lass-Florl C.Epidemiology and antifungal resistance in invasive Aspergillosis according to primary disease ： review of the literature[J].Eur Med Res,2011,16(4):153～157.

[5] 溫來欣,方麗萍.應(yīng)用LAMP同時(shí)快速檢測(cè)沙門菌和志賀菌的效果評(píng)價(jià)[J].職業(yè)與健康,2014,30(4):654～649.

[6] 焦文強(qiáng),殷相平,柳紀(jì)省.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理及其在檢測(cè)診斷病原微生物中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào),2009,18(9):54～57.

[7] 吳靜怡,董路寧,任立松,等.痢疾桿菌快速檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2010,20(4):257～259.

TheApplicationofLAMPTechniqueinDetectionoftheBacillaryDysentery

WANGWei,etal

(ChengdeCentreforDiseasePreventionandControl,HebeiChengde067000,China)

Objective:To establish and apply the methods of LAMP assay for the detection of Shigella of infectious diarrhea patients from the enteric clinicsin.MethodsThe specific primers of the conserved regions of Shigella by using Primer Explorer V5 online and composed to establish the LAMP assay for detection of Salmonella. The 760 fecal specimens among diarrhea patients visiting the enteric clinicsin in Hospital of Chengde Medical College from 2016 was collected and test by Real-time PCR ,LAMP and the Traditional Method. The specificity and sensibility of LAMP were evaluated by comparing with Real-time PCR and the Traditional.ResultsThere was no statistical difference in the specificity of 3 method(P>0.05). LAMP showed fine specificity and high sensitivity.ConclusionLAMP assay was performed in water oven and the results could be directly determined by eyes under visible light or UV lamp. Because of its rapidity and minimal equipment requirement，LAMP assay for detection of Shigella in primary diseases control and prevention agency and primary health institutions.

Shigella; Real-time PCR; LAMP; Detection

1006-6233(2017)09-1496-03

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.09.026

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目，(編號(hào)：201701A012)

王海連