張 權(quán)，陳修來，劉 佳，羅秋玲，劉立明

(1．江南大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122;2．江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122;3．江南大學 食品微生物制造工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

發(fā)酵法生產(chǎn)糖胺聚糖的研究進展

張 權(quán)1，2，3，陳修來1，2，3，劉 佳1，2，3，羅秋玲1，2，3，劉立明1，2，3

(1．江南大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122;2．江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122;3．江南大學 食品微生物制造工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

糖胺聚糖是一種具有多種生理功能的直鏈酸性黏多糖，廣泛應用于化妝品、保健品和藥品等行業(yè)。為了滿足環(huán)境友好、生產(chǎn)安全和可持續(xù)發(fā)展的社會要求，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)糖胺聚糖越來越受到人們的關(guān)注。本文中，筆者在總結(jié)糖胺聚糖生物合成路徑的基礎(chǔ)上，分析歸納了發(fā)酵法生產(chǎn)糖胺聚糖的生化工程和代謝工程策略，并展望了糖胺聚糖進一步高效生產(chǎn)的發(fā)展方向。

糖胺聚糖;代謝路徑;生化工程;代謝工程

1 糖胺聚糖概述

糖胺聚糖(glycosaminoglycans，簡稱GAGs)是由重復的二糖單元反復交聯(lián)而形成的具有多種生理功能的直鏈酸性黏多糖?；诙欠N類、連接方式、硫酸化位點的差異，糖胺聚糖可以分為肝素、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、皮膚軟骨素和硫酸角質(zhì)素。糖胺聚糖具有抗凝血、抗血栓和抗腫瘤等多種藥理活性，是構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨和滑液的主要成分［1-2］。此外，在護膚化妝品領(lǐng)域具有保濕保水作用，還可作為美容保健食品補充體內(nèi)的多糖［3-4］。

目前，糖胺聚糖的生產(chǎn)技術(shù)主要可以分為動物組織提取法、人工合成法和發(fā)酵法3種。提取法是最早用于生產(chǎn)糖胺聚糖的方法，材料來源于動物組織，如雞冠、狗的肝臟和牛肺，鯊魚軟骨等，工業(yè)過程包括提取、除雜、沉淀干燥得到產(chǎn)品。但是原料來源局限性大，生產(chǎn)周期長，產(chǎn)品純化率低，生產(chǎn)成本高，并且動物病原的交叉感染事件頻發(fā)受到衛(wèi)生部門高度關(guān)注［5］。人工合成法是指某些特定高分子物質(zhì)在體外經(jīng)過一系列的化學反應得到目標產(chǎn)物，化學合成磺達肝素需要進行25步反應，生物高分子“玻璃酸氧氮雜環(huán)戊烯衍生物”合成透明質(zhì)酸還處于實驗室研究階段，可見合成過程的復雜性［6-7］。發(fā)酵法指利用性能優(yōu)良的微生物菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，然后從發(fā)酵液中分離純化得到目標產(chǎn)物。發(fā)酵法與其他方法相比有著獨特的優(yōu)勢，微生物利用廉價的培養(yǎng)基生產(chǎn)高價值的糖胺聚糖，能夠顯著降低成本，增加經(jīng)濟效益;發(fā)酵液提取與純化工藝過程較其他方法簡單，得到的產(chǎn)品質(zhì)量安全穩(wěn)定;此外，發(fā)酵法具有環(huán)境友好、低污染等優(yōu)勢。

近年來，發(fā)酵法生產(chǎn)糖胺聚糖已經(jīng)成為國內(nèi)外研究熱點(表1)，本綜述以透明質(zhì)酸、肝素及硫酸軟骨素為對象，糖胺聚糖的生物合成途徑為基礎(chǔ)，從生化工程和代謝工程策略兩個方面詳細論述糖胺聚糖的生物合成現(xiàn)狀，并從代謝工程技術(shù)角度為未來糖胺聚糖高產(chǎn)菌株的構(gòu)建進行展望。

表1 發(fā)酵法生產(chǎn)糖胺聚糖研究策略Table 1 Strategies for GAGs production by microbial fermentation

2 糖胺聚糖的合成途徑

糖胺聚糖作為一種莢膜多糖，首先在細胞質(zhì)中合成多糖鏈，然后經(jīng)周質(zhì)空間定位至細胞外膜形成一圈黏液層，整個過程由細胞外膜和周質(zhì)空間內(nèi)多種復合蛋白完成，并且這些復合結(jié)構(gòu)在時間和空間上需要緊密配合。合成過程主要可以分為3個部分：1)單糖前體的合成;2)糖胺聚糖的聚合與延伸;3)糖胺聚糖的修飾與轉(zhuǎn)運。

2.1 單糖前體的合成

肝素、透明質(zhì)酸和軟骨素的合成途徑如圖1所示。由圖1可知：葡萄糖通過PEP-PTS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、ABC轉(zhuǎn)運子和質(zhì)子泵等方式進入細胞內(nèi)，被葡萄糖激酶(EC 2．7．1．2) 轉(zhuǎn)化成 6-磷酸-葡萄糖(Glc-6-P)，然后進入3條不同代謝路徑：1)直接進入戊糖磷酸途徑;2)在磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(EC 5．3．1．9)的作用下轉(zhuǎn)化成6-磷酸-果糖(Fru-6-P);3)在磷酸葡萄糖變位酶(EC 5．4．2．2)的作用下轉(zhuǎn)化成 1-磷酸-葡萄糖(Glu-1-P)。其中，2)、3)分別為前體UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)和UDP-N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)的合成路徑。

UDP-GlcA的合成：Glc-6-P在磷酸葡萄糖變位酶(EC 5．4．2．2)的作用下轉(zhuǎn)化為 Glc-1-P，隨后在 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(EC 2．7．7．9)的作用下轉(zhuǎn)化為UDP-葡萄糖(UDP-Glc)，最后在UDP-葡萄糖脫氫酶(EC 1．1．1．22)的作用下轉(zhuǎn)化為 UDP-GlcA。

UDP-GlcNAc的合成：經(jīng) Glc-6-P轉(zhuǎn)化而來的Fru-6-P 在葡萄糖胺合酶(EC 2．6．1．16)、磷酸葡糖胺變位酶(EC 5．4．2．10)、1-磷酸-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(EC 2．7．7．23) 的依次作用下轉(zhuǎn)化為UDP-GlcNAc。

UDP-GalNAc的合成：UDP-GlcNAc在差向異構(gòu)酶(EC 5．1．3．2)的作用下轉(zhuǎn)化為 UDP-GalNAc。

圖1 糖胺聚糖的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of glycosaminoglycans

2.2 糖胺聚糖的聚合與延伸

根據(jù)大腸桿菌(Escherichia coli)莢膜的基因型、生物合成方式和調(diào)控方式的差異將其分為group 1、group 2、group 3 和 group 4 四個類型［21］。硫酸軟骨素和肝素的生產(chǎn)菌株 E．coli K4、E．coli K5均屬于group 2，涉及莢膜多糖合成和轉(zhuǎn)運的基因成簇分布于染色體上，并且不同的K抗原基因簇有自身保守基因結(jié)構(gòu)，分別為region 1、region 2和region 3三個功能區(qū)，如圖2所示。其中，region 1和region 3負責莢膜多糖的修飾和跨膜運輸，而region 2位于region 1和region 3之間，主要負責莢膜多糖前體的合成和多糖鏈的聚合延伸，region 2的大小決定了K抗原的復雜程度［22］。

E．coli K4中 region 2總長度為 14 kb，包括kfoA～kfoG 7個基因和1個1．331 kb的轉(zhuǎn)座原件IS2。其中，kfoA、kfoF分別編碼前體 UDP-GlcA、UDP-GalNAc的差向異構(gòu)酶和 UDP-葡萄糖脫氫酶［23］;kfoC編碼軟骨素合成酶，具有雙功能糖基轉(zhuǎn)移酶活性，N端和C端分別具有UDP-GlcA和UDPGalNAc的轉(zhuǎn)移酶活性位點，可以交替轉(zhuǎn)移單糖前體至多糖鏈的非還原末端，從而不斷延伸多糖鏈［24］。

E．coli K5 的 region 2 總長度為 8．0 kb，包括kfiA～kfiD 4個基因，kfiA、kfiB和kfiC基因之間分別有一段插入序列。Northern blotting和轉(zhuǎn)錄實驗顯示region 2具有3個啟動子，這些啟動子不僅能使各自的基因進行轉(zhuǎn)錄，還能使整個region 2進行轉(zhuǎn)錄，包括基因之間的插入序列，表明了整個轉(zhuǎn)錄過程的復雜性［25］。肝素前體合成的4個基因具有各自的功能，kfiA、kfiD和kfiC分別編碼乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶、UDP-葡萄糖脫氫酶和糖基轉(zhuǎn)移酶，可催化UDPGlcNAc和UDP-GlcA轉(zhuǎn)化為GlcNAc和GlcA，后二者為合成肝素的重要前體［25］;kfiB編碼的酶在多糖鏈的延伸過程中具有蛋白支架的作用，可防止糖鏈延長的復合酶脫落，從而加強了肝素前體的合成［26］。

圖2 莢膜多糖合成基因簇Fig.2 The gene cluster for CPS biosynthesis

2.3 糖胺聚糖的修飾與轉(zhuǎn)運

Group 2莢膜多糖的生物合成大致可以分為4個階段，分別為多糖修飾基團 CMP-kdo的合成、CMP-kdo轉(zhuǎn)運修飾多糖鏈、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運載體(ATP binding cassette)轉(zhuǎn)運多糖至周質(zhì)空間、多糖鏈轉(zhuǎn)運至細胞外膜。過程中涉及修飾和轉(zhuǎn)運糖胺聚糖的酶位于功能區(qū)region 1和region 3。Region 1負責多糖修飾基團CMP-kdo的合成以及多糖鏈從周質(zhì)空間向細胞外膜的轉(zhuǎn)運，region 3通過ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運載體將多糖運出細胞內(nèi)膜［27］。

在透明質(zhì)酸的生物合成過程中，hasA、hasB和hasC基因分別編碼透明質(zhì)酸合成酶、UDP-葡萄糖脫氫酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，均位于HAS操縱子上［28］。鏈球菌(Streptococci)(A群)合成透明質(zhì)酸莢膜與HAS操縱子的表達息息相關(guān)。微生物合成透明質(zhì)酸不是前體在酶簡單催化作用下完成的，而是微生物細胞形成一個與原生質(zhì)膜相關(guān)的蛋白復合物來催化透明質(zhì)酸的合成和運輸。在Mg2+存在的條件下，A群鏈球菌以UDP-GlcA和UDP-GlcNAc為底物從內(nèi)源透明質(zhì)酸的非還原端合成透明質(zhì)酸分子鏈，合成過程中UDP-GlcNAc和UDP-GlcA交替連接在透明質(zhì)酸鏈上，以每分鐘約100個糖單位的速度進行［29-30］。

3 糖胺聚糖的生化工程策略

微生物的生產(chǎn)性能是由微生物固有的遺傳特性和生存環(huán)境共同作用的結(jié)果。野生型菌株通過物理、化學方法誘變或者代謝工程方法改造后，已經(jīng)成為具有發(fā)酵潛力的菌種，其潛在的優(yōu)異生產(chǎn)性能，還需要在人為精心設(shè)計的有利于目的產(chǎn)物或所需特性表現(xiàn)的優(yōu)化環(huán)境中才能表現(xiàn)出來。所以糖胺聚糖生化工程的研究是必須進行的重要步驟。優(yōu)化的環(huán)境條件，主要包括營養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基組分、特殊的營養(yǎng)物質(zhì)和誘導劑的種類;培養(yǎng)條件，如溫度、酸堿度、溶解氧濃度、培養(yǎng)模式和誘導策略等。

培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化處于營養(yǎng)條件的核心地位。培養(yǎng)基不僅影響微生物生長，為微生物提供碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水這六類營養(yǎng)要素，其組分還會影響目標產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率以及生產(chǎn)強度。此外，培養(yǎng)基的成本會直接影響發(fā)酵過程的經(jīng)濟效益和下游產(chǎn)品分離純化提取的難易程度。Cimini等［31］以野生型E．coli K4為出發(fā)菌株進行培養(yǎng)基的優(yōu)化，首先選擇葡萄糖和甘油作為碳源，酪蛋白和大豆蛋白胨作為氮源進行搖瓶實驗，最終選擇甘油和大豆蛋白胨，使得果糖軟骨素產(chǎn)量達到了1．4 g/L，另外，Restaino等［32］通過向培養(yǎng)基中添加特殊營養(yǎng)物質(zhì)，分別是K4莢膜多糖的前體物質(zhì)葡萄糖醛酸和氨基半乳糖、果糖，最終果糖軟骨素產(chǎn)量分別提高了68%和57%，其原因可能是葡萄糖醛酸和氨基半乳糖作為前體物質(zhì)被利用，而果糖作為碳源物質(zhì)增加了UDP-氨基半乳糖路徑的碳流。

高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)可能會抑制微生物細胞的生長，但是為了達到高細胞密度，往往又必須向生物反應器中流加經(jīng)過濃縮的營養(yǎng)物質(zhì)。其中，補料形式多種多樣，可以是最簡單的恒速補料，也可以是經(jīng)過數(shù)學模型計算而來的指數(shù)補料。E．coli高細胞密度發(fā)酵可以提高產(chǎn)品的產(chǎn)量，但是此過程產(chǎn)生的副產(chǎn)物乙酸不僅僅會影響細胞的生長，還會影響產(chǎn)物的合成，因此所采用的補料策略必須符合菌株的生理特性。Restaino等［10］采用三階段控制策略來實現(xiàn)E．coli K4高密度發(fā)酵，從而提高了果糖軟骨素的產(chǎn)量，第一階段采用分批發(fā)酵，維持7 h，第二階段采用恒速補料策略保證甘油質(zhì)量濃度超過0．3 g/L，維持5 h，第三階段在發(fā)酵過程中啟動微濾裝置排除低分子量的副產(chǎn)物，維持35 h，使得E．coli K4莢膜多糖(K4 capsular polysaccharide，K4CPS)的產(chǎn)量達到了4．73 g/L，分別是分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵的16倍和 3．3倍。Derosa等［11］以 EcK4r3為研究對象，采用上述三階段發(fā)酵策略，使得K4CPS的產(chǎn)量達到最高，為 9．2 g/L［11］。Zhang 等［18］以生產(chǎn)肝素前體最優(yōu)重組菌sABCD為出發(fā)菌株，考察了分批培養(yǎng)模式和補料分批培養(yǎng)模式(pH-stat補料、Do-stat補料、恒速補料、擬指數(shù)補料)對肝素前體合成的影響，最終在pH-stat補料模式下肝素前體產(chǎn)量達到了2．61 g/L。

溫度和pH能夠影響微生物體內(nèi)酶的活性，從而影響細胞內(nèi)生物化學反應的進行，對糖胺聚糖的合成以及微生物生長都會產(chǎn)生巨大影響。E．coli K4在20℃下幾乎不合成莢膜多糖，隨著培養(yǎng)溫度升高至37℃，莢膜多糖的量呈現(xiàn)線性關(guān)系［31］。吳明霞等［33］將獸疫鏈球菌發(fā)酵過程分為兩階段，在36℃的最佳溫度下培養(yǎng)28 h后轉(zhuǎn)入38℃培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束，透明質(zhì)酸的產(chǎn)量得到了顯著提高。

圖3 糖胺聚糖生產(chǎn)的代謝工程改造策略Fig.3 Strategies of metabolic engineering are used to produce glycosaminoglycan

4 糖胺聚糖的代謝工程策略

代謝工程技術(shù)作為一種成熟的改造策略，能夠有效地調(diào)控細胞代謝網(wǎng)絡(luò)，改善細胞性能，在纖維素乙醇生產(chǎn)、氨基酸等發(fā)酵行業(yè)取得了巨大成功。糖胺聚糖生產(chǎn)過程中代謝工程策略也發(fā)揮了不可替代的作用(圖3)：1)定向進化，作為蛋白質(zhì)改造的重要手段之一，能夠篩選出性能優(yōu)良的工程菌株;2)啟動子工程，調(diào)控關(guān)鍵基因的表達以實現(xiàn)路徑中碳流平衡;3)轉(zhuǎn)錄工程，控制基因的轉(zhuǎn)錄水平;4)模塊途徑工程，對糖胺聚糖合成代謝網(wǎng)絡(luò)進行全局優(yōu)化。

4.1 定向進化

定向進化技術(shù)作為蛋白質(zhì)改造的重要手段之一，主要由兩個關(guān)鍵步驟組成，一是通過人為引發(fā)的隨機突變獲得突變體庫，二是采用有效的高通量篩選技術(shù)得到性能優(yōu)良的突變菌株。該技術(shù)已經(jīng)應用于透明質(zhì)酸的生產(chǎn)過程并且取得了較好的效果。透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，HAase)家族可以分為3個大類，是降解透明質(zhì)酸的酶的總稱，透明質(zhì)酸酶不僅影響透明質(zhì)酸產(chǎn)量，而且還影響其分子量大小。Jin等［16］選擇了對水蛭透明質(zhì)酸酶基因LHyal的核糖體結(jié)合位點進行改造。首先以pSKIZH質(zhì)粒為模板進行反向全質(zhì)粒PCR獲得了庫容為104個克隆的突變體庫，然后進行高通量培養(yǎng)，根據(jù)平板上透明圈直徑的大小來篩選不同表達強度的水蛭透明質(zhì)酸酶的突變株，篩選得到的最優(yōu)重組菌株在3-L罐水平下采用補料分批發(fā)酵，產(chǎn)量和分子量分別為19．38 g/L和6．62×103。上述案例說明了借助定向進化技術(shù)，可以實現(xiàn)基因在翻譯水平上的精準調(diào)控，從而提高糖胺聚糖的產(chǎn)量。

4.2 啟動子工程

糖胺聚糖合成路徑復雜而且涉及的基因較多，因此如何平衡基因的表達是提高糖胺聚糖產(chǎn)率與得率的關(guān)鍵。啟動子工程廣泛用于路徑優(yōu)化，能夠調(diào)控基因的精細化表達，常用的基因表達調(diào)控策略包括：改造啟動子強度、核心區(qū)域、基因間隔區(qū)以及核糖體結(jié)合位點等［34-35］。果糖軟骨素的生產(chǎn)已經(jīng)運用了啟動子工程策略，為了提高E．coli K4生產(chǎn)果糖軟骨素的能力，將合成基因簇pR3啟動子3'端非編碼區(qū)(untranslated region)進行缺失突變，結(jié)果表明：當ops(operon polarity suppressor)序列(RfaH蛋白結(jié)合位點)存在時，UTR的長度變化與否不影響pR3啟動子強度和K4CPS產(chǎn)量;但當ops序列缺失時，UTR的延長，pR3啟動子的強度和K4CPS產(chǎn)量均低于對照菌株;反之，UTR的縮短能顯著提高pR3啟動子的強度，進而使K4CPS產(chǎn)量比原菌增加了46%，達到了751 mg/L［12］。另一個啟動子工程應用的實例也與果糖軟骨素的合成有關(guān)。Cimini等［36］通過采用不同強度的啟動子pTrc和T7來過量表達軟骨素合成酶基因 kfoC，結(jié)果表明，工程菌株BK4061、BK4062、BK4063生產(chǎn)果糖軟骨素的能力均高于野生型E．coli K4，最高產(chǎn)量為250 mg/L，較原菌提高了113%。Zhang等［18］利用雙啟動子共表達質(zhì)粒pETDeut-1和pRSFDeut-1表達來自E．coli K5的肝素前體合成酶基因簇kfiA、kfiB、kfiC和kfiD，構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pKfiA、pKfiB、pKfiC、pKfiD、pKfiAC 和pKfiBD，然后將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌株E．coli BL21(DE3)中，成功獲得工程菌株 sA、sC、sAC、sABC、sACD和sABCD，經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，工程菌株sABCD的產(chǎn)量達到了2．61 g/L，該研究為肝素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了優(yōu)良的生產(chǎn)菌株，并且為采用其他類型宿主構(gòu)建肝素高產(chǎn)工程菌株提供了依據(jù)。綜上所述，啟動子工程策略可以通過調(diào)控糖胺聚糖合成路徑中基因的表達水平，來實現(xiàn)代謝路徑碳流平衡，進而提高糖胺聚糖的產(chǎn)量。

4.3 轉(zhuǎn)錄工程

轉(zhuǎn)錄因子也稱反式作用因子，是一類具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達功能的DNA結(jié)合蛋白。從蛋白結(jié)構(gòu)分析，轉(zhuǎn)錄因子一般由DNA結(jié)合區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)(包括激活區(qū)或抑制區(qū))、寡聚化位點和核定位信號這四個功能區(qū)組成，轉(zhuǎn)錄因子可通過這些功能區(qū)域與啟動子順式元件作用或與其他轉(zhuǎn)錄因子的功能區(qū)相互作用來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程［37］。研究表明，全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子slyA和rfaH在果糖軟骨素生物合成中起重要的調(diào)控作用。吳秋林等［12］分別利用誘導型表達載體pTrcHisA和組成型表達載體pBluscript SK II(+)來過量表達slyA基因，成功構(gòu)建了工程菌株 E．coli THslyA和 E．coli BLpslyA。誘導型重組菌株E．coli THslyA中的slyA受強啟動子pTrc控制表達，slyA經(jīng)誘導劑IPTG誘導表達后，果糖軟骨素合成能力顯著增強，在搖瓶和5-L發(fā)酵罐水平下分別為1 g/L和 2．64 g/L，較原菌提高了82%和25%;組成型重組菌株 E．coli BLpslyA中的slyA基因由自身啟動子p10、p13和p14控制表達，菌體生長受到嚴重抑制，甘油消耗速率降低，果糖軟骨素的產(chǎn)量較原菌降低了 31%，為 0．37 g/L。RfaH是莢膜合成的決定性因子，在轉(zhuǎn)錄過程中與kpsM 5’端的非翻譯區(qū)的ops序列結(jié)合，與RNA聚合酶復合物相互作用調(diào)節(jié)region 2功能區(qū)的轉(zhuǎn)錄，ops序列和rfaH基因的缺失均導致莢膜合成缺陷［38-39］。Cimini等［40］分別通過利用質(zhì)粒和表達盒在 E．coli K4中過量表達 rfaH基因，構(gòu)建了菌株E．coli K4-pTrcrfaH和EcK4r3重組菌株，發(fā)酵結(jié)果與野生型E．coli K4相比，果糖軟骨素產(chǎn)量提高了40%～140%，最高產(chǎn)量達到了5．3 g/L。上述案例均說明了轉(zhuǎn)錄因子通過參與基因的表達調(diào)控，從而提高工程菌株生產(chǎn)糖胺聚糖的能力。

4.4 模塊途徑工程

傳統(tǒng)代謝工程通常是找出代謝節(jié)點，然后選擇合適的代謝改造方法例如基因敲除、過表達限速步驟基因、解除調(diào)控等來改變代謝流的分布，但是這些手段在解決代謝瓶頸的時候往往會給代謝路徑引入新的瓶頸。因此代謝路徑之間需要更優(yōu)的策略進行平衡，模塊途徑工程可以將代謝路徑分為不同模塊，然后構(gòu)建不同強度的模塊、組裝，最后對不同模塊進行表達優(yōu)化，進而得到最優(yōu)工程菌株。GlcNAc作為糖胺聚糖的前體物質(zhì)之一，它的多少與糖胺聚糖的產(chǎn)量息息相關(guān)。Liu等［41］利用模塊途徑工程策略生產(chǎn)GlcNAc可為糖胺聚糖的生產(chǎn)提供方向。通過將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)168胞內(nèi)代謝路徑分為GlcNAc合成模塊、糖酵解模塊和肽聚糖合成模塊：1)首先，通過雙啟動子策略優(yōu)化GlcNAc合成路徑中 GlcN-1-P-變位酶(GlmS)和GlcN-6-P-乙酰化酶(Gnal)的表達，敲除編碼副產(chǎn)物乳酸和乙酸的基因ldh和pta，得到最佳GlcNAc合成模塊;2)通過過表達不同sRNA和Hfq蛋白的組合，調(diào)控磷酸果糖激酶(Pfk)和 GlcN-1-P-變位酶(GlmM)表達，得到不同活性的糖酵解模塊和肽聚糖合成模塊;3)對3個模塊進行組裝。通過篩選，當GlcNAc合成模塊、糖酵解模塊和肽聚糖合成模塊表達水平分別為高、低、低時，重組菌株單位細胞生產(chǎn)生產(chǎn)GlcNAc能力最強，達到了2．00 g/g，是對照菌株的4．3倍。利用 E．coli BL21 StarTM(DE3)異源表達生產(chǎn)軟骨素這一案例也運用了模塊路徑工程策略?；騥foA、kfoF和kfoC編碼的酶直接影響UDP-GlcA合成模塊、UDP-GalNAc合成模塊、軟骨素聚合模塊，He等［13］首次將這3個基因以不同的順序組合到仿操縱子體系中，并對3個基因的表達強度進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，當kfoA、kfoC和kfoF的表達強度分別為高、中、低時，采用補料分批培養(yǎng)模式，最優(yōu)工程菌株軟骨素產(chǎn)量達到了2．4 g/L，與野生型E．coli K4生產(chǎn)水平相當。綜上兩個實例表明，利用模塊途徑工程策略，能夠有效地平衡代謝路徑上碳流的分布，解決代謝路徑瓶頸，從而使糖胺聚糖產(chǎn)量達到最大化。

5 結(jié)語與展望

近年來，國內(nèi)外研究人員已經(jīng)將生化工程和代謝工程策略應用到糖胺聚糖的生產(chǎn)過程中，并且取得了不錯的成績。特別是利用代謝工程策略構(gòu)建的生產(chǎn)菌株，分別包括：定向進化技術(shù)、啟動子工程、轉(zhuǎn)錄工程和模塊途徑工程等，為糖胺聚糖工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅實基礎(chǔ)。然而，由于微生物自身代謝的經(jīng)濟學本能、工業(yè)環(huán)境與自然環(huán)境的巨大差異造成了糖胺聚糖產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強度低。因此，如何協(xié)調(diào)代謝工程新策略和生化工程手段來獲得高性能的生產(chǎn)菌株并且實現(xiàn)糖胺聚糖的高效生產(chǎn)是未來的研究熱點和重點，包括：1)糖胺聚糖的合成與細胞生長所需的代謝途徑相互競爭，可以通過開關(guān)工程來實現(xiàn)產(chǎn)物合成與細胞生長相分離，從而提高糖胺聚糖的得率;2)糖胺聚糖代謝網(wǎng)絡(luò)比較簡單，但是相關(guān)代謝十分復雜，涉及的基因較多，可采用模塊路徑工程策略優(yōu)化糖胺聚糖合成與轉(zhuǎn)運路徑上基因的表達;3)重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及對宿主菌的代謝負擔，可利用定向進化技術(shù)對基因組進行改造，實現(xiàn)糖胺聚糖合成途徑關(guān)鍵酶的整合表達;4)研究高密度培養(yǎng)細胞與高強度產(chǎn)物合成的兩階段發(fā)酵策略，實現(xiàn)糖胺聚糖發(fā)酵法生產(chǎn)的高產(chǎn)量、高產(chǎn)率和高生產(chǎn)強度的統(tǒng)一，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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(責任編輯 管珺)

Recent advances in microbial production of glycosaminoglycans

ZHANG Quan1，2，3，CHEN Xiulai1，2，3，LIU Jia1，2，3，LUO Qiuling1，2，3，LIU Liming1，2，3(1．State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;
2．Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;3．Laboratory of Food Microbial-Manufacturing Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Glycosaminoglycans is a class of linear chain acidic polysaccharide with many physiological functions，and widely applied in the industries of cosmetics，health products and pharmaceuticals．Based on the demand of eco-friendly process，production safety and sustainable development，microbial production of glycosaminoglycans has been paid more and more attention．In this article，we reviewed the biosynthetic pathway of glycosaminoglycans．Then，we discussed the detailed strategies to improve the production of glycosaminoglycans through biochemical engineering and metabolic engineering．Finally，we predicted future directions for further improving glycosaminoglycans production．

glycosaminoglycans;metabolic pathway;biochemical engineering;metabolic engineering

TQ929;Q78

A

1672-3678(2017)05-0040-08

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．005

2017-06-07

國家自然科學基金(21676118);江南大學自主科研計劃重點項目(JUSRP51611A)

張 權(quán)(1991—)，男，安徽安慶人，研究方向：代謝工程;劉立明(聯(lián)系人)，教授，E-mail：mingll@jiangnan．edu．cn