萬 春，萬青青，熊 亮，趙心清，白鳳武

(1．上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240;2．大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024)

過表達(dá)MRP8提高釀酒酵母乙酸耐性及乙醇發(fā)酵效率

萬 春1，2，萬青青1，熊 亮2，趙心清1，白鳳武1

(1．上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240;2．大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024)

乙酸是木質(zhì)纖維素水解液中含量較多的抑制物，因此提高釀酒酵母菌株對(duì)乙酸的耐受性有助于提高纖維素乙醇生產(chǎn)效率。本文中，筆者利用基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)過表達(dá)了釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288c線粒體核糖體蛋白編碼基因MRP8，并比較了過表達(dá)MRP8的菌株與對(duì)照菌株的生長(zhǎng)和發(fā)酵特性。平板耐性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MRP8過表達(dá)明顯提高了菌株的乙酸脅迫耐受性;乙醇發(fā)酵結(jié)果表明，在4．8 g/L乙酸脅迫條件下，過表達(dá)菌株MRP8-3在51 h消耗全部的葡萄糖，發(fā)酵時(shí)間縮短了25 h，顯著優(yōu)于相同時(shí)間的對(duì)照菌株。本研究結(jié)果為構(gòu)建高效纖維素乙醇發(fā)酵的釀酒酵母菌株提供了新思路。

釀酒酵母;MRP8;乙酸脅迫耐受性;乙醇發(fā)酵;CRISPR/Cas9;基因組編輯

纖維素乙醇作為清潔可再生能源，是重要的傳統(tǒng)化石燃料替代品，具有良好的應(yīng)用前景;然而纖維素原料預(yù)處理過程產(chǎn)生弱酸類、酚類和醛類等抑制物，顯著影響微生物的生長(zhǎng)和發(fā)酵特性［1］。在纖維素預(yù)處理過程中產(chǎn)生的抑制物中，乙酸的量最高，可達(dá)15 g/L［2］。高濃度的乙酸能引起細(xì)胞內(nèi)線粒體的損傷以及胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)積累，從而降低釀酒酵母生產(chǎn)纖維素乙醇的效率［3］。雖然可通過調(diào)節(jié)pH緩解乙酸對(duì)釀酒酵母細(xì)胞的抑制，但是堿液的使用會(huì)提高生產(chǎn)成本。如果釀酒酵母可以在高濃度乙酸抑制條件下正常生長(zhǎng)和發(fā)酵，能更有利于工業(yè)化應(yīng)用［4］。因此，提高酵母細(xì)胞對(duì)乙酸脅迫的耐受性成為亟需解決的問題。

近年來，基于CRISPR/Cas9的基因組編輯技術(shù)在釀酒酵母中得到快速發(fā)展［5-6］。利用基因組編輯技術(shù)可實(shí)現(xiàn)快速多基因同時(shí)操作，可避免在工業(yè)釀酒酵母基因組中留下抗性標(biāo)記，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。

筆者所在課題組前期利用過表達(dá)ARO7、GRX5、PPR1和SET5，或者敲除ADY2，構(gòu)建了乙酸耐性以及乙醇發(fā)酵效率提高的釀酒酵母菌株［7-10］。近期蛋白組分析發(fā)現(xiàn)，在乙酸耐性提高的菌株中，Mrp8p表達(dá)量顯著上調(diào)(未發(fā)表結(jié)果)。Mrp8p屬于線粒體核糖體蛋白家族，其編碼基因MRP8位于釀酒酵母XI染色體上［11］，當(dāng)細(xì)胞壁出現(xiàn)損傷時(shí)，該基因上調(diào)1．2～1．6 倍［12］，但是，MRP8 過表達(dá)對(duì)釀酒酵母乙酸耐性的影響目前還不清楚。因此，本文中，筆者利用基于CRISPR/Cas9的基因組編輯技術(shù)，在釀酒酵母S288c中過表達(dá)MRP8，研究它對(duì)乙酸耐性和乙醇發(fā)酵性能的影響，以期為進(jìn)一步高效纖維素乙醇生產(chǎn)菌株的選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1．1．1 菌種與質(zhì)粒

釀酒酵母S．cerevisiae S288c和DNA克隆宿主Escherichia coli DH5α保存于微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;Cas9表達(dá)質(zhì)粒為具有諾爾絲菌素抗性的Cas9-NAT［13］，gRNA表達(dá)質(zhì)粒為具有潮霉素 B抗性的pRS42H_gRNA_20以及含有MRP8基因的載體pRS42H-Ppgk1-MRP8-Tcyc1，均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。其中pRS42H_gRNA_20靶向基因間隔區(qū)YPRCdelta15位點(diǎn)，其23堿基靶向序列為GGAATATTGGGTCAGATGAATGG。

1．1．2 主要試劑和培養(yǎng)基

諾爾絲菌素，北京中生瑞泰科技有限公司;基因組和質(zhì)粒提取試劑盒、酵母粉蛋白胨等試劑及其他抗生素等，上海生工生物工程股份有限公司;實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，日本TaKaRa公司;PCR試劑，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司;RT-qPCR儀器，美國(guó)Bio-Rad公司;引物委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，葡萄糖20，酵母粉10;

乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 3，葡萄糖 100，酵母粉4。

1.2 MRP8過表達(dá)菌株構(gòu)建

用20_Ppgk-F(CTTAAGATGCTCTTCTTATTCTATTAAAAATAGAAAATGAAGGCATTTGCAAGAATTACTCGTG)和20_Tcyc1-R(GTTTGTTTGCGAAACCCTATGCTCTGTTGTTCGGATTTGATCATGTAATTAGTTATGTCACG)引物從pRS42H-Ppgk1-MRP8-Tcyc1載體上擴(kuò)增轉(zhuǎn)化元件，其中包含釀酒酵母S288c染色體XVI上整合位點(diǎn)(YPRCdelta15)的上游同源臂、PGK1啟動(dòng)子、MRP8基因、CYC1終止子以及整合位點(diǎn)的下游同源臂。

通過醋酸鋰方法［14］將Cas9-NAT質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母S288c后，用100 mg/L諾爾絲菌素篩選得到轉(zhuǎn)化子。將pRS42H_gRNA_20質(zhì)粒和含有MRP8基因純化后的PCR產(chǎn)物以相同方法同時(shí)轉(zhuǎn)化到含有Cas9-NAT質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子中;然后用100 mg/L諾爾絲菌素和300 mg/L潮霉素B篩選轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑選單克隆轉(zhuǎn)化子命名為MRP81-5，并提取基因組，用Ppgk-F和Tcyc1-R引物通過PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化元件，驗(yàn)證獲得正確的轉(zhuǎn)化子;然后將MRP8-1～4在無抗性的YPD培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)接5次(每24 h轉(zhuǎn)接1次)，丟失Cas9-NAT和pRS42H_gRNA_20質(zhì)粒;然后保存于-80℃冰箱中。

1.3 菌種活化、耐性測(cè)試和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1．3．1 菌種活化

從-80℃冰箱中取出保存的轉(zhuǎn)化子MRP8-1～4在液體YPD培養(yǎng)基中，在30℃、150 r/min過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1．3．2 耐性試驗(yàn)

將對(duì)數(shù)期的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液OD調(diào)為一致(OD600為1．0)，按照10倍梯度稀釋，取 2 μL分別點(diǎn)樣于無脅迫條件的5 g/L乙酸和5 mmol/L H2O2的YPD平板，在菌株充分生長(zhǎng)后照相記錄。

1．3．3 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)化子MRP8-3活化后轉(zhuǎn)接到50 mL YPD液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)過夜，然后收集菌體，接種于含100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，初始OD600均調(diào)節(jié)為0．05左右;在30℃、150 r/min條件下培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加或者添加4．8 g/L乙酸。發(fā)酵過程中每3～10 h定時(shí)取樣測(cè)OD600、葡萄糖和乙醇含量;當(dāng)葡萄糖低于1．0 g/L時(shí)認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束。實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)平行，重復(fù)2次。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已建立的方法分析發(fā)酵液中的代謝物［9］。

1.4 RNA提取及實(shí)時(shí)定量(RT-qPCR)分析

利用RNA提取試劑盒提取對(duì)數(shù)期菌株的細(xì)胞總RNA，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的方法進(jìn)行RT-qPCR分析［9］。由于MSN2和SOD1均和乙酸脅迫響應(yīng)相關(guān)，因此也做了分析;所用引物序列分別為rtMSN2-F(TATCACCATTTCCCACAGCA)和rtMSN2-R(CACCATTGCCAGTTGAGTTG)、rtSOD1-F(TGTCTCTGCTGGTCCTCACTTC)和rtSOD1-R(CACACCATTTTCGTCCGTCTT)、rtMRP8-F(CTGGAAGGTAAGGTGGAAGC)和

rtMRP8-R(AGATAGCGGGCAACATCATT)。以ALG9為內(nèi)參基因［15］，所用引物為rtALG9-F(ATCGTGAAATTGCAGGCAGCTTGG)和rtALG9-R(CATGGCAACGGCAGAAGGCAATAA)，以 2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量［15］。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因MRP8過表達(dá)對(duì)酵母細(xì)胞耐受性影響的檢測(cè)

利用基于CRISPR/Cas9的基因組編輯技術(shù)將含有MRP8基因的轉(zhuǎn)化元件定點(diǎn)整合到釀酒酵母S288c染色體XVI的YPRCdelta15位點(diǎn)，并且通過Ppgk-F(GTCGTACGACTGTAATTGCTTTTAG)和Tcyc1-R(GCAAATTAAAGCCTTCGAGCGT)引物進(jìn)行驗(yàn)證，表明得到了正確的轉(zhuǎn)化子;然后通過點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)初步評(píng)價(jià)了隨機(jī)挑選的4個(gè)轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)性能。圖1為釀酒酵母S288c中過表達(dá)MRP8對(duì)生長(zhǎng)性能的影響。由圖1可知：在無脅迫條件下，過表達(dá)菌株MRP8-1～4的生長(zhǎng)性能和對(duì)照相差不大;但是當(dāng)培養(yǎng)基中添加5 g/L乙酸時(shí)(圖1(b))，過表達(dá)菌株生長(zhǎng)狀態(tài)明顯優(yōu)于對(duì)照，其中MRP8-2、3和4提高了約1 000倍，MRP8-1提高了約100倍。但是在含有5 mmol/L H2O2的平板上過表達(dá)菌株與對(duì)照相差不大。

文獻(xiàn)［16］指出，在YPRCdelta15號(hào)位點(diǎn)整合基因具有較高的綠色熒光蛋白表達(dá)量，因此本實(shí)驗(yàn)在此強(qiáng)整合位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了MRP8的過表達(dá)。隨機(jī)選擇了轉(zhuǎn)化子MRP8-3進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究對(duì)乙酸脅迫條件下乙醇發(fā)酵的影響。

圖1 基因MRP8過表達(dá)對(duì)釀酒酵母細(xì)胞生長(zhǎng)性能的影響Fig.1 Effects of overexpressing MRP8 on S．cerevisiae S288c growth ability

2.2 基因MRP8過表達(dá)對(duì)釀酒酵母發(fā)酵性能的影響

考察不同濃度乙酸對(duì)釀酒酵母菌株的影響，發(fā)現(xiàn)2．4和3．6 g/L乙酸添加條件下，不同菌株的發(fā)酵性能差別不大，推測(cè)在這兩個(gè)濃度下對(duì)釀酒酵母未產(chǎn)生明顯脅迫抑制。而添加5 g/L乙酸導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)非常緩慢，所以選擇4．8 g/L乙酸脅迫進(jìn)行液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)比較，先考察無乙酸脅迫條件下釀酒酵母菌株及過表達(dá)菌株的生長(zhǎng)及發(fā)酵性能，結(jié)果見圖2。由圖2可知：在無乙酸脅迫條件下，過表達(dá)菌株MRP8-3在培養(yǎng)6～27 h時(shí)的OD稍微高于對(duì)照組，二者的最大OD600分別為2．98和2．76，但是葡萄糖消耗和乙醇產(chǎn)量差別不大。其中，選取對(duì)數(shù)期(9 h)的酵母細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR分析，過表達(dá)菌株MRP8-3和對(duì)照菌株的 OD600分別為 1．38 和 1．00。

考察在4．8 g/L乙酸脅迫條件下，過表達(dá)菌株與對(duì)照菌株的發(fā)酵性能，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：過表達(dá)菌株MRP8-3的延滯期比對(duì)照菌株縮短24 h;選取對(duì)數(shù)期的酵母細(xì)胞用于RT-qPCR分析，其中過表達(dá)菌株MRP8-3和對(duì)照菌株的取樣時(shí)間點(diǎn)分別為29 和 54 h，對(duì)應(yīng)的 OD600值分別為1．11 和 1．01，盡量選擇OD值相近的酵母細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR，以降低不同生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。由于發(fā)酵后期酵母細(xì)胞在乙酸脅迫條件下出現(xiàn)了聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致OD值誤差較大。但是從葡萄糖和乙醇含量變化亦能觀察到過表達(dá)菌株MRP8-3的發(fā)酵性能明顯優(yōu)于對(duì)照菌株，并且在51 h消耗完所有葡萄糖。過表達(dá)菌株MRP8-3在54 h達(dá)到最高乙醇質(zhì)量濃度43．59 g/L，略低于對(duì)照菌株在76 h的44．73 g/L，但對(duì)照菌株在76 h仍殘留中仍剩余約5 g/L葡萄糖。

圖2 過表達(dá)菌株與對(duì)照菌株在無乙酸條件下的發(fā)酵性能比較Fig.2 Comparison of fermentation performances between overexpression strains and control strain without acetic acid

圖3 過表達(dá)菌株與對(duì)照菌株在4.8 g/L乙酸條件下的發(fā)酵性能比較Fig.3 Comparison of fermentation performances between overexpression strains and control strain with 4.8 g/L acetic acid

表1為過表達(dá)菌株和對(duì)照菌株在含有4．8 g/L乙酸的培養(yǎng)基中乙醇發(fā)酵的各指標(biāo)。由表1可以看出：過表達(dá)MRP8基因可明顯縮短發(fā)酵時(shí)間，提高乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度，且對(duì)乙醇得率影響不大。細(xì)胞通過合成分泌甘油來抵抗外界脅迫［17］，因此在過表達(dá)菌株和對(duì)照菌株的發(fā)酵液中均檢測(cè)到甘油;此外，對(duì)照菌株中的甘油含量比過表達(dá)菌株高出了約86%，表明MRP8基因的過表達(dá)能提高細(xì)胞對(duì)乙酸的耐性，無需合成較多的甘油作為保護(hù)劑。由此也說明Mrp8p可能在酵母細(xì)胞抵抗乙酸脅迫中發(fā)揮重要作用。

表1 在4.8 g/L乙酸脅迫條件下MRP8過表達(dá)菌株和對(duì)照菌株的發(fā)酵性能匯總Table 1 Summary of fermentation performance between MRP8 overexpressing strains and control strain with 4.8 g/L acetic acid

2.3 RT-qPCR分析

圖4為RT-qPCR分析過表達(dá)MRP8菌株中基因表達(dá)量結(jié)果。由圖4可知：在無乙酸脅迫條件下，過表達(dá)菌株MRP8-3中MRP8相對(duì)表達(dá)量稍微提高，在4．8 g/L乙酸脅迫條件下，MRP8相對(duì)表達(dá)量在過表達(dá)菌株MRP8-3中提高了約11倍，這揭示該基因轉(zhuǎn)錄受到乙酸脅迫的誘導(dǎo)。過表達(dá)菌株MRP8-3中SOD1表達(dá)量在無脅迫條件下沒有太大變化，而在乙酸脅迫條件下明顯下調(diào)。高濃度乙酸會(huì)引起細(xì)胞器損傷，脅迫DNA復(fù)制而加速細(xì)胞衰老［3，18］，同時(shí)高濃度乙酸會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)積累［19］，而與胞內(nèi)氧化脅迫有關(guān)的SOD1的相對(duì)表達(dá)量明顯下調(diào)，表明Mrp8p過表達(dá)有利于清除胞內(nèi)ROS，因此不需要過表達(dá)SOD1。過表達(dá)菌株MRP8-3中MSN2基因在非脅迫條件下顯著上調(diào)，但在乙酸脅迫條件下 MSN2變化不明顯。Msn2p是脅迫響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［20］，推測(cè)MSN2在MRP8過表達(dá)菌株脅迫條件下的耐性提高沒有起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。此外，MRP8表達(dá)量與Bur6p、Cst6p、Gcn5p 和 Sua7p 調(diào)節(jié)因子有關(guān)［21-22］，這些調(diào)節(jié)因子也是以后進(jìn)一步研究該基因調(diào)控機(jī)理的重要內(nèi)容。

圖4 RT-qPCR分析過表達(dá)MRP8菌株中基因表達(dá)量Fig.4 Analysis of genes expression level in the overexpressing MRP8 strains via RT-qPCR

3 結(jié)論

本研究首次報(bào)道了過表達(dá)MRP8基因能提高釀酒酵母的乙酸耐受性，同時(shí)提高了乙酸脅迫條件下的乙醇發(fā)酵水平。在4．8 g/L乙酸脅迫條件下，過表達(dá)菌株乙醇強(qiáng)度最高達(dá)到0．85 g/(L·h)，比對(duì)照菌株提高了44%。本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)現(xiàn)了多種提高乙酸耐性的基因操作靶點(diǎn)，本研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了酵母細(xì)胞乙酸耐性機(jī)理，對(duì)MRP8的深入研究有望進(jìn)一步完善釀酒酵母的乙酸耐性機(jī)理，構(gòu)建穩(wěn)定高效的纖維素乙醇發(fā)酵菌株。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Improvement of acetic acid tolerance of Saccharomyces cerevisiae by overexpression of mitochondrial ribosomal protein encoding gene MRP8 for efficient lignocellulosic ethanol production

WAN Chun1，2，WAN Qingqing1，XIONG Liang2，ZHAO Xinqing1，BAI Fengwu1
(1．State Key Laboratory of Microbial Metabolism，School of Life Sciences and Biotechnology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China;2．School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024，China)

Acetic acid is one of the major inhibitors derived from the hydrolysis of lignocellulosic biomass，and enhancing the tolerance of Saccharomyces cerevisiae to acetic acid is of great importance for improving the lignocellulosic ethanol production．Here，we overexpressed mitochondrial ribosomal protein encoding gene MRP8 via CRISPR/Cas9-based genome editing in S．cerevisiae S288c，and compared the growth and fermentation performance between the mutants with MRP8 and the wild type．The tolerance to acetic acid was increased by overexpression MRP8 on agar plates．Also，mutant MRP8-3 consumed all glucose within 51 h in the presence of 4．8 g/L acetic acid，and the fermentation time was shortened by 25 h，indicating the mutant was superior to the wild type．Our findings provide a novel strategy for constructing robust yeast strains for efficient lignocellulosic ethanol fermentation．

Saccharomyces cerevisiae;MRP8;acetic acid tolerance;ethanol fermentation;CRISPR/Cas9;genome editing

TQ920．1

A

1672-3678(2017)05-0080-06

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．010

2017-07-14

國(guó)家自然科學(xué)基金(21376043、31461143029);國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA021205、2012AA101805)

萬 春(1989—)，男，河南信陽人，博士，研究方向：生物化工;趙心清(聯(lián)系人)，教授，E-mail：xqzhao@sjtu．edu．cn