鄢芳清，韓亞昆，李 娟，李燕軍，2，3，徐慶陽，2，3，陳 寧，2，3，謝希賢，2，3

(1．天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457;2．代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457;3．天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

大腸桿菌芳香族氨基酸代謝工程研究進(jìn)展

鄢芳清1，韓亞昆1，李 娟1，李燕軍1，2，3，徐慶陽1，2，3，陳 寧1，2，3，謝希賢1，2，3

(1．天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457;2．代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457;3．天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

芳香族氨基酸包括L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-酪氨酸(L-Tyr)和L-色氨酸(L-Trp)，是生物體內(nèi)非常重要的必需氨基酸，具有重要的生物學(xué)功能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料等領(lǐng)域。本文中，筆者介紹了芳香族氨基酸的生物合成途徑以及代謝調(diào)控，綜述了構(gòu)建大腸桿菌芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株的代謝工程策略。針對現(xiàn)階段工業(yè)化生產(chǎn)芳香族氨基酸存在的問題，筆者對進(jìn)一步應(yīng)用代謝工程策略改造芳香族氨基酸菌株進(jìn)行了展望。

芳香族氨基酸;大腸桿菌;代謝工程

芳香族氨基酸包括L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-酪氨酸(L-Tyr)和L-色氨酸(L-Trp)，是生物體內(nèi)非常重要的必需氨基酸，具有重要的生物學(xué)功能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料等領(lǐng)域［1］。L-酪氨酸常作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑以及L-多巴和對羥基肉桂酸等醫(yī)藥化工產(chǎn)品的制備原料，被廣泛應(yīng)用在食品、飼料、醫(yī)藥和化工等行業(yè)［2］。L-色氨酸被稱為第二必需氨基酸，近些年飼料添加劑方面的用量增長快速，已成為第四大飼料氨基酸［3］。L-苯丙氨酸及其衍生物具有抗高血壓作用，也是合成抗癌藥物中間體的良好載體，L-苯丙氨酸與L-天冬氨酸縮合生成甜味劑天冬甜二肽，適合于減肥和糖尿病人使用［4］。近年來，色氨酸和苯丙氨酸的市場需求量逐年增加［5］，巨大的市場對芳香族氨基酸的工業(yè)化生產(chǎn)提出了更高要求。

芳香族氨基酸的生產(chǎn)方法有提取法、化學(xué)合成法、酶法及微生物發(fā)酵法。提取法和化學(xué)合成法最早應(yīng)用于生產(chǎn)芳香族氨基酸，但存在原材料有限、工藝復(fù)雜、所得產(chǎn)品純度較低等問題，因而已逐漸被淘汰;而利用芳香族氨基酸合成酶系的酶法雖然可以得到純度較高的產(chǎn)品，但其所需要的前體物吲哚、鄰氨基苯甲酸和L-絲氨酸等價格較高，很難進(jìn)行大規(guī)?？刂粕a(chǎn);微生物發(fā)酵法是以葡萄糖或糖蜜等廉價原料通過發(fā)酵生產(chǎn)芳香族氨基酸，由于其生產(chǎn)成本相對較低，生產(chǎn)工藝相對簡單可控，已經(jīng)成為芳香族氨基酸最具有前景的生產(chǎn)方法［1］。芳香族氨基酸生物合成代謝途徑長而復(fù)雜，無論從自然界中篩選獲得具有產(chǎn)酸能力的菌株，或是采用經(jīng)典的物理化學(xué)誘變，獲得具備工業(yè)化生產(chǎn)潛力的高效芳香族氨基酸菌株難度很大。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用代謝工程策略構(gòu)建高產(chǎn)的基因工程菌株是近年來芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株選育的新熱點(diǎn)［6-7］。利用代謝工程策略構(gòu)建芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株已經(jīng)取得許多突破性的進(jìn)展(表1)，但與谷氨酸和賴氨酸等大宗氨基酸相比，發(fā)酵法生產(chǎn)芳香族氨基酸的糖酸轉(zhuǎn)化率偏低，并且工業(yè)化生產(chǎn)控制難度大，因此，繼續(xù)通過芳香族氨基酸合成途徑合理設(shè)計(jì)和代謝改造顯得尤為重要。

表1 代謝工程構(gòu)建大腸桿菌芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株Table 1 Construction of AAAs producing strains by metabolic engineering

1 芳香族氨基酸生物合成途徑及其調(diào)控

大腸桿菌遺傳背景清楚、載體受體系統(tǒng)完備、生長迅速、基因操作相對簡單，適合利用代謝工程方法構(gòu)建芳香族氨基酸高產(chǎn)菌株［6-7］。大腸桿菌中芳香族氨基酸生物合成途徑分為中心代謝途徑、共同途徑和分支途徑。圖1為大腸桿菌中芳香族氨基酸的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制。其中，芳香族氨基酸的中心代謝途徑指葡萄糖經(jīng)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)轉(zhuǎn)運(yùn)后分別進(jìn)入糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑產(chǎn)生磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和赤蘚糖-4-磷酸(E4P);共同途徑又稱莽草酸途徑，指PEP和E4P縮 合 生 成 3-脫 氧-σ-阿 拉 伯 庚 酮 糖 酸-7-磷 酸(DAHP)后經(jīng)六步反應(yīng)生成分支酸;分支途徑指分支酸作為3種芳香族氨基酸共同前體物經(jīng)不同酶催化形成相對應(yīng)的芳香族氨基酸［16］。

圖1 大腸桿菌中的芳香族氨基酸生物合成途徑及其代謝調(diào)節(jié)機(jī)制Fig.1 Biosynthetic pathway and metabolic regulation mechanism of aromatic amino acids in E．coli

如圖1所示，大腸桿菌的芳香族氨基酸合成途徑中許多關(guān)鍵限速酶的酶活或表達(dá)強(qiáng)度受到代謝終產(chǎn)物的強(qiáng)烈反饋抑制或阻遏，如L-色氨酸合成途徑中的鄰氨基苯甲酸合成酶(TrpE)，L-苯丙氨酸和L-酪氨酸合成途徑中的雙功能酶分支酸異構(gòu)酶和預(yù)苯酸脫水酶(PheA，TyrA)。在大腸桿菌芳香族氨基酸的合成途徑中，其關(guān)鍵酶受到的轉(zhuǎn)錄阻遏調(diào)控是由TrpR蛋白和TyrR蛋白實(shí)現(xiàn)的，在L-苯丙氨酸或L-酪氨酸難度較高的情況下，TyrR蛋白與其結(jié)合形成有活性的阻遏蛋白，阻止關(guān)鍵酶基因aroG以及代謝通路中其他基因的表達(dá)。而在L-色氨酸濃度較高的情況下，TrpR蛋白與L-色氨酸結(jié)合后，形成有活性的阻遏蛋白，阻止色氨酸操縱子及關(guān)鍵酶基因aroH的轉(zhuǎn)錄。另外，在野生型大腸桿菌中的色氨酸操縱子與pheA基因的上游均存在編碼前導(dǎo)肽的序列，該序列能編碼弱化子的形成，一旦有L-色氨酸或L-苯丙氨酸過量積累，弱化子將會形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄將會停止［6-7，16］。由于大腸桿菌中上述復(fù)雜的反饋抑制和阻遏機(jī)制的存在，大腸桿菌積累芳香族氨基酸的能力受到嚴(yán)重制約。因此，解除芳香族氨基酸合成途徑中相關(guān)關(guān)鍵酶的反饋抑制并解除其轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控，是利用代謝工程策略構(gòu)建大腸桿菌芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株的重要環(huán)節(jié)。

2 構(gòu)建芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株的代謝工程策略

代謝工程主要是指通過對細(xì)胞內(nèi)代謝相關(guān)的酶、物質(zhì)運(yùn)輸和調(diào)節(jié)機(jī)制等的改造，從而達(dá)到提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。在代謝控制發(fā)酵的理論指導(dǎo)基礎(chǔ)上，大部分氨基酸和核苷酸等生產(chǎn)菌株的代謝工程策略可總結(jié)為“進(jìn)”“通”“節(jié)”“堵”“出”的五字策略。相類似地，大腸桿菌芳香族氨基酸的代謝工程改造也可以由該五字策略來總結(jié)。

2.1 “進(jìn)”“出”——糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)與芳香族氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的改造

大腸桿菌在利用外界葡萄糖時，主要利用磷酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(PTS)轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行代謝，每轉(zhuǎn)運(yùn)1分子葡萄糖都要消耗1分子PEP轉(zhuǎn)化為PYR(圖1)。在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)體系中，PTS系統(tǒng)消耗近50%的PEP來轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖［17］。PEP是參與芳香族氨基酸合成途徑的直接前體物，也可以直接參與ATP的合成，與TCA循環(huán)中物質(zhì)能量代謝有直接的聯(lián)系，所以對于構(gòu)建大腸桿菌芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株，PTS系統(tǒng)的代謝工程改造顯得尤為重要。由于涉及能量代謝，完全失活PTS系統(tǒng)可能會造成大腸桿菌本身生長和葡萄糖利用受到限制，大部分涉及PTS系統(tǒng)的改造均選擇通過其他糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)替換PTS系統(tǒng)。近年來，涉及PTS系統(tǒng)改造的代謝工程策略主要應(yīng)用于芳香族氨基酸途徑中的中間代謝產(chǎn)物莽草酸生產(chǎn)菌株的改造，并且大部分研究者依舊停留在構(gòu)建質(zhì)粒過表達(dá)相關(guān)基因的水平上，很少見染色體水平上的改造報(bào)道［18］。

對大腸桿菌而言，除了可以利用PTS系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖外，還可以利用半乳糖透過酶(GalP)介導(dǎo)的葡萄糖激酶轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，但是該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)只有在胞外葡萄糖濃度很低時才會被乳糖誘導(dǎo)［17-20］。在構(gòu)建大腸桿菌莽草酸生產(chǎn)菌時，研究者在失活PTS系統(tǒng)的同時，通過增強(qiáng)兩條不消耗PEP的糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，以達(dá)到減少前體物PEP消耗的目的。其一是過表達(dá)大腸桿菌自身的galP基因和glk基因，以強(qiáng)化GalP介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，提高葡萄糖的利用率［19-20］;其二是采用Zymomonas mobilis的葡萄糖透過酶(Glf)和葡萄糖激酶(Glk)介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)替換PTS系統(tǒng)［21-22］。通過在大腸桿菌的PTS缺陷型菌株中表達(dá)含Zymomonas mobilis的glf基因和glk基因的質(zhì)粒，可以彌補(bǔ)由于PTS缺陷造成的葡萄糖利用速度下降帶來的不利影響。Chandran等［23］在構(gòu)建大腸桿菌芳香族氨基酸中間代謝產(chǎn)物莽草酸生產(chǎn)菌株時，在PTS缺陷的大腸桿菌中過表達(dá)關(guān)鍵酶的同時過表達(dá)glf和glk基因，可在10 L發(fā)酵罐中積累莽草酸達(dá)84 g/L，產(chǎn)率為33%。對于大腸桿菌芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株構(gòu)建而言，失活PTS系統(tǒng)，同時強(qiáng)化非PTS的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，同樣有助于提高產(chǎn)率與糖酸轉(zhuǎn)化率。由于非PTS的糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的能力不足以彌補(bǔ)PTS系統(tǒng)的缺失，因此生產(chǎn)菌株的生長和糖代謝會減慢，有可能會導(dǎo)致發(fā)酵的強(qiáng)度降低。

在大腸桿菌中，芳香族氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要有3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與：Mtr、TnaB和 AroP，其中，Mtr和TnaB特異性吸收L-色氨酸，Mtr作為高特異性L-色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也參與中間代謝產(chǎn)物吲哚的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，AroP是可以吸收3種芳香族氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［5］。Zhao 等［24］和 Gu 等［25］敲除了 L-色氨酸生產(chǎn)菌的單個或多個編碼吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，一定程度上均提高了L-色氨酸的積累。對于芳香族氨基酸向大腸桿菌細(xì)胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)，研究顯示，過表達(dá)yddG基因可以提高大腸桿菌對芳香族氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。Liu等［26］在大腸桿菌L-色氨酸生產(chǎn)菌株中過表達(dá)yddG基因后，對L-色氨酸的積累有明顯的促進(jìn)作用。Liu等［13］在構(gòu)建大腸桿菌L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌株時也過表達(dá)了yddG基因以促進(jìn)L-苯丙氨酸向胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.2 “通”——解除反饋抑制與過表達(dá)關(guān)鍵酶使芳香族氨基酸合成途徑通暢

在大腸桿菌芳香族氨基酸合成途徑中，對其合成影響較大的主要是DHAP合成酶和相關(guān)芳香族氨基酸分支途徑的合成酶(圖1)。DHAP合成酶由3個基因編碼，分別是aroG、aroF和aroH，在整個酶活中所占的比例分別為80%、20%和1%，它們分別受到L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和 L-色氨酸的反饋抑制［6-7，16］。另外，在芳香族氨基酸分支途徑中的各個合成酶均會受到相對應(yīng)產(chǎn)物的嚴(yán)格反饋抑制和相關(guān)阻遏蛋白的反饋?zhàn)瓒?。L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸分支途徑中所對應(yīng)的關(guān)鍵酶分別為鄰氨基苯甲酸合成酶(TrpE)及雙功能酶分支酸變位酶和預(yù)苯酸脫水酶(PheA，TyrA)［16］。為了使芳香族氨基酸合成途徑通暢，積累更多的芳香族氨基酸，解除產(chǎn)物對關(guān)鍵酶的反饋抑制至關(guān)重要。很多研究者通過誘變育種隨機(jī)篩選突變株或分析關(guān)鍵酶的蛋白三維結(jié)構(gòu)得到了許多含突變位點(diǎn)的關(guān)鍵酶，均能不同程度地解除產(chǎn)物的反饋抑制(表2)。另外，在芳香族氨基酸的合成途徑中，由TrpR和TyrR 2種阻遏蛋白介導(dǎo)的反饋?zhàn)瓒糇饔迷诖竽c桿菌中非常嚴(yán)謹(jǐn)。因此，在利用代謝工程策略構(gòu)建相關(guān)芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株時，trpR和tyrR 2個基因的敲除以解除其反饋?zhàn)瓒粽{(diào)節(jié)也是必要的［16］。

表2 大腸桿菌芳香族氨基酸合成途徑中解除反饋抑制的關(guān)鍵酶Table 2 Feedback-resistant key enzymes of AAAs biosynthetic pathway in E．coli

在大腸桿菌正常的生長代謝過程中，其碳代謝流進(jìn)入莽草酸途徑所占比例通常不超過2%［6-7］，因此，即使解除關(guān)鍵酶的反饋抑制和反饋?zhàn)瓒粽{(diào)節(jié)，也很難達(dá)到高產(chǎn)芳香族氨基酸的目的。為解決合成代謝流少的問題，在大腸桿菌原有相關(guān)基因的基礎(chǔ)上，過表達(dá)關(guān)鍵限速酶基因顯得尤為重要。在構(gòu)建大腸桿菌芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株時，大部分研究者都通過過表達(dá)相關(guān)關(guān)鍵限速酶基因取得了良好的效果，3種芳香族氨基酸都在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了有效地積累(表1)。但是，這些研究大多采用構(gòu)建重組質(zhì)粒的方式增加關(guān)鍵酶的表達(dá)強(qiáng)度，這樣的策略雖然可以增加芳香族氨基酸的積累，但也存在菌體負(fù)擔(dān)重、菌株具有抗生素抗性、質(zhì)粒易丟失和糖酸轉(zhuǎn)化率偏低等問題，使利用大腸桿菌工業(yè)化生產(chǎn)芳香族氨基酸難度大大增加。目前，只有L-苯丙氨酸在生產(chǎn)上達(dá)到相對較高的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率(25%左右)，L-色氨酸在工業(yè)化生產(chǎn)中的糖酸轉(zhuǎn)化率很難達(dá)到20%，而L-酪氨酸工業(yè)上還是主要依靠化學(xué)合成法進(jìn)行生產(chǎn)。因此，在基因組層面對大腸桿菌芳香族氨基酸合成途徑進(jìn)行相對應(yīng)的改造，以解決進(jìn)入芳香族氨基酸合成代謝流少和糖酸轉(zhuǎn)化率低等一系列問題，將是下一步利用代謝工程策略構(gòu)建大腸桿菌芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株的重點(diǎn)。

為了使大腸桿菌中的芳香族氨基酸合成途徑更加通暢，除了過表達(dá)關(guān)鍵限速酶以外，保證芳香族氨基酸合成途徑中所涉及前體物的充足供應(yīng)也非常重要。除了PEP外，芳香族氨基酸合成途徑中還涉及其他前體物的供應(yīng)(圖1)，其中以L-色氨酸合成途徑中所涉及的前體物最為廣泛和復(fù)雜［36］。與關(guān)鍵酶過表達(dá)相似，為保證相關(guān)前體物的充足供應(yīng)，研究者通常采用過表達(dá)合成基因的方式增加各種前體物的合成，相關(guān)前體物及合成基因總結(jié)見表3。

在大腸桿菌芳香族氨基酸合成途徑中，除PEP和E4P直接進(jìn)入莽草酸途徑作為其碳骨架前體物外，還需要許多前體物的參與才能合成芳香族氨基酸，而各前體物參與的方式以及供應(yīng)量都有所不同。因此，在強(qiáng)化相關(guān)基因表達(dá)量時，保證各前體物的協(xié)調(diào)平衡供應(yīng)對芳香族氨基酸代謝合成非常重要。如在L-色氨酸合成途徑中(圖1)，涉及的前體物包括L-谷氨酰胺、L-絲氨酸和PRPP。另外，在大腸桿菌芳香族氨基酸合成途徑中，有多步反應(yīng)需要NADPH提供還原力參與相關(guān)酶的催化反應(yīng)［36］。2016年，Chen等［11］在構(gòu)建大腸桿菌L-色氨酸生產(chǎn)菌株時，在增強(qiáng)L-色氨酸操縱子表達(dá)的基礎(chǔ)上，將強(qiáng)啟動子Ptac控制的aroGfbserAfb人工操縱子整合至大腸桿菌基因組后，可積累40 g/L左右的L-色氨酸。對該菌株胞內(nèi)外的各成分測定發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)化serA表達(dá)的工程菌的胞內(nèi)L-絲氨酸可以滿足L-色氨酸合成的需要。L-色氨酸合成的另一個前體物L(fēng)-谷氨酰胺的胞內(nèi)含量較低，相反，L-谷氨酸含量相對較高，因此推測L-谷氨酰胺供應(yīng)不足可能是影響L-色氨酸生產(chǎn)的又一限制因素。另外，增強(qiáng)NADPH和PRPP等其他前體物的供應(yīng)在構(gòu)建芳香族氨基酸生產(chǎn)菌中的報(bào)道較少。從現(xiàn)有的研究分析，適當(dāng)提高芳香族氨基酸前體物的合成，達(dá)到前體物的協(xié)調(diào)供應(yīng)且不造成碳代謝流的流失，是進(jìn)一步提高大腸桿菌芳香族氨基酸產(chǎn)率與轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵。

表3 代謝工程增加大腸桿菌芳香族氨基酸合成前體物Table 3 Increase of precursor supply of AAAs in E．coli by metabolic engineering

2.3 “節(jié)”“堵”——降低副產(chǎn)物的形成與阻止產(chǎn)物的降解

為使大腸桿菌將更多的碳源轉(zhuǎn)化為芳香族氨基酸，需要節(jié)省其競爭途徑以降低副產(chǎn)物的形成。如圖1所示，芳香族氨基酸合成途徑的競爭途徑主要指PEP進(jìn)入莽草酸途徑與PEP轉(zhuǎn)化為PYR之間的競爭以及各芳香族氨基酸分支途徑之間的競爭。在大腸桿菌中，PEP的主要代謝途徑是轉(zhuǎn)化為PYR后進(jìn)入TCA循環(huán)，為盡可能降低該代謝支路的損失，Weiner等［12］在構(gòu)建大腸桿菌 L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌時通過敲除編碼丙酮酸激酶基因pykA和pykF以達(dá)到提高其產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的目的。在另外2種芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建研究中，很少有通過同時敲除pykA和pykF兩基因的研究報(bào)道，這可能是因?yàn)橥瑫r失活pykA和pykF后，丙酮酸合成不足以供應(yīng)菌體自身能量代謝，對菌體生長有較大影響。

對于大腸桿菌芳香族氨基酸分支途徑之間的競爭，有研究報(bào)道稱在過表達(dá)抗反饋抑制的鄰氨基苯甲酸合酶(trpEfb)后，由于其對分支酸的親和性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于另外2種雙功能酶分支酸變位酶和預(yù)苯酸脫水酶(pheA，tyrA)。所以在構(gòu)建L-色氨酸生產(chǎn)菌時，只要有足夠強(qiáng)度的鄰氨基苯甲酸合酶表達(dá)，用于合成L-苯丙氨酸和 L-酪氨酸的代謝流損失就會很少［6-7］。Zhao 等［8］在構(gòu)建 L-色氨酸生產(chǎn)菌時，通過敲除pheA和tyrA基因顯著地提高了L-色氨酸的積累量，這可能原因是其鄰氨基苯甲酸的表達(dá)強(qiáng)度不夠?qū)е?。另外，同時敲除這2個基因后，需在培養(yǎng)基中添加L-苯丙氨酸和L-酪氨酸，該工程菌才可以正常生長發(fā)酵。因此，對于芳香族氨基酸分支途徑相互之間的競爭，在外界添加相應(yīng)芳香族氨基酸不影響菌體生長的條件下，可以通過敲除相關(guān)的分支途徑合成基因減少代謝流的損失，以便更多地積累目標(biāo)芳香族氨基酸［40］。

大腸桿菌中L-色氨酸在色氨酸酶(TnaA)的作用下分解為吲哚和L-絲氨酸，tnaA基因(tna操縱子的一部分，其余部分包括tnaB和tnaC分別編碼色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和前導(dǎo)區(qū)域)的敲除可以阻斷L-色氨酸的降解，同時減少L-色氨酸向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高L-色氨酸的積累［41］。對于另外2種芳香族氨基酸降解機(jī)制未見研究報(bào)道，其工程菌的構(gòu)建也未見涉及阻斷產(chǎn)物降解的策略。

2.4 其他相關(guān)芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株代謝工程策略

由于芳香族氨基酸生物合成代謝途徑長而復(fù)雜，副產(chǎn)物具有許多不確定性，且涉及的前體物和相關(guān)輔助因子較多，在利用傳統(tǒng)的代謝工程五字策略改造大腸桿菌芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株時很難顧及所有因素。除了以上介紹的常規(guī)代謝工程策略，許多有效的代謝工程新策略也被越來越多地應(yīng)用于芳香族氨基酸菌株的構(gòu)建。例如，增強(qiáng)PEP合成的另一種策略是缺失全局碳調(diào)控因子csrA［42］。貯碳因子(carbon storage regulator)是一種從整體代謝水平上參與調(diào)控RNA的結(jié)合蛋白，對負(fù)責(zé)分解PEP的丙酮酸激酶(Pyk)正調(diào)控，對負(fù)責(zé)PEP生成的PEP羧激酶(PckA)以及PEP合成酶(PpsA)負(fù)調(diào)控。因此csrA的敲除可以解除這些調(diào)控，從而有利于PEP的積累。另外，Liu等［43］在L-色氨酸生產(chǎn)菌中通過敲除缺失全局碳調(diào)控因子fruR也達(dá)到了相似的效果，從而有效地提高了L-色氨酸的產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率。

作為大腸桿菌生長和代謝過程主要副產(chǎn)物，乙酸的積累不僅消耗碳代謝流，且過量的積累還會對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用從而抑制生長［44］。目前，在大腸桿菌的芳香族氨基酸發(fā)酵中，乙酸也是主要的副產(chǎn)物，其積累主要是因?yàn)橐缌鞔x，超過2 g/L的乙酸積累就會顯著影響細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成。目前在芳香族氨基酸的工業(yè)化生產(chǎn)中，主要通過控制葡萄糖的攝取速率減少乙酸積累，但這種方法也加大了其工業(yè)化生產(chǎn)的難度，提高了生產(chǎn)成本。在大腸桿菌中主要有兩條乙酸的合成途徑，一條是通過PoxB氧化酶途徑，由丙酮酸氧化酶(PoxB)催化乙酸形成;另一條是pta-ackA途徑，通過磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(Pta)和乙酸激酶(AckA)催化連續(xù)的兩個反應(yīng)，由乙酰-CoA生成乙酸，這也是乙酸形成的主要途徑［44］。在 Liu等［45］的研究中顯示，直接敲除 pta基因?qū)w生長影響很大，造成L-色氨酸產(chǎn)量大幅度降低，這可能是由于pta基因在大腸桿菌中有較多生理功能，pta基因敲除后影響了菌體的生長，從而對L-色氨酸的積累產(chǎn)生負(fù)面作用。該研究將pta基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變(Pro69Leu)，降低了磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，有效地減少了乙酸積累。在 Zhao等［46］的 L-色氨酸生產(chǎn)菌的研究中，敲除 ackA和tdcD基因使得乙酸的積累減少了21．79%，同時，L-色氨酸的產(chǎn)量提高了6．49%。綜上所述，乙酸作為大腸桿菌芳香族氨基酸生長發(fā)酵過程具有毒害作用的主要副產(chǎn)物，雖然通過一些代謝策略能降低其積累量，但仍無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)所需要的條件，因此需要進(jìn)一步優(yōu)化菌株代謝途徑，減少因溢流代謝導(dǎo)致的乙酸積累。除此之外，芳香族氨基酸合成的高ATP需求，發(fā)酵過程的高溶氧需求，胞內(nèi)外產(chǎn)物的實(shí)時檢測，中間代謝物積累的實(shí)時檢測等一系列問題，都對大腸桿菌芳香族氨基酸代謝工程研究改造提出了更高的要求。

3 總結(jié)與展望

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用代謝工程策略重新合理設(shè)計(jì)并改造大腸桿菌的生物代謝途徑，在構(gòu)建芳香族氨基酸生產(chǎn)菌株方面取得了顯著的進(jìn)步。但由于大腸桿菌中芳香族氨基酸代謝途徑長而復(fù)雜，涉及的前體物很多，代謝工程改造難度很大。尤其對于L-色氨酸而言，作為大宗飼料用的氨基酸，現(xiàn)有工業(yè)化菌株的產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率很難滿足其市場需要。另外，L-酪氨酸目前還沒有成熟的工業(yè)化發(fā)酵法生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，而L-苯丙氨酸也普遍存在乙酸積累和糖酸轉(zhuǎn)化率低等問題。因此，在已有代謝工程策略構(gòu)建芳香族氨基酸生產(chǎn)菌的基礎(chǔ)上，需要應(yīng)用新興的代謝網(wǎng)絡(luò)模擬計(jì)算、代謝網(wǎng)絡(luò)定量分析和一些基因組編輯和干擾等技術(shù)對芳香族氨基酸合成途徑進(jìn)行更系統(tǒng)地組合優(yōu)化，從而構(gòu)建更加高效的大腸桿菌芳香族氨基酸工程菌，有效地提高發(fā)酵產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率，這也是將來芳香族氨基酸代謝工程的主要發(fā)展方向。

［1］ 申曉林，袁其朋．生物合成芳香族氨基酸及其衍生物的研究進(jìn)展［J］．生物技術(shù)通報(bào)，2017，33(1)：24-34．

［2］ 姚元鋒，趙廣榮．L-酪氨酸代謝工程研究進(jìn)展［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(5)：132-137．

［3］ 趙春光，程立坤，徐慶陽，等．微生物法生產(chǎn) L-色氨酸的研究進(jìn)展［J］．發(fā)酵科技通訊，2008，37(4)：34-36．

［4］ 李冀新，張超．L-苯丙氨酸生產(chǎn)及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］．氨基酸和生物資源，2006，28(2)：51-56．

［5］ LI Z，JI X，KAN S，et al．Past，present，and future industrial biotechnology in China［J］．Adv Biochem Eng Biotechnol，2010，122：1-42．

［6］ RODRIGUEZ A，MARTNEZ J A，F(xiàn)LORES N，et al．Engineering Escherichia coli to overproduce aromatic amino acids and derived compounds［J］．Microb Cell Fact，2014，13(1)：126-130．

［7］ BONGAERTS J，KR?MER M，MüLLER U，et al．Metabolic engineering for microbial production of aromatic amino acids and derived compounds［J］．Metab Eng，2001，3(4)：289-300．

［8］ ZHAO Z J，ZOU C，ZHU Y X，et al．Development of L-tryptophan production strains by defined genetic modification in Escherichia coli［J］．J Ind Microb Biotechnol，2011，38(12)：1921-1929．

［9］ GU P，YANG F，LI F，et al．Knocking out analysis of tryptophan permeases in Escherichia coli for improving L-tryptophan production［J］．Appl Microb Biotechnol，2013，97(15)：6677-6683．

［10］ WANG J，CHENG L K，WANG J，et al．Genetic engineering of Escherichia coli to enhance production of L-tryptophan［J］．Appl Microb Biotechnol，2013，97(17)：7587-7596．

［11］ CHEN L，ZENG A P．Rational design and metabolic analysis of Escherichia coli for effective production of L-tryptophan at high concentration［J］．Appl Microb Biotechnol，2017，101(2)：559-568．

［12］ WEINER M，ALBERMANN C，GOTTLIEB K，et al．Fed-batchproduction of L-phenylalanine from glycerol and ammonia with recombinant Escherichia coli［J］．Biochem Eng J，2014，83：62-69．

［13］ LIU S P，LIU R X，XIAO M R，et al．A systems level engineered E．coli capable of efficiently producing L-phenylalanine［J］．Process Biochem，2014，49(5)：751-757．

［14］ SANTOS C N S，XIAO W，STEPHANOPOULOS G．Rational，combinatorial，and genomic approaches for engineering L-tyrosine production in Escherichia coli［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2012，109(34)：13538-13543．

［15］ PATNAIK R，ZOLANDZ R R，GREEN D A，et al．L-tyrosine production by recombinant Escherichia coli：fermentation optimization and recovery［J］．Biotechnol Bioeng，2008，99(4)：741-752．

［16］ WENDISCH V F．Amino acid biosynthesis-pathways，regulation and metabolic engineering［M］．Berlin：Springer，2007．

［17］ GOSSET G．Improvement of Escherichia coli production strains by modification of the phosphoenolpyruvate：sugar phosphotransferase system［J］．Microb Cell Fact，2005，4(1)：14-37．

［18］ 肖夢榕，張梁，石貴陽．改進(jìn)莽草酸合成代謝的大腸桿菌工程化研究新進(jìn)展［J］．微生物學(xué)報(bào)，2014，54(1)：5-13．

［19］ MARTíNEZ K，DE ANDA R，HERNáNDEZ G，et al．Coutilization of glucose and glycerol enhances the production of aromatic compounds in an Escherichia coli strain lacking the phosphoenolpyruvate：carbohydrate phosphotransferase system［J］．Microb Cell Fact，2008，7(1)：1-12．

［20］ LU J，TANG J，LIU Y，et al．Combinatorial modulation of galP and glk gene expression for improved alternative glucose utilization［J］．Appl Microb Biotechnol，2012，93(6)：2455-2462．

［21］ SNOEP J L，ARFMAN N，YOMANO L P，et al．Reconstruction of glucose uptake and phosphorylation in a glucose-negative mutant of Escherichia coli by using Zymomonas mobilis genes encoding the glucose facilitator protein and glucokinase［J］．J Bacteriol，1994，176(7)：2133-2135．

［22］ WEISSER P，KR?MER R，SAHM H，et al．Functional expression ofthe glucose transporterofZymomonasmobilisleads to restoration of glucose and fructose uptake in Escherichia coli mutants and provides evidence for its facilitator action［J］．J Bacteriol，1995，177(11)：3351-3354．

［23］ CHANDRAN S S，YI J，DRATHS K M，et al．Phosphoenolpyruvate availability and the biosynthesis of shikimic acid［J］．Biotech Prog，2003，19(3)：808-814．

［24］ ZHAO Z，CHEN S，WU D，et al．Effect of gene knockouts of L-tryptophan uptake system on the production of L-tryptophan in Escherichia coli［J］．Process Biochem，2012，47(2)：340-344．

［25］ GU P，YANG F，LI F，et al．Knocking out analysis of tryptophan permeases in Escherichia colifor improving L-tryptophan production［J］．Appl Microb Biotechnol，2013，97(15)：6677-6683．

［26］ LIU Q，CHENG Y，XIE X，et al．Modification of tryptophan transport system and its impact on production of L-tryptophan in Escherichia coli［J］．Bioresour Technol，2012，114：549-554．

［27］ KIKUCHIY，TSUJIMOTO K，KURAHASHIO．Mutational analysis of the feedback sites of phenylalanine-sensitive 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase of Escherichia coli［J］．Appl Environ Microb，1997，63(2)：761-762．

［28］ GER Y M，CHEN S L，CHIANG H J，et al．A single Ser-180 mutation desensitizes feedback inhibition of the phenylalaninesensitive 3-deoxy-σ-arabino-heptulosonate-7-phosphate(DAHP)synthetase in Escherichia coli［J］．J Biochem，1994，116(5)：986-990．

［29］ JOSSEK R，BONGAERTS J，SPRENGER G A．Characterization of a new feedback-resistant3-deoxy-σ-arabino-heptulosonate7-phosphate synthase AroF of Escherichia coli［J］．FEMS Microb Lett，2001，202(1)：145-148．

［30］ CALIGIURI M G，BAUERLE R．Subunit communication in the anthranilate synthase complex from Salmonella typhimurium［J］．Science，1991，252：1845-1848．

［31］ CALIGIURI M G，BAUERLE R．Identification of amino acid residues involved in feedback regulation of the anthranilate synthase complex from Salmonella typhimurium：evidence for an amino-terminal regulatory site［J］．J Biolog Chem，1991，266(13)：8328-8335．

［32］ BáEZ-VIVEROS J L，OSUNA J，Hernández-Chávez G，et al．Metabolic engineering and protein directed evolution increase the yield of L-phenylalanine synthesized from glucose in Escherichia coli［J］．Biotech Bioeng，2004，87(4)：516-524．

［33］ NELMS J，EDWARDS R M，WARWICK J，et al．Novel mutations in the pheA gene of Escherichia coli K-12 which result in highly feedback inhibition-resistant variants of chorismatemutase/prephenate dehydratase［J］．Appl Environ Microb，1992，58(8)：2592-2598．

［34］ LüTKE-EVERSLOH T，STEPHANOPOULOS G．L-tyrosine production by deregulated strains of Escherichia coli［J］．Appl Microb Biotechnol，2007，75(1)：103-110．

［35］ LüTKEEVERSLOH T， STEPHANOPOULOS G．Feedback inhibition of chorismatemutase/prephenate dehydrogenase(TyrA)of Escherichia coli：generation and characterization of tyrosine-insensitive mutants［J］．Appl Environ Microb，2005，71(11)：7224-7228．

［36］ PANICHKIN V B，LIVSHITS V A，BIRYUKOVA I V，et al．Metabolic engineering ofEscherichia coliforL-tryptophan production［J］．Appl Biochem Microb，2016，52(9)：783-809．

［37］ SABIDO A，SIGALA J C，HERNáNDEZ-CHáVEZ G，et al．Physiological and transcriptional characterization of Escherichia coli strains lacking interconversion of phosphoenolpyruvate and pyruvate when glucose and acetate are coutilized［J］．Biotech Bioeng，2014，111(6)：1150-1160．

［38］ YAKANDAWALA N，ROMEO T，F(xiàn)RIESEN A D，et al．Metabolic engineering ofEscherichia coli to enhance phenylalanine production［J］．Appl Microb Biotechnol，2008，78(2)：283-291．［39］ CUI Y Y，LING C，ZHANG Y Y，et al．Production of shikimic acid from Escherichia coli through chemically inducible chromosomal evolution and cofactor metabolic engineering［J］．Microb Cell Fact，2014，13(1)：21-31．

［40］ 李光鎬，樸惠民，李孝炯，等．具有增強(qiáng)L-色氨酸生產(chǎn)力的大腸桿菌微生物以及使用其生產(chǎn)L-色氨酸的方法：105143440A［P］．2015-12-09．

［41］ 趙志軍，陳晟，吳丹，等．大腸桿菌色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)多基因敲除對色氨酸生產(chǎn)的影響［J］．生物工程學(xué)報(bào)，2011，27(12)：1765-1772．

［42］ TATARKO M，ROMEO T．Disruption of a global regulatory gene to enhance central carbon flux into phenylalanine biosynthesis in Escherichia coli［J］．Curr Microbiol，2001，43(1)：26-32．

［43］ LIU L，DUANABD X，WU J．Modulating the direction of carbon flow in Escherichia coli to improve L-tryptophan production by inactivating the global regulator FruR［J］．J Biotechnol，2016，231：141-148．

［44］ 趙春光，程立坤，徐慶陽，等．微生物法生產(chǎn) L-色氨酸的研究進(jìn)展［J］．發(fā)酵科技通訊，2008，37(4)：34-36．

［45］ LIU L，DUAN X，WU J．L-tryptophan production in Escherichia coli improved by weakening the pta-ackA pathway：［J］．PLoS ONE，2016，11(6)：e0158200．

［46］ ZHAO C，CHENG L K，WANG J，et al．Impact of deletion of the genes encoding acetate kinase on production of L-tryptophan by Escherichia coli［J］．Ann Microbiol，2016，66(1)：1-9．

(責(zé)任編輯 管珺)

Metabolic engineering of aromatic amino acids in Escherichia coli

YAN Fangqing1，HAN Yakun1，LI Juan1，LI Yanjun1，2，3，XU Qingyang1，2，3，CHEN Ning1，2，3，XIE Xixian1，2，3
(1．College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China;2．National and Local United Engineering Laboratory of Metabolic Control Fermentation Technology，Tianjin 300457，China;3．Tianjin Engineering Laboratory of Efficient and Green Amino Acid Manufacture，Tianjin 300457，China)

Aromatic amino acids(AAAs)，including L-phenylalanine(L-Phe)，L-tyrosine(L-Tyr)and L-tryptophan(L-Trp)，are important essential amino acids in the organism，and have important biological functions and wide applications in the fields of pharmaceutic，food and feed industries so on．This paper introduces biosynthetic pathway and metabolic regulation of AAAs，and systematically summarizes the metabolic engineering strategies for the construction of Escherichia coli AAAs producing strains．In view of the problems in industrial production of AAAs at present，this paper prospects the further application of metabolic engineering strategies for the modification of AAAs producing strains．

aromatic amino acids;Escherichia coli;metabolic engineering

Q517;Q78

A

1672-3678(2017)05-0032-08

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．004

2017-06-06

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(14ZCZDSY00015)

鄢芳清(1992—)，男，湖南婁底人，研究方向：代謝控制發(fā)酵;謝希賢(聯(lián)系人)，教授，E-mail：xixianxie@tust．edu．cn