胡斌 劉林湘 陳丹丹

100例多發(fā)性骨髓瘤患者熒光原位雜交結(jié)果匯總分析

胡斌 劉林湘 陳丹丹

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院 血液科 河南 鄭州 450000)

目的探討熒光原位雜交(FISH)技術(shù)檢測在多發(fā)性骨髓(MM)診斷和治療中的作用及臨床意義。方法應用FISH技術(shù)，采用特異性探針(RB1、P53、D13S319、IGH及Iq21)，對100例初診MM患者進行檢測，分析其染色體異常情況，與患者的臨床指標進行相關(guān)性分析。結(jié)果FISH技術(shù)檢測100例初診MM患者中60例(60%)基因異常，其中IGH重排42例(42%)，Iq21擴增32例(32%)，RB1缺失23例(23%)，D13S319缺失21例(21%)，P53缺失5例(5%)。各基因異常結(jié)果與臨床指標相關(guān)性分析如下：IGH基因重排與骨髓內(nèi)漿細胞水平(>30%)、ISS分期存在相關(guān)性；del(13q)與ISS分期、骨髓漿細胞水平(>30%)及β2-微球蛋白水平(β2-MG)水平存在相關(guān)性；Iq21擴增與β2-MG、ISS分期存在相關(guān)性；P53缺失檢出率最低，預后可能較差。MM患者存在染色體異常的主要以IgG型和Ⅲ期為主。結(jié)論MM最常見的基因異常是IGH基因重排以及Iq21擴增，其次是RB1和D13S319缺失，P53缺失最少。Ⅲ期和IgG型患者出現(xiàn)染色體異常的可能性更高。FISH的檢出率要優(yōu)于染色體常規(guī)核型分析(CC)技術(shù)，F(xiàn)ISH聯(lián)合CC可作為MM患者的常規(guī)檢查，指導臨床治療。

多發(fā)性骨髓瘤；染色體；熒光原位雜交；基因異常

多發(fā)性骨髓(multiple myeloma，MM)是一種中老年常見的骨髓漿細胞克隆增生性惡性腫瘤，其生存期變化很大，短者不足1 a，長者可存活10 a以上，這些顯著差異表明影響MM的預后因素較為復雜。近年來研究證實，細胞及分子遺傳學異常是影響MM預后的重要因素。多發(fā)性骨髓瘤染色體異常改變較多，其中以1號染色體(Iq21擴增)、13號染色體(D13S319和RB1基因缺失)、14號染色體(IGH基因異位)及17號染色體(P53基因缺失)的異常較為常見。本研究通過熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH)對鄭州大學第一附屬醫(yī)院初診的100例MM患者進行檢測，分析其染色體異常情況，與相關(guān)臨床指標進行相關(guān)性分析，探討FISH檢測在多發(fā)性骨髓診斷和治療中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1對象選取鄭州大學第一附屬醫(yī)院2015年3月至2016年11月期間收治的100例初診多發(fā)性骨髓瘤患者，所有患者均行骨髓穿刺、免疫固定電泳、X線、CT等檢查，同時行原位熒光雜交技術(shù)檢測，其診斷均符合張之南等主編的《血液病診斷及療效標準》[1]，其中男65例，女35例；年齡為39～80歲，中位年齡57歲。IgG型46例，IgA型27例，IgD型2例，IgM型2例，輕鏈型20例，未分泌型3例。

1.2主要試劑GLPRB1 DNA探針、GLPP53 DNA 探針、GLPD13S319 DNA 探針、GLPIGHDNA 探針、GLPIq21 DNA 探針，以上探針均購自北京金菩嘉公司。

1.3FISH方法肝素管采集患者骨髓液2 ml，提取有核細胞、制片，按照探針試劑說明書進行DNA變性、雜交、洗片、制片、復染。在熒光顯微鏡下選用合適的濾片觀察結(jié)果。判斷標準：GLPRB1 DNA和GLPP53 DNA探針正常間期細胞表現(xiàn)為2個綠色熒光信號，異常細胞為1個綠色信號；GLPIq21 DNA探針正常間期細胞表現(xiàn)為2個紅色信號，異常細胞為3個紅色信號；GLPD13S319探針正常細胞表現(xiàn)為2個紅色信號，異常細胞為1個紅色信號；GLPIGHDNA 探針正常間期細胞表現(xiàn)為2個黃色信號，異常細胞為1個橘紅色信號、1個綠色信號和1個黃色信號或者2個橘紅色、2個綠色信號。當異常細胞數(shù)>±3 s為陽性[2]，由此計算出RB1、D13S319、P53、Iq21、IGH的陽性率分別為>9.005%、9.430%、8.572%、8.572%、8.087%、9.194%。

1.4統(tǒng)計學分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1FISH檢測結(jié)果100例MM患者中，檢出60例基因異常，異常檢出率為60%。累及1種基因異常31例，累計2種10例，3種9例，4種9例，5種1例。其中IGH重排42例(42%)，Iq21擴增32例(32%)，RB1缺失23例(23%)，D13S319缺失21例(21%)，P53缺失5例(5%)。

2.2FISH結(jié)果與患者的一般臨床資料相關(guān)性MM患者存在染色體異常的主要免疫分型為IgG型，D-S分期為ⅢA型。染色體異常與年齡、性別、血小板、血紅蛋白、血鈣、LDH、CRP、血肌酐、白蛋白、免疫學分型、D-S分期無相關(guān)性，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而染色體異常與β2-MG、漿細胞數(shù)、ISS分期存在相關(guān)性。見表1～3。

表1 染色體異常與β2-MG的關(guān)系

表2 染色體異常與漿細胞數(shù)的關(guān)系

表3 染色體異常與ISS分期的關(guān)系

3 討論

隨著FISH技術(shù)的出現(xiàn)，對MM遺傳學異常的研究逐漸深入，有研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有的MM患者都有不同程度的遺傳學異常[3]。盡管染色體常規(guī)核型分析(CC)技術(shù)仍是臨床上檢測染色體的常規(guī)手段，但國內(nèi)文獻報道的MM通過常規(guī)染色體核型分析檢出率僅為32.1%[4]。本研究分析了100例FISH檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)1種以上異常60例，檢出率為60%。這表明FISH的檢出率要優(yōu)于CC技術(shù)，這是由于常規(guī)染色體檢查受細胞增殖影響比較大，MM異常漿細胞增殖活性較低，檢出率低。FISH不受漿細胞的分選限制，檢出率較高。但是FISH技術(shù)只能對特定的位點進行檢測，無法檢測未知的染色體易位、缺失或擴增等，而CC技術(shù)可彌補其不足[5]。因此，臨床上可用常規(guī)染色體核型分析技術(shù)和FISH技術(shù)相配合，提高對染色體異常的檢測水平。國外文獻報道應用FISH技術(shù)檢出率為69.4%[6]，本研究低于國外文獻報道，考慮可能與本研究條件有限所致。目前國外和國內(nèi)部分中心采用CD138磁珠分選聯(lián)合FISH技術(shù)檢測提高了異常檢出率，這督促本研究FISH技術(shù)水平需要繼續(xù)改進和提高。

在本研究中，IGH基因(14q32)重排是MM染色體異常中發(fā)生最頻繁的事件，這與國外的報道[6]一致。14q32與多條伙伴染色體發(fā)生易位而導致IGH基因重排，可引起相關(guān)染色體區(qū)域的原癌基因被激活，這可能是導致MM發(fā)病的分子遺傳學機制之一[7]。本研究發(fā)現(xiàn)IGH基因重排與骨髓內(nèi)漿細胞水平(>30%)、ISS分期有顯著相關(guān)性，這與國內(nèi)趙麗等[8]研究發(fā)現(xiàn)不太相符。在42例IGH基因重排陽性的患者中，其中71%的患者達到疾病Ⅲ期，提示發(fā)生IGH基因重排時，大部分患者已處于疾病晚期。IGH基因重排檢測的重要性已在研究中得到證實，國外已開始將應用FISH技術(shù)檢測IGH重排及其常見亞型的鑒定列入初診患者的必查項目中。

RB1和D13S319位點是13q的主要缺失部位，在本研究中，2個位點的檢出率分別為23%和21%，低于文獻報道的38.6%和36.4%[9]，其中同時具有2個位點異常的有19例。Schmidt wolf等[10]的研究表明，13號染色體長臂的缺失與高骨髓瘤細胞(>30%)、貧血、血小板減少、高血肌酐及進展期病程密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)del(13q)與骨髓漿細胞水平及β2-MG水平有顯著相關(guān)性，但與其他臨床指標未見相關(guān)性。其中β2-MG水平高低是MM不良的預后因素，13號染色體缺失是否能作為影響MM預后的一個獨立因素，需長期跟蹤隨訪患者疾病進展情況以及治療情況來判定。

本研究發(fā)現(xiàn)Iq21擴增與β2-MG水平有顯著相關(guān)性，32例Iq21陽性患者中，伴有β2-MG水平增高的有30例。此外Iq21多伴隨其他染色體異常，其中同時伴有3種以上基因異常有15例。同時伴有多種染色體異常的預后意義，以及每種染色體異常是否有獨立的預后意義，仍需后期繼續(xù)跟蹤隨訪求證。

有研究報道抑癌基因P53可調(diào)控細胞分化與凋亡，調(diào)節(jié)細胞增殖，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及腫瘤血管再生，其突變或缺失使腫瘤容易轉(zhuǎn)移，并使化療藥物不敏感，這也正是P53基因缺失或突變的患者預后差的原因之一[11]。本研究中P53的檢出率最低，僅為5%，5例患者均處在疾?、笃?。雖然該異常發(fā)生率并不高，但有研究顯示P53基因缺失是MM患者生存期較短的一個獨立的預后指標[12]。

由于本研究條件有限，無法準確對染色體異常的MM進行預后評估，今后需長期跟蹤隨訪這些細胞遺傳學異常的患者，觀察患者疾病進展情況以及治療情況，歸納不良預后類型，有助于對MM患者制定個體化治療，從而使其在分子水平上達到緩解，獲得長期生存。

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Ageneralanalysisontheresultof100patientswithmultiplemyelomabyfluorescenceinsituhybridization

Hu Bin, Liu Linxiang, Chen Dandan

(DepartmentofHematology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000,China)

ObjectiveTo investigate the effects and clinical meaning of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the diagnosis and treatment of multiple myeloma (MM) patients.MethodsBy FISH, five specific probes includingRB1,P53,D13S319,IGHandIq21 were used to study the chromosomal abnormalities of 100 newly diagnosed patients with MM in the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, the correlation between the results and the patients’ clinical indicators was analyzed.ResultsAmong the 100 cases of newly diagnosed patients with MM, there were 60 cases of chromosomal abnormalities emerged(60/100). The frequencies of abnormalities inIGHrearrangement,Iq21 amplification, the deletion ofRB1, the deletion ofD13S319 and that ofP53 were 42% (42/100), 32% (32/100), 23% (23/100), 21% (21/100) and 5% (5/100) respectively. Analysis showed that there was a correlation betweenIGHgene rearrangement and the percentage of plasma cell (>30%) as well as ISS periodization; one between del(13q) and ISS periodization, the percentage of plasma cell (>30%) and that of β2microglobulin (β2-MG); another betweenIq21 amplification and β2-MG as well as ISS periodization. In addition, the detectable rate of the deletion ofP53 was the lowest and the relevant prognosis may be worse. In a word, the chromosomal abnormalities in patients with MM mainly lie inIGHand stage Ⅲ.ConclusionThe most common chromosomal abnormalities in patients with MM areIGHgene rearrangement andIq21 amplification；the second most common ones are the deletion ofRB1 andD13S319; the least one is the deletion ofP53. It is more possible for chromosomal abnormalities to emerge in patients in stage Ⅲ andIGHones. In view of the detection rate, FISH is a better technique than karyotype analysis of Conventional Cytogenetics (CC). Thus, FISH can be used with CC as a karyotype analysis method in the clinical treatment of patients with MM.

multiple myeloma；chromosome；fluorescence in situ hybridization；chromosomal abnormalities

R 733.3doi: 10.3969/j.issn.1004-437X.2017.17.002

2016-12-21)

劉林湘，E-mail: liulinxiang6629@126.com。