王開，王海軍

血管生成素-1與急性期腦梗死病灶周圍側(cè)支循環(huán)建立的相關(guān)性探討

王開，王海軍

（撫順礦務(wù)局總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 撫順 113008）

目的 探討血管生成素-1與急性期腦梗死病灶側(cè)支循環(huán)建立是否存在相關(guān)性。方法 收集符合入組標(biāo)準(zhǔn)患者99例，根據(jù)入院時腦灌注加權(quán)成像（PWI）結(jié)果，分成腦側(cè)支循環(huán)建立組與腦灌注不足組，其中腦灌注不足組又分成尤瑞克林干預(yù)組與非尤瑞克林干預(yù)組。3組第1天和第10天分別查血管生成素-1水平。結(jié)果①血管生成素-1水平腦側(cè)支循環(huán)建立組[（84.50±38.31）ng/mL vs.（111.00±53.10）ng/mL]和尤瑞克林干預(yù)組[（74.45±53.48）ng/mL vs.（103.97±61.53）ng/mL]第1、10天各自組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-4.450、-3.864，P＜0.05），而非尤瑞克林干預(yù)組[（81.94±44.61）ng/mL vs.（104.85±56.07）ng/mL]組內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-1.756，P＞0.05）。②血管生成素-1水平第1天、第10天腦側(cè)支循環(huán)建立組與灌注不足組組間以及尤瑞克林干預(yù)組與非尤瑞克林干預(yù)組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。③第1天血管生成素-1水平與磁共振PWI參數(shù)rCBV、rCBF、MTT均無相關(guān)性（r=-0.002、0.075、-0.139）。結(jié)論 未發(fā)現(xiàn)血管生成素-1與急性期腦梗死側(cè)支循環(huán)建立存在相關(guān)性。

血管生成素-1；急性期腦梗死灶；側(cè)支循環(huán)

血管生成素（ANG）屬于核酸內(nèi)切酶超家族成員，是存在于血清中的正常人體蛋白，是一種分泌型的生長因子[1-2]。該家族主要由ANG-1，ANG-2，ANG-3，ANG-4四種因子組成，其相對分子量14KDa，結(jié)構(gòu)為123個氨基酸殘基組成的單鏈堿性蛋白，其中ANG-1是血管特異性生長因子，主要參與血管的重塑，成熟及穩(wěn)定過程[3-5]。本研究探討ANG-1與急性期腦梗死側(cè)支循環(huán)建立是否存在相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年6月～2016年6月本科住院腦梗死患者99例，男77例，女22例。根據(jù)入院時頭顱磁共振腦灌注加權(quán)成像（PWI）結(jié)果，分成腦側(cè)支循環(huán)建立組與腦灌注不足組，其中腦灌注不足組根據(jù)是否使用尤瑞克林分成尤瑞克林干預(yù)組與非尤瑞克林干預(yù)組。腦側(cè)支循環(huán)建立組37例，男27例，女10例，平均年齡（64.32±10.86）歲；灌注不足組（尤瑞克林干預(yù)組+非尤瑞克林干預(yù)組）共62例，其中尤瑞克林干預(yù)組38例，男31例，女7例，平均年齡（63.81±10.55）歲，非尤瑞克林干預(yù)組24例，男19例，女5例，平均年齡（64.50±9.89）歲。腦側(cè)支循環(huán)建立組合并糖尿病3例，高血壓2例，冠心病1例；尤瑞克林干預(yù)組合并糖尿病4例，高血壓5例，冠心病1例，高同型半胱氨酸1例；非尤瑞克林干預(yù)組合并高血脂2例，高血壓3例。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，3組性別，年齡，慢性疾?。ㄌ悄虿?、高血壓、高血脂、高同型半胱氨酸、心臟?。鼰熓?，家族史等資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。本研究均得到患者知情同意，并通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn) ①發(fā)病時間＜48 h；②入院時有明顯的局灶神經(jīng)癥狀和體征，NIHSS評分≥3分；③年齡＞18歲；④頭顱CT排除顱內(nèi)出血；⑤符合第四屆全國腦血管病會議通過的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①長期慢性病患者（合并全身多系統(tǒng)損害如：慢性腫瘤，尿毒癥，心力衰竭，呼吸衰竭，全身免疫性疾病，血液病等）；②NIHSS評分＜3分或＞21分；③既往有腦出血，腦腫瘤，腦外傷及其他腦部疾病；④短暫性腦缺血發(fā)作（TIA），腦栓塞。

1.4 方法

1.4.1 記錄所有患者姓名，性別，住院號，年齡，聯(lián)系電話，家庭住址。

1.4.2 嚴(yán)格按照入選和排除標(biāo)準(zhǔn)，對所有入選患者均按倫理學(xué)原則簽署知情同意書。所有入選患者入院24 h內(nèi)做頭顱MRI+PWI+MRA檢查。測量PWI參數(shù)局部腦血流量（rCBF），局部腦血容量（rCBV），達(dá)峰時間（TTP），平均通過時間（MTT），入院第1天觀測生命體征（體溫、呼吸、脈博、血壓），查血管生成素-1，（化驗(yàn)血水、電解質(zhì)、血糖、血脂、同型半胱氨酸、肝功能、腎功能），心電圖、超聲心動圖檢查。

1.4.3 ANG-1檢測：全血標(biāo)本請于室溫放置2 h或4℃過夜后于2℃～8℃ 1 000xg離心15 min，取上清即可立即檢測；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測。將各種試劑移至室溫（18℃～25℃）平衡至少 30 min，按前述方法配制試劑，備用。加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔。每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本100μL，輕輕晃動混勻，覆上板貼，37℃溫育2 h。棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100μL，覆上新的板貼，37℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，200μL/每孔，甩干。 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100μL，覆上新的板貼，37℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200μL/每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光顯色15～30 min。依序每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)。在反應(yīng)終止后5min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

1.4.4 腦側(cè)支循環(huán)建立組和尤瑞克林非干預(yù)組的常規(guī)腦梗死治療包括：使用阿司匹林抗血小板聚集，同時予血栓通改善循環(huán)，腦蛋白水解物營養(yǎng)腦細(xì)胞，阿托伐他汀調(diào)脂穩(wěn)定斑塊，配合康復(fù)針灸處理，調(diào)控血壓等處理。

1.4.5 尤瑞克林干預(yù)治療包括：常規(guī)腦梗死治療基礎(chǔ)上，加上0.9%氯化鈉注射液250 mL+尤瑞克林0.15 PNA單位，靜滴，1次/d，共7 d。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)均用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組ANG-1第1天、第10天水平各組內(nèi)比較 腦側(cè)支循環(huán)建立組的ANG-1水平第10天顯著增高，與第1天比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。尤瑞克林干預(yù)組的ANG-1水平第10天顯著增高，與第1天比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而非尤瑞克林干預(yù)組的ANG-1水平第10天與第1天水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 3組ANG-1第1天、第10天水平各組內(nèi)比較Table 1 Comparison ofANG-1 levels first days,tenth days between three groups

2.2 腦側(cè)支循環(huán)建立組與腦灌注不足組第1天血管生成素-1比較 腦側(cè)支循環(huán)建立組水平（84.58±38.31）ng/mL和腦灌注不足組水平（77.35±49.99）ng/mL之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.760，P＞0.05）。

2.3 尤瑞克林干預(yù)組與非尤瑞克林干預(yù)組第1天ANG-1比較 尤瑞克林干預(yù)組（74.45±53.48）ng/mL與非尤瑞克林干預(yù)組（81.94±44.61）ng/mL的水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.571，P＞0.05）。

2.4 尤瑞克林干預(yù)組與非尤瑞克林干預(yù)組第10天ANG-1比較 尤瑞克林干預(yù)組（103.97±61.53）ng/mL與非尤瑞克林干預(yù)組（104.85±56.07）ng/mL的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.125，P＞0.05）。

2.5 尤瑞克林干預(yù)組與非尤瑞克林干預(yù)組第1天與第10天的ANG-1增幅程度比較 尤瑞克林干預(yù)組（28.62±28.81）ng/mL與非尤瑞克林干預(yù)組（22.90±24.28）ng/mL比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.817，P＞0.05）。

2.6 ANG-1水平與rCBV相關(guān)性分析 ANG-1與CBV的線性相關(guān)顯著性檢驗(yàn)P＞0.05，因而ANG-1與CBV變量之間不存在顯著的線性相關(guān)，ANG-1與CBV pearson相關(guān)系數(shù)r1=-0.002（相關(guān)系數(shù)絕對值越接近于0，絕對值皆小于0.2，相關(guān)度極弱或無相關(guān)）。

2.7 ANG-1與rCBF線性相關(guān)分析 ANG-1與rCBF的線性相關(guān)顯著性檢驗(yàn)P＞0.05，因而ANG-1與rCBF、變量之間不存在顯著的線性相關(guān)，ANG-1與rCBF的pearson相關(guān)系數(shù)r2=0.075，（相關(guān)系數(shù)絕對值越接近于0，絕對值皆小于0.2，相關(guān)度極弱或無相關(guān)）。

2.8 ANG-1與MTT的線性相關(guān)分析 ANG-1與MTT的線性相關(guān)顯著性檢驗(yàn)P＞0.05，因而ANG-1與MTT變量之間不存在顯著的線性相關(guān)，而且ANG-1與MTT pearson相關(guān)系數(shù)r3=-0.139（相關(guān)系數(shù)絕對值越接近于0，絕對值皆小于0.2，相關(guān)度極弱或無相關(guān)）。

3 討論

腦側(cè)支循環(huán)的形成始于胚胎期[6]，是連接腦動脈之間的許多血管吻合支，出生后，其中一部分吻合支退化閉鎖，一部分保留下來，形成了腦側(cè)支循環(huán)的解剖基礎(chǔ)。腦血管閉塞后側(cè)支循環(huán)開放分三級[7]：首先開放的是Wiliis環(huán)。Wiliss環(huán)雖然為腦梗死患者的腦血管重新分配提供了一種有效的途徑，但是完全依賴于Wiliss環(huán)代償罕見。常見的是以軟腦膜支吻合支代償或其他多種代償。二級側(cè)支循環(huán)是指一系列軟腦膜側(cè)支形成和眼動脈逆流。雖然次級側(cè)支循環(huán)提供的血流不如Wiliss環(huán)，但缺血病灶都存在不同形式的繼發(fā)側(cè)支循環(huán)代償。遠(yuǎn)端供血如果此時仍不能得到滿足，機(jī)體就會使用三級側(cè)支循環(huán)，即新生血管[8]。血管新生是指新生的毛細(xì)血管從已存在的血管側(cè)支的出芽與再塑，包括：①血管舒張，內(nèi)皮通透性增加，基底膜溶解。②內(nèi)皮細(xì)胞增生，遷徙。③管腔形成，再塑，內(nèi)皮細(xì)胞分化成熟，動脈形成包括血管平滑肌的增生，遷徙，分化及再塑，即血管平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用[9]。腦缺血后的血管生成是一個復(fù)雜的精細(xì)的調(diào)控過程，研究證實(shí)[10-11]，腦缺血后機(jī)體“自身代償性的血管生成”所形成的側(cè)支循環(huán)與局部組織釋放的內(nèi)源性促血管生長因子有關(guān)。它們在腦缺血后血管新生過程中發(fā)揮重要作用。目前對ANG-1及其受體Tie-2通路（ANG-1/Tie-2）的研究較為透切。腦缺血后，ANG-1/Tie-2通路能促進(jìn)缺血腦組織周圍側(cè)支循環(huán)建立，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)元，同時穩(wěn)定血管，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接，延緩血管退化，維持血腦屏障的完整性，從而改善腦缺血的神經(jīng)功能[12-14]。國外有研究發(fā)現(xiàn)[15]，Ang-1與Tie-2表達(dá)缺失小鼠表現(xiàn)為血管分支減少，血管叢稀疏，血管通透性增加，血管直徑變小，血管網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性明顯下降，存在嚴(yán)重血管發(fā)育缺陷，其血管生長明顯受阻，并最終導(dǎo)致胚胎死亡。Ang-1轉(zhuǎn)基因小鼠則表現(xiàn)為血管腔增大，毛細(xì)血管，小靜脈數(shù)量和分支增多，還能通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和血管周圍間質(zhì)細(xì)胞的相互作用維持管腔的完整性和穩(wěn)定性，可以形成穩(wěn)定的不滲漏的血管，并能對抗血小板活化因子PAF等炎性因子產(chǎn)生的內(nèi)膜滲漏[16]。動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵喟l(fā)現(xiàn)[17]：ANG水平在腦缺血6小時后明顯上升，如果缺血持續(xù)24 h，則ANG水平進(jìn)一步升高。Lin[18]等發(fā)現(xiàn)，ANG蛋白在腦梗死后2周內(nèi)可持續(xù)升高，與正常對照組對比，ANG蛋白可增加8倍。國內(nèi)劉媛媛等[19]對急性期腦梗死患者的Ang-1進(jìn)行動態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)：Ang-1水平在發(fā)病48 h內(nèi)及3 d，稍低于對照組，7 d后顯著升高，14 d達(dá)到高峰。同時大梗死灶患者7 d和14 d的Ang-1均高于中小梗死灶患者。上述國內(nèi)外一系列報道均說明ANG-1有促進(jìn)血管新生，參與三級側(cè)支循環(huán)建立的作用。但我們能否通過ANG-1水平的高低或者變化，推測腦梗死灶周圍側(cè)支循環(huán)建立與否，兩者是否存在相關(guān)性，目前國內(nèi)外研究較少。

本研究將3組第1天和第10天ANG-1水平進(jìn)行組內(nèi)比較，我們發(fā)現(xiàn)腦側(cè)支循環(huán)建立組和尤瑞克林干預(yù)組第1天和第10天查ANG-1水平組內(nèi)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而非尤瑞克林干預(yù)組的組內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ANG-1水平在腦梗死過程中出現(xiàn)變化，這與目前國內(nèi)外研究是一致的。而非尤瑞克林干預(yù)組無差異，考慮與病例數(shù)偏少有關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)第1天腦側(cè)支循環(huán)建立組和腦灌注不足組之間的ANG-1水平組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明腦側(cè)支循環(huán)建立組的ANG-1水平并沒有高于腦灌注不足組的水平。尤瑞克林干預(yù)組和非干預(yù)組之間的差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義，第10天復(fù)查3組之間的差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。我們再比較尤瑞克林干預(yù)組和非尤瑞克林干預(yù)組第1天和第10天組內(nèi)ANG-1水平的增幅的組間差異。因?yàn)橛热鹂肆炙幮W(xué)試驗(yàn)顯示：在臨床劑量下，該藥選擇性擴(kuò)張缺血部位細(xì)小動脈，促進(jìn)缺血部位的微血管新生和側(cè)支循環(huán)的形成[20]，我們推測尤瑞克林干預(yù)組經(jīng)藥物干預(yù)后會誘發(fā)側(cè)支循環(huán)建立，設(shè)想在尤瑞克林干預(yù)組中ANG-1水平升高幅度可能會與非尤瑞克林干預(yù)組存在差異，但結(jié)果兩者差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。我們再嘗試將ANG-1分別和PWI中參數(shù)“rCBV，rCBF，MTT”分別做線性相關(guān)性分析，結(jié)果均是陰性。

綜上所述，結(jié)合本研究病例，ANG-1暫未發(fā)現(xiàn)能作為評估腦側(cè)支循環(huán)是否建立的量化指標(biāo)。ANG-1與腦側(cè)支循環(huán)是否建立暫未發(fā)現(xiàn)存在相關(guān)性。由于本研究病例數(shù)不多，其結(jié)果僅能代表部分樣本的情況，下一步仍需繼續(xù)收集病例，做進(jìn)一步探討。

[1]Hansen TM,Singh H,Tahir TA,et al.Effects of angiopoietins-1 and-2 on the receptor tyrosine kinase Tie2 are differentially regulated at the endothelial cell surface[J].Cellular Signalling,2010,22(3):527-532.

[2]趙文強(qiáng)，歐陽星文，方昱，等.急性冠狀動脈綜合征患者血漿血管生成素家族譜的序列演變[J].中國老年學(xué)雜志，2016，36（9）：2140-2142.

[3]Davis S,Aldrich TH,Jones PF,et al.Isolation of angiopoietin-1，a ligand for the TIE2 receptor，by secretion trap expression cloning[J].Cell,1996,27(87):1161-1169.

[4]翁丹，尹國武，張志培，等.血管生成素在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中表達(dá)的臨床意義探討[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2016，32（1）：49-53.[5]Valenzuela DM,Griffths JA,Rojas J,et al.Angipoietin 3and 4,Dixerging gene counter part sin miceand humans[J]. Proce NatlAcad SciUSA, 1999,96(5):1904-1908.

[6]Okahara M,Kiyosue H,Mori H,et al.Anatomic variations of the cerebral arteries and their embryology:A pictorial review[J].Eur Radiol,2002,12(10):2548-2561.

[7]王擁軍.腦側(cè)支循環(huán)肌氧化應(yīng)激對其影響[J].中國卒中雜志，2008，3（3）：198-199.

[8]Reinhard M,Muller T,Guschlbauser B,et al.Dynamic cerebral autoregulation and collateral flow patterns in patients with severe carotid stenosis or occlusion[J].Ultrasound Med Biol,2003,29(8):1105-1113.[9]Carmeliet P.Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis[J].Nature Medicine,2000,6(3):289-295.

[10]Sun Y,Jin K,Xie L,et al.VEGF-induced neuroprotection，neurogenisis,and angiogenesis after focal cerebral ischemia[J].J Clin Invest,2003,111(12):1843-1851.

[11]Ziegler SF,Bird TA,Schneriger JA,et al.Molecular cloning ad characterization of a novel receptor protein tyrosine kinase from human placenta[J].Oncogen,1993,8:663.

[12]Hansen TM,Moss AJ,Brindle NP.Vascular endothelial growth factor and angiopoietins in neurovascular regeneration and protection following stroke[J].Curr Neurovasc Res,2008(5):236-245.

[13]Ardlt AA,McCullough LD,Korach KS,et al.Estradiol regulates angiopoietin-1 mRNA expression through estrogen receptor-a in a rodent experimental stroke model[J].Stroke,2005(36):337-341.

[14]Beck H,Acker T,Wiessner C,et al.Expression of angiopoietin-1, angiopoietin-2, and tie receptors after middle cerebral artery occlusion in the rat[J].Am J Pathol,2000,157:1473-1483.

[15]XU JY,Zheng P,shen DH,et al.Vascular endothelial growth factor inhibits outward delayed-rectifier potassium currents in acutely isolated hippocampal neurons[J].Neuroscience,2003(118):59-67.

[16]Sun FY,Cuo X.Molecular and cellular mechanisms of neuroprotection by vascular endothelial growth factor[J].J Neurosci Res,2005(79):180-184.

[17]Zhang ZG,Zhang L,Tsang W,et al.Correlation of VEGF and angiopoietin expression with disruption ofblood-brainbarrierandangiogenisafterfocal cerebral ischemic[J]. J Cereb Blood Flow Metab,2002,22(4):379-392.

[18]Lin TN,Wang CK,Cheung WM,et al.Induction of angiopoietinandTiereceptormRNAexpressionafter cerebral ischemic-reperfusion[J]. J Cereb Blood Flow Metab,2000,20(2):387-395.

[19]劉媛媛，潘莉，郭晉，等.急性期腦梗死血清VEGF及Ang-1水平的動態(tài)變化及其意義[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，37（10）：1178-1180.

[20]Chao J,Chao L.Kallikrein—kinin in stroke，cardiovascular and renal disease[J].Exp Physiol,2005,90(1):291-298．

The study of the correlation betweenAngiogenin-1 and the establishment of collateral circulation around the acute cerebral infarction focus

Wang Kai,Wang Hai-jun
(Department of Neurology,General Hospital of Fushun Mining Bureau,Fushun,Liaoning,113008,China)

Objective Investigate whether there is correlation between Ang-1 and the establishment of collateral circulation in acute cerebral infarction.Methods 99 patients were collected,ultimately the 99 cases were into the group.All the patients were performed on the head MR within 24 hours.According to the PWI,all the patients were divided into the cerebral collateral circulation group and the cerebral hypoperfusion group,the latter was divided into the Urinary Kallidinogenase intervention group and non intervention group.All patients were checked the angiopoietin-1 and do it again after 10 days.Results ①There was statistically significant difference between 1 day and 10 days both in the cerebral collateral circulation group[(84.50±38.31)ng/mLvs.(111.00±53.10)ng/mL,t=-4.450,P＜0.05]and the Urinary Kallidinogenase intervention group[(74.45±53.48)ng/mL vs.(103.97±61.53)ng/mL,t=-3.864,P＜0.05].But no statistically significant existed in the non urinary kallidinogenase intervention group[(81.94±44.61)ng/mL vs.(104.85±56.07)ng/mL,t=-1.756,P＞0.05].② In the first day No statistically significant difference was found between the cerebral collateral circulation group and cerebral hypoperfusion group,so did the Urinary Kallidinogenase intervention group and non intervention group.There were no statistically differences between the Urinary Kallidinogenase intervention group and non intervention group after 10 days.The increases between 1 day and 10 day was no statistically significant between the Urinary Kallidinogenase intervention group and non intervention group.③The level of the Ang-1 was not correlated with rCBV,rCBF and MTT in the first day(r=-0.002、0.075、-0.139).Conclusion There isn’t correlation betweenAng-1 and the establishment of collateral circulation in acute cerebral infarction according to the cases.

Angiogenin-1;The acute cerebral infarction;Collateral circulation

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.28.006