惠青山，吳芷芷，程琳

銀杏提取物聯(lián)合順鉑對(duì)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖凋亡的影響

惠青山，吳芷芷，程琳

（濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院，山東 青州 262500）

目的 研究銀杏提取物（GBE）聯(lián)合化療藥物順鉑對(duì)人腦膠質(zhì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和凋亡的影響。方法 正常培養(yǎng)傳代后的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞按隨機(jī)分配的方法分為4組，A組僅加普通培養(yǎng)液，B、C、D組分別加銀杏提取物（200 mg/mL）0.5 mL、順鉑（1 mg/mL）0.01 mL、銀杏提取物（200 mg/mL）0.5 mL＋順鉑（1 mg/mL）0.01 mL；MTT法觀察U251細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)U251細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 培養(yǎng)12、24、36、48、60 h，B、C、D組細(xì)胞增殖指數(shù)逐漸下降，與A組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D組與B、C組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。將各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后上機(jī)，測(cè)得A組、B組、C組、D組腫瘤細(xì)胞的凋亡率分別為（0.6±0.3）%、（19.3±1.2）%、（38.9±3.5）%、（58.1±3.1）%。其中，B組、C組、D組分別與A組進(jìn)行比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；將D組與B組和C組進(jìn)行比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 銀杏提取物（GBE）聯(lián)合順鉑可抑制人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。

銀杏提取物（GBE）；U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞；順鉑抗腫瘤藥物；凋亡

在腦腫瘤治療中，中成藥的輔助治療是一種重要的輔助手段，近年來(lái)，對(duì)銀杏提取物以及其制劑的研究不僅在治療心血管以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病變獲得突破[1-6]，在對(duì)腫瘤的治療上也備受關(guān)注。銀杏提取物是富含多種聚戊烯醇（GP）、銀杏黃酮、銀杏外種皮多糖等多種抗腫瘤成分[7-8]，具有顯著的對(duì)抗腫瘤生長(zhǎng)特性并且具有輔助化學(xué)藥物治療的作用[9-11]。2017年1月我們進(jìn)行了銀杏提取物（GBE）聯(lián)合順鉑對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究，研究?jī)?nèi)容如下。

1 材料與方法

1.1 材料 U251人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株，DMEM培養(yǎng)基，小牛血清蛋白，MTT試劑，順鉑藥物（藥物濃度為1 mg/mL），異硫氰酸熒光素—碘化丙染色試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 銀杏提取物（GBE）制備方法[12]將銀杏葉采用丙酮溶液提取后，除掉其脂溶、水溶性的物質(zhì)成分和蛋白質(zhì)、多聚糖等等一些高分子的化合物。

1.2.2 在顯微鏡下觀察染色后每組腫瘤細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)。

1.2.3 U251腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)和抑制情況觀察 把各分組細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整為5×103/mL，接種96孔板，每孔1 mL，同時(shí)每組分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。用緩沖溶液沖洗2遍后加入MTT試劑，然后在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量570 nm波長(zhǎng)下每組腫瘤細(xì)胞的光密度值（OD），來(lái)衡量細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的情況。計(jì)算其抑制率。抑制率為1-實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度。

1.2.4 U251腫瘤細(xì)胞的凋亡率計(jì)算 將培養(yǎng)24 h后的各組腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行異硫氰酸熒光素/碘化丙染色熒光染色；然后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，按A、B、C、D組置孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取得每組的3個(gè)數(shù)值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，按“x±s”記錄得出的每組腫瘤細(xì)胞的凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)均用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計(jì)數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下觀察染色后各組U251腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn) A組U251腫瘤細(xì)胞條索樣生長(zhǎng)，細(xì)胞密度高；B組U251腫瘤細(xì)胞突起減少，腫瘤細(xì)胞數(shù)量也減少，且開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞空泡化現(xiàn)象；C組U251細(xì)胞邊界開(kāi)始模糊，細(xì)胞空泡和顆粒較為明顯增多，出現(xiàn)許多凋亡小體：D組U251腫瘤細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)明顯空泡化現(xiàn)象，并且有許多凋亡小體出現(xiàn)。見(jiàn)圖1～4。

圖1 空白組 Figure 1 blank group

圖2 銀杏提取物Figure 2 GBE group

圖3 順鉑組Figure 3 DDP group

圖4 聯(lián)合組Figure 4 GBE+DDP group

2.2 各組U251細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制情況 培養(yǎng)12、24、36、48、60 h，B、C、D組細(xì)胞增殖指數(shù)逐漸下降，與A組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D組與B、C組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞的抑制率分別在培養(yǎng)12、24、36、48、60 h，均為A＜B＜C＜D。見(jiàn)表1、2。

2.3 各組U251細(xì)胞凋亡率的比較 將各組培養(yǎng)24 h后上機(jī)，測(cè)得A、B、C、D各組細(xì)胞的凋亡率分別為（0.3±0.2）%，（10.6±1.5）%，（35.9±2.8）%，（52.1±4.1）%。其中，B、C、D各組和A組進(jìn)行比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；將D組與B、C組兩組進(jìn)行比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。U251細(xì)胞的凋亡率為A＜B＜C＜D，同時(shí)反映細(xì)胞被抑制程度為A＜B＜C＜D。

表1 各組U251細(xì)胞生長(zhǎng)情況（x±s）Table 1 Growth of U251 cell after treated wth different drugs for different time(x±s)

表2 各組U251抑制率比較Table 2 Inhibition rate of U251 cell after treated wth different drugs for different time

3 討論

銀杏，孑遺植物。銀杏葉具有很高的藥用價(jià)值，主要以用于腦缺血、腦缺氧等臨床治療，而對(duì)其抗腫瘤的研究較少。近幾年，研究表明，銀杏提取物中的多種聚戊烯醇（GP）、銀杏黃酮、銀杏外種皮多糖化合物，含有具有顯著的抗腫瘤活性[13-16]。其可能作用機(jī)制涉及抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化和凋亡等[17-18]。本研究結(jié)果表明，銀杏提取物（GBE）對(duì)U251腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象要比對(duì)照組明顯，并且凋亡率也明顯增高。

順鉑作為一類臨床常用的抗腫瘤藥物，也是臨床上較為有效的化療藥物之一，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制能力，其中處于G期的腫瘤細(xì)胞最為敏感，僅應(yīng)用順鉑就可以達(dá)到25%～50%的有效率，且少見(jiàn)有交叉耐藥的現(xiàn)象。本研究結(jié)果表明，銀杏提取物（GBE）聯(lián)合順鉑治療組較單獨(dú)分別治療的細(xì)胞抑制效果增強(qiáng)，而且細(xì)胞凋亡也增加。這表明，銀杏提取物（GBE）可提高腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，兩者有協(xié)同加強(qiáng)效果。其可能的原因是銀杏提取物中的GBEP能調(diào)節(jié)免疫機(jī)制，影響bax基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[19-20]。另外，順鉑可通過(guò)對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)整，對(duì)腫瘤抗原調(diào)變的雙重作用，從而增強(qiáng)銀杏提取物提取物（GBE）的抗腫瘤作用[21]。

綜上所述，銀杏提取物（GBE）聯(lián)合順鉑可抑制人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，期望成為新型藥物，填補(bǔ)化療藥物輔助的空白。

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The effect of Ginkgo Biloba Extracts combined with cisplatin on proliferation and apoptosis of human glioblastoma U251 cells

Hui Qing-shan,Wu Zhi-zhi,Cheng Lin
(Weifang Nursing vocational College,Qingzhou,Shandong,262500,China)

Objective To observe the effect of Cisplatin combinated with the Ginkgo Biloba Extracts on proliferation and apoptosis of U251 glioma cells.Methods Divide the handed U251cellsintofourgroupsrandomly.Add nutrient solution to A,whileaddactivatedGinkgoBilobaExtracts(200 mg/mL)0.5 mL to B,cisplatin(1 mg/mL)0.01 mL to C,Ginkgo Biloba Extracts(200 mg/mL)0.5 mL and cisplatin(1 mg/mL)0.01 mL to D.Observe the proliferation rate of U251 by MTT and analysis the apoptosis of U251 cells by the flow cytometric.Results The index of cell proliferation of B、C、D goroup declined Gradually with the training of 12 h,24 h,36 h,48 h,60 h.Compared B,C,D with A,the difference was statistically significant(P＜0.05),and compared group D with B and C,the difference was statistically significant(P＜0.05).After the training of 24 h,the cell apoptosis rate of group A,B,C,D was(0.6±0.3)%,(19.3±1.2)%,(38.9±3.5)%,(58.1±3.1)%respectively.Compared B,C,D with A,the difference was statistically significant(P＜0.05),and compared group D with B and C,the difference was statistically significant(P＜0.05).Conclusion Ginkgo Biloba Extracts combined with cisplatin can restrain the proliferation of U251 glioma and also lead to the apoptosis of U251 cells.

Ginkgo Biloba Extracts;U251 Glioma cells;CisplatinAntineoplastic Drugs;Apoptosis

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.28.004