羅健，焦洋，楊彥鳳

(1.重慶子勻環(huán)保工程有限公司，重慶 400039；2.中國(guó)兵器工業(yè)第五九研究所，重慶 400039)

腐生葡萄球菌脂肪酶3制備及酶活性研究

羅健1，焦洋1，楊彥鳳2

(1.重慶子勻環(huán)保工程有限公司，重慶 400039；2.中國(guó)兵器工業(yè)第五九研究所，重慶 400039)

克隆得到腐生葡萄球菌M36的脂肪酶3編碼基因，構(gòu)建了Pet28-Ss-Lip3表達(dá)質(zhì)粒，在大腸菌株中獲得腐生葡萄球菌脂肪酶3的高效上清表達(dá)，應(yīng)用Ni2+-NTA親和層析柱獲得了純度約90%的重組脂肪酶，分子篩檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其在溶液中主要以單體形式存在。酶活性分析純化后的脂肪酶最適宜的反應(yīng)pH值為7.0，溫度為40 ℃。結(jié)果表明，腐生葡萄球菌脂肪酶3的堿性和溫度耐受性較好，有望通過(guò)定點(diǎn)突變獲得更好適應(yīng)性的脂肪酶。

脂肪酶；腐生葡萄球菌；純化；酶活性

微生物在傳統(tǒng)污水處理中扮演著重要角色，但生物制藥、石油化工等新興行業(yè)污水成分復(fù)雜多樣，一般的微生物對(duì)于高難度、高濃度的廢水束手無(wú)策。近年來(lái)，利用定向進(jìn)化技術(shù)和基因工程技術(shù)篩選出具有靶向性的生物酶制劑，能夠有針對(duì)性地降解傳統(tǒng)生物處理方法無(wú)法降解的污染物。其中，脂肪酶(Lipase, EC 3.1.1.3)，又名甘油酯水解酶，屬羧基酯水解酶類(lèi)，能在油水界面上水解甘油三酯中酯鍵，可以催化長(zhǎng)鏈或短鏈、飽和或不飽和酯的水解，廣泛應(yīng)用于環(huán)保、食品、皮革、洗滌劑、醫(yī)藥以及生物柴油等工業(yè)領(lǐng)域[1,2]。大多數(shù)脂肪酶在乙醇溶液中醇解三酰基甘油，而不是甲醇，因?yàn)楹芏嗟拿冈诩状贾袝?huì)失去酶活性[3]。目前發(fā)現(xiàn)的脂肪酶在室溫環(huán)境下的活性很低，酶的穩(wěn)定性和pH值范圍比較小，影響了其推廣使用[4-5]。本文以腐生葡萄球菌脂肪酶為研究對(duì)象，克隆了腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)的脂肪酶3編碼基因，在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)并純化了腐生葡萄球菌脂肪酶，并對(duì)其活性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1粒、菌種及培養(yǎng)條件

質(zhì)粒pET28a購(gòu)買(mǎi)Novagen。大腸桿菌(E.coli) DH5α和BL21(DE3)用于質(zhì)粒的構(gòu)建和脂肪酶表達(dá)。所有菌株培養(yǎng)均采用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)。根據(jù)試驗(yàn)需要，向LB培養(yǎng)基中添加卡那霉素(終濃度50 μg /mL)。向LB 培養(yǎng)基中添加終濃度為20 μg /mL的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行脂肪酶表達(dá)誘導(dǎo)。

1.1.2試劑

LB 培養(yǎng)基各配料購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，PCR用高保真DNA聚合酶購(gòu)自Takara公司，各限制性內(nèi)切酶和DNA 連接酶等購(gòu)自Takara公司，DNA瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermentas公司。其他試劑均為市售分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)操作如E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒DNA 的抽提及純化、限制性酶切、DNA 片段的連接和轉(zhuǎn)化、PCR、核酸凝膠電泳和蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳等操作按文獻(xiàn)進(jìn)行，枯草芽孢桿菌的感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化按文獻(xiàn)進(jìn)行。

1.2.2基因克隆

以腐生葡萄球菌M36基因組DNA 為模板，采用引物forward primer (5’-CTAGGATCCATGCAGATTAAACTTCCAGAACC-3’)(下劃線為BamHI)和reverse primer(5’-TCACTCGAGTTAATTCGACCAATCTAATGATTC-3’)(下劃線為XhoI)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為: 預(yù)變性(94 ℃，8 min)，變性(94 ℃，30 s)、退火(60 ℃，30 s)、延伸(72 ℃，50 s)，共20個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，與載體pET28a分別在37 ℃水浴進(jìn)行BamHI和XhoI雙酶切3 h，然后使用T4 DNA連接酶將目的基因與載體在16 ℃水浴進(jìn)行過(guò)夜連接。然后轉(zhuǎn)化到克隆菌株大腸桿菌(E.coli) DH5α中，從轉(zhuǎn)化后的LB平板上挑選多個(gè)單克隆菌，依次接種于LB液體培養(yǎng)基中(5 mL，卡那霉素抗性)，放置于震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃，200 rpm)至OD600為0.2，挑取菌液為模板進(jìn)行PCR鑒定。繼續(xù)培養(yǎng)PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液至OD600為0.8～1.0，收集細(xì)菌并提取質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切(37 ℃，4 h)，瓊脂糖電泳鑒定雙酶切結(jié)果。將酶切鑒定陽(yáng)性結(jié)果送生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。得到的重組質(zhì)粒命名為Pet28-Ss-Lip3。

1.2.3化表達(dá)菌及誘導(dǎo)表達(dá)脂肪酶

將Pet28-Ss-Lip3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21)，再接種于LB平板上(卡那霉素抗性)，放置于37 ℃溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)；從LB平板上挑選過(guò)個(gè)單克隆菌，依次接種于LB培養(yǎng)基中(200 mL，卡那霉素抗性)，放置于震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃，200 rpm)至OD600為0.4～0.6，加入IPTG(終濃度為0.1 mM)后放入搖床于低溫(20 ℃，200 rpm)誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h。

1.2.4肪酶純化

低溫離心(4 ℃，4000 rpm)15 min收集菌體，加入Lysis 緩沖液(PBS，100 mM，pH 7.4；NaCl，300 mM)攪拌均勻后冰水浴中超聲破碎至菌液清涼；低溫高速離心(4 ℃，12000 rpm)30 min收集上清，低速穿過(guò)預(yù)平衡的Ni2+-NTA親和層析柱；先后分別用10柱體積Lysis 緩沖液和Washing緩沖液(PBS，100 mM， pH 7.4；NaCl，300 mM；20 mM、30 mM和40 mM咪唑)先后分別洗脫非特異結(jié)合蛋白質(zhì)，最后用Elution緩沖液(PBS，100 mM，pH 7.4；NaCl，300 mM；200 mM咪唑)洗脫目的蛋白質(zhì)。

純化結(jié)果用SDS-PAGE電泳驗(yàn)證，然后將目的蛋白質(zhì)用超濾緩沖液(PBS，5 mM，pH 7.4；50 mM NaCl)稀釋脫鹽并超濾濃縮至濃度約1 mg/L, 分裝后于-80 ℃保存。分子篩(Superdex 200)用牛白蛋白V (66.2 kDa)、雞白蛋白(44.2 kDa)、糜蛋白酶原A (24.5 kDa)和溶菌酶(14.4 kDa)進(jìn)行標(biāo)定。重組腐生葡萄球菌M36脂肪酶3的洗脫體積為80.1 mL，對(duì)應(yīng)溶液中分子量為鑒定溶液中分子量，標(biāo)準(zhǔn)分子19.2 kDa。

1.2.5酶活性鑒定

脂肪酶活性檢測(cè)方法參考Ratnaningsih等的方法，脂肪酶的活性檢測(cè)以PPNP(棕櫚酸對(duì)硝基苯酯)為底物[6-7]。將0.9 mL 0.1MpPNP與0.1 mL脂肪酶溶液進(jìn)行混合，并于55 ℃孵育，于410 nm檢測(cè)產(chǎn)物pNP(對(duì)硝基苯酚)的吸收峰。酶活單位定義為：在pH 8.0，37 ℃條件下，以pNPP為底物，1 min內(nèi)水解產(chǎn)生1 μM的pNP所需的脂肪酶量定義為一個(gè)酶活力單位U。

酶的最適pH值的范圍為4.0～10.0，緩沖液體系分別為：檸檬酸緩沖液(pH 4.0～6.0)，Tris-HCl緩沖液(pH 7.0～8.0)，甘氨酸緩沖液(pH 9.0～10.0)。pH值穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)是將酶反應(yīng)體系在40 ℃相應(yīng)的pH值緩沖液中孵育30 min后的檢測(cè)活性。最適溫度檢測(cè)范圍為25～60 ℃，反應(yīng)的緩沖體系為T(mén)ris-HCl緩沖液pH 7.0，脂肪酶熱穩(wěn)定性為在相應(yīng)的溫度下孵育30 min后的檢測(cè)活性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1基因克隆與表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

以本實(shí)驗(yàn)室保存的腐生葡萄球菌M36提取的基因組為模板，PCR擴(kuò)增(圖1A)后進(jìn)行雙酶切，然后雙酶切后的pET28a載體進(jìn)行連接，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定(圖1B和1C)，送生物公司DNA序列測(cè)定。結(jié)果顯示，沒(méi)有發(fā)生移碼和突變。

圖1 脂肪酶基因克隆與表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建Fig.1 Gene cloning and plasmid construction of Staph. saprophyticus lipase 3

2.2表達(dá)與純化目的蛋白質(zhì)

超聲破碎得到的上清液的SDS-PAGE結(jié)果顯示，目的蛋白質(zhì)在大腸桿菌BL21中大量表達(dá)，且以可溶性蛋白質(zhì)形式表達(dá)(圖2泳道1和2)。用Elution緩沖液洗脫后用SDS-PAGE驗(yàn)證，目的蛋白質(zhì)純度約90%(圖2泳道8)。分子篩superdex200洗脫顯示，重組腐生葡萄球菌M36脂肪酶3為單洗脫峰，對(duì)應(yīng)溶液中分子量約為19.2 kDa，證明其在溶液中主要單體形式(monomer)存在。

圖2 脂肪酶的表達(dá)與純化Fig.2 Expression and purification of SDS-PAGE analysis of Staph. saprophyticus lipase 3

圖3 分子篩層析圖Fig.3 Chart of size exclusion chromatography

2.3目的蛋白質(zhì)脂肪酶活性鑒定

純化后的脂肪酶最適宜的反應(yīng)pH值為7.0，但是該重組酶能夠在堿性緩沖液體系(pH 9.0～10.0)催化降解p-NPP(圖4A)，而且在40 ℃反應(yīng)溫度下，30 min后仍然保持了約40%的酶活性(圖4B)。

純化后的重組脂肪酶的最適宜反應(yīng)溫度為35～40 ℃，但是在反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)，仍能保持30%的活性，即使在30 min后，同樣能夠保持20%的活性。

上述結(jié)果顯示，腐生葡萄球菌M36的脂肪酶3具有對(duì)pH值和溫度的適應(yīng)范圍比較廣，在相對(duì)極端的條件下，仍然保持有較好的酶活性。

圖4 脂肪酶3的酶活性測(cè)定Fig.4 Activity and stability of purified recombinant Staph. saprophyticus lipase 3

3 討論

本研究制備重組腐生葡萄球菌M36的脂肪酶3屬于堿性脂肪酶，在高pH值(pH 10.0)情況下仍然具有約70%的酶活性(圖3A)。Nthangeni等發(fā)現(xiàn)重組地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)脂肪酶的最適宜pH值為10.0～11.5[8]，重組的Bacillussp. HH-01脂肪酶在pH 4.0～11.0具有穩(wěn)定的酶活性[9]，B.amyloliquefaciensNsic-8脂肪酶對(duì)堿性環(huán)境也有一定的適應(yīng)性[10]。Nthangeni等認(rèn)為除了這些脂肪酶本身具有耐堿性結(jié)構(gòu)外，位于重組蛋白質(zhì)氨基或者羧基端的His-Tag提升了對(duì)堿性環(huán)境的耐受性[8]。

Bacillussp. HH-01脂肪酶的最適宜溫度為30 ℃，B.amyloliquefaciensNsic-6脂肪酶在20～60 ℃具有較高的酶活性，而本研究報(bào)道的腐生葡萄球菌M36的脂肪酶3在40 ℃活性最高，比以前報(bào)道的堿性脂肪酶具有更好的高溫適應(yīng)性[19-20]。腐生葡萄球菌M36脂肪酶3分子篩顯示其在溶液中以單體形成存在，表明沒(méi)有形成分子間二硫鍵。該脂肪酶氨基酸一級(jí)序列分析發(fā)現(xiàn)，僅在37Cys和118Cys位存在2個(gè)半胱氨酸，表明這一對(duì)半胱氨酸可能形成分子間二硫鍵，但是目前尚缺乏該脂肪酶的三維結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步確認(rèn)。下一步將進(jìn)行腐生葡萄球菌M36脂肪酶3的三維結(jié)構(gòu)解析，闡明其堿性和溫度耐受性的分子基礎(chǔ)，有望通過(guò)定點(diǎn)突變實(shí)現(xiàn)定向進(jìn)化而獲取具有更好適應(yīng)性的脂肪酶。

[1] Vaquero ME, Barriuso J, Martínez MJ, et al. Properties, structure, and applications of microbial sterol esterases [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2016, 100(5): 2047- 2061.

[2] Barriuso J, Martínez MJ. Evolutionary history of versatile-lipases from Agaricales through reconstruction of ancestral structures [J]. BMC Genomics, 2017, 18(1): 12.

[3] Barriuso J, Vaquero ME, Prieto A, et al. Structural traits and catalytic versatility of the lipases from the Candida rugosa-like family: A review. Biotechnol Adv, 2016, 34(5): 874- 85.

[4] Abrunhosa L, Oliveira F, Dantas D, et al. Lipase production byAspergillusibericususing olive mill wastewater [J]. Bioprocess Biosyst Eng, 2013, 36(3): 285- 291.

[5] Nadar SS, Rathod VK. Sonochemical Effect on Activity and Conformation of Commercial Lipases [J]. Appl Biochem Biotechnol, 2017, 181(4): 1435- 1453.

[6] Ozcan B, Ozyilmaz G, Cokmus C, et al. Characterization of extracellular esterase and lipase activities from five halophilic archaeal strains [J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2009, 36(1): 105- 110.

[7] Sharma R, Chisti Y, Banerjee UC. Production, purification, characterization, and applications of lipases [J]. Biotechnol Adv, 2001, 19(8): 627-662.

[8] Nthangeni MB, Patterton H, van Tonder A, et al. Overexpression and properties of a purified recombinantBacilluslicheniformislipase: A comparative report on Bacillus lipases [J]. Enzyme Microb Technol, 2001, 28(7): 705- 712.

[9] Kamijo T, Saito A, Ema S, et al. Molecular and enzymatic characterization of a subfamily I.4 lipase from an edible oil-degraderBacillussp. HH-01[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 2010, 99(2): 179- 187.

[10] Cai X, Ma J, Wei DZ, et al. Functional expression of a novel alkalineadapted lipase ofBacillusamyloliquefaciensfrom stinky tofu brine and development of immobilized enzyme for biodiesel production [J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2014，106(5): 1049- 1060.

Study on Purification and Enzymic Activity of Lipase3from Staph. saprophyticus M36

LUO Jian, JIAO Yang, YANG Yan-feng

(1.Chongqing Ziyun Environment Engineering Co., Ltd., Chongqing 400039, China; 2.No. 59 Institute, China Ordnance Industry, Chongqing 400039, China)

The lipase gene from Staph.saprophyticus M36 was cloned into pet28a vector. The recombinant lipase 3 was expressed in the supernatant of theEcolilysate. The lipase was purified by Ni2+-NTA affinity column with about 90% purity. The size exclusion chromatography experiment confirmed that Lipase 3 existed as monomer in solution. The optimum pH and temperature of the recombinant lipase were 7.0 and 40 ℃, respectively. Collectively, the recombinant lipase 3 had excellent tolerance for alkaline buffer and temperature, implying it was a good candidate for directed evolution to solution to lipase for commercial purposes.

lipase;Staph.saprophyticus; purification; enzymic activity

10.14068/j.ceia.2017.05.020

X172

： A

： 2095-6444(2017)05-0093-04

2017-05-24

羅健(1971—)，男，四川瀘縣人，工程師，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境工程微生物，E-mail：673359479@qq.com

焦洋(1978—)，男，貴州貴陽(yáng)人，工程師，碩士，主要研究方向?yàn)楣I(yè)廢水處理，E-mail：122089103@qq.com