生靜雅， 朱海軍， 劉廣勤， 萬(wàn) 青①

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院休閑農(nóng)業(yè)研究所， 江蘇 南京 210014； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所， 江蘇 南京 210014)

不同薄殼山核桃品種的根際土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及多樣性研究

生靜雅1， 朱海軍2， 劉廣勤2， 萬(wàn) 青1①

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院休閑農(nóng)業(yè)研究所， 江蘇 南京 210014； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所， 江蘇 南京 210014)

選擇江蘇薄殼山核桃主產(chǎn)區(qū)波尼(BN)、馬漢(MH)、威斯頓(WSD)和肖肖尼(XXN)這4個(gè)主要品種，利用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)研究其根際土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成。結(jié)果顯示，4種薄殼山核桃品種間根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門(mén)、屬水平上相似，α多樣性指數(shù)無(wú)顯著差異。變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)均為優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)，假單胞菌屬 (1%) 和Chitinophagaceae菌群(5%)在4個(gè)薄殼山核桃品種的根際土壤中豐度均較高。研究初步闡述了薄殼山核桃根際土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成，為進(jìn)一步研究薄殼山核桃的根際效應(yīng)提供了理論依據(jù)。

薄殼山核桃； 根際細(xì)菌； 多樣性； 胡桃醌

根際微生物的種群數(shù)量及多樣性是評(píng)價(jià)林地土壤肥力高低的重要生物學(xué)指標(biāo),而土壤肥力是土壤質(zhì)量的重要組成部分,是林地生產(chǎn)力的基礎(chǔ)[1]。大量研究表明,根際微生物對(duì)土壤肥力、植株抗逆性、生長(zhǎng)發(fā)育以及生產(chǎn)力有著極其重要的作用[2-3]。根瘤菌和弗蘭克氏菌等根際固氮菌能夠提高作物產(chǎn)量,增強(qiáng)植物對(duì)氮素的吸收[4]。假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和農(nóng)桿菌屬等能通過(guò)產(chǎn)生生長(zhǎng)激素或信號(hào)分子、競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)位點(diǎn)、產(chǎn)生鐵載體等促生機(jī)制來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng),增強(qiáng)對(duì)病原菌的抗性和忍耐力[5-7]。與此同時(shí),植物通過(guò)根際分泌物來(lái)調(diào)控和影響根際微生物的數(shù)量、種類(lèi)及生態(tài)分布[8-9]。近年來(lái),利用生物工程技術(shù)在分子水平上研究植物根際微生物多樣性的研究已有大量報(bào)道[10-11],但大部分研究主要針對(duì)農(nóng)作物,林木根際土壤微生物多樣性研究鮮有報(bào)道。因此,開(kāi)展林木根際土壤微生物多樣性研究,將有助于通過(guò)人工調(diào)節(jié)根際微環(huán)境的生物活性來(lái)改善林地的生態(tài)環(huán)境和質(zhì)量,從而為解決林木連栽引起的地力衰退和林木根部土傳病害等問(wèn)題以及增強(qiáng)林地的生產(chǎn)力提供技術(shù)支持。

薄殼山核桃(Caryaillinoensis),又名美國(guó)山核桃和長(zhǎng)山核桃,為胡桃科(Juglandaceae)山核桃屬 (Caryanutt)植物,是我國(guó)主要的干果經(jīng)濟(jì)作物,也是最早發(fā)現(xiàn)的化感植物之一[12]。目前,對(duì)薄殼山核桃根際微生物多樣性的研究鮮有報(bào)道。鑒于此,筆者以江蘇主產(chǎn)區(qū)的薄殼山核桃為研究對(duì)象,利用高通量測(cè)序技術(shù)研究4個(gè)主要薄殼山核桃品種的根際土壤細(xì)菌區(qū)系組成和群落結(jié)構(gòu)差異,為薄殼山核桃根際微生態(tài)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),同時(shí)為進(jìn)一步研究不同土壤環(huán)境以及營(yíng)林方式對(duì)薄殼山核桃根際土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)的多樣性影響提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于泗洪縣峰山鄉(xiāng)大紅山,地處蘇北平原西部,屬北亞熱帶和北暖溫帶季風(fēng)氣候區(qū),四季分明,年均氣溫15 ℃,年均日照時(shí)數(shù)2 206.2 h,年均降水量960.4 mm,年均無(wú)霜期203 d。試驗(yàn)地地形屬崗坡地,土壤為砂礓土,基本理化指標(biāo)如下:pH值為6.74,有機(jī)碳含量為12.81 g·kg-1,有機(jī)質(zhì)含量為22.83 g·kg-1,陽(yáng)離子交換量為25.1 cmol·kg-1,黏粒(<0.002 mm)、粉粒(0.002～0.05 mm)、砂粒(>0.05 mm)體積分?jǐn)?shù)分別為7.4%、32.5%和52.2%。

供試材料為試驗(yàn)園結(jié)實(shí)穩(wěn)定的4個(gè)品種:波尼(BN)、馬漢(MH)、威斯頓(WSD)和肖肖尼(XXN),樹(shù)齡為8年生,株行距為6 m×8 m,南北行向,樹(shù)勢(shì)較強(qiáng)。土壤采樣時(shí)間為2015年5月,是薄殼山核桃的果實(shí)灌漿期。

1.2 研究方法

1.2.1土壤取樣

在上述4個(gè)品種薄殼山核桃種植區(qū)各選擇1個(gè)20 m×30 m的標(biāo)準(zhǔn)地,在每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)地內(nèi)選取3株樹(shù)齡相同的薄殼山核桃樹(shù),在距樹(shù)干基部0.5 m處分別設(shè)置5個(gè)取樣點(diǎn),用內(nèi)徑10 cm的土鉆分層挖取0～20、>20～40和>40～60 cm深度土壤,采集各層直徑0.1～0.5 cm的細(xì)根,用抖落法獲取其上粘附的土壤作為根際土壤,將根際土壤分別混合裝入已消毒的密封塑料袋中,放入冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將同一品種的根際土壤充分混合后,共形成4個(gè)根際土樣,一部分于-70 ℃條件下冷凍備用,用于分析根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu);另一部分風(fēng)干、過(guò)篩,用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)。

1.2.2土壤微生物DNA的提取

采用MOBIO Power Soil DNA Isolation kit試劑盒(MOBIO公司,美國(guó))稱(chēng)取0.5 g新鮮土壤,按照說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行提取。將提取得到的土壤微生物總DNA溶解于100 μL去離子水中,取5 μL DNA用φ=1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),分析DNA的完整性和相對(duì)濃度。

1.2.316S rRNA 基因擴(kuò)增及Miseq測(cè)序

采用引物515F/806R (F5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′,R5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)擴(kuò)增16S rRNA的V4可變區(qū)片段[13]。PCR擴(kuò)增程序如下:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共25個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min結(jié)束。獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后,使用AXYGEN公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒,切膠回收PCR產(chǎn)物。將每個(gè)樣品等比例混合后,依托Illumina公司Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序 (由上海生工生物技術(shù)有限公司提供)。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

將Miseq雙端測(cè)序數(shù)據(jù),首先根據(jù)單端測(cè)序序列(PE reads)之間的重疊關(guān)系,用FLASH軟件(Version 1.2.3)進(jìn)行拼接,然后依托Prinseq軟件(Version 0.20.4)對(duì)低復(fù)雜度的序列進(jìn)行質(zhì)量控制過(guò)濾。采用RDP classifier軟件對(duì)處理后序列進(jìn)行物種分類(lèi),依次為域、門(mén)、綱、目、科和屬[14]。

1.2.5微生物多樣性及聚類(lèi)分析

利用Monthur軟件(Version 1.35.1)計(jì)算樣品的α多樣性指數(shù),反映不同品種薄殼山核桃根際土壤細(xì)菌群落的豐度和多樣性,包括Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Coverage指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)[15]。

β多樣性分析：基于物種分類(lèi)分析,采用RDP classifier將序列進(jìn)行物種分類(lèi),對(duì)不同樣本和每個(gè)物種單元分類(lèi)進(jìn)行序列豐度計(jì)算,構(gòu)建代表性序列為節(jié)點(diǎn)的進(jìn)化樹(shù)與物種豐度矩陣,分析比較不同薄殼山核桃品種根際細(xì)菌群落的同源性。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際細(xì)菌的多樣性指數(shù)分析

將4種不同薄殼山核桃根際土壤樣品的reads標(biāo)準(zhǔn)化后分析得到的OTU數(shù)量進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)并無(wú)顯著性差異。通過(guò)微生物多樣性指數(shù)比較不同品種薄殼山核桃根際土壤的α多樣性 (表1),由ANOVA分析可知,就不同薄殼山核桃品種的根際土壤微生物多樣性比較而言,除Chao指數(shù)有一定差異以外,其他指數(shù)并無(wú)顯著性差異 (P>0.05)。BN、MH、XXN和WSD的根際土壤微生物ACE指數(shù)分別為27 855、24 059、23 686 和22 175。從Shannon指數(shù)分析來(lái)看,BN(8.067)和MH (7.877)的根際土壤微生物物種豐富度較高,其次為XXN(7.631),WSD的根際土壤微生物物種豐富度最低(7.468)。就Chao指數(shù)而言,BN(19 848)、MH (18 008)和XXN(16 861)顯著高于WSD (14 886)?？梢?jiàn),以上3種多樣性指數(shù)的計(jì)算結(jié)果相似,均表明BN的根際土壤微生物多樣性最高,WSD的根際土壤微生物多樣性最低,MH和XXN的根際土壤微生物多樣性在兩者之間。

表14種薄殼山核桃根際土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)

Table1DiversityindexofthesoilbacteriaintherhizosphereunderCaryaillinoensisrelativetovariety

山核桃品種OTUAce指數(shù)Chao指數(shù)Shannon指數(shù)Simpson指數(shù)Coverage指數(shù)BN8862±827a27855±2518a19848±1814a8067±0221a0002a0858±0031aMH7737±789a24059±5212a18008±1513a7877±0495a0002a0868±0023aWSD6666±1125a22175±4621a14886±1635b7468±0681a0002a0896±0010aXXN7299±886a23686±3981a16861±1682a7631±0582a0002a0873±0274a

同一列數(shù)據(jù)后英文小寫(xiě)字母相同表示不同山核桃品種某指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。

2.2 根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性

BN、MH、XXN和WSD的根際土壤分別含有19、20、20和21個(gè)門(mén)類(lèi)菌群。4個(gè)薄殼山核桃品種根際土壤菌群中豐度最高的10大主要門(mén)類(lèi)相同,分別為變形菌門(mén)、類(lèi)細(xì)菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、疣微菌門(mén)、硝化螺旋菌門(mén)、裝甲菌門(mén)和酸桿菌門(mén)。由門(mén)水平菌群聚類(lèi)堆積圖(圖1)可以看出,BN和XXN根際細(xì)菌主要門(mén)水平相對(duì)豐度的同源性較高,而WSD則與其他品種薄殼山核桃土壤根際細(xì)菌的相對(duì)豐度分布差異最大。XXN和WSD土壤根際菌群結(jié)構(gòu)更為相似,聚類(lèi)于1簇。

因顏色種類(lèi)有限,豐度低于0.5%的細(xì)菌均用白色表示。

從其他分類(lèi)層級(jí)上看,4個(gè)薄殼山核桃品種的根際土壤微生物分布也較為相似,從屬水平上的菌群聚類(lèi)堆積圖(圖1)可以看出,BN和XXN土壤根際細(xì)菌在屬水平的相對(duì)豐度同源性較高,而MH則與其他品種土壤根際細(xì)菌的相對(duì)豐度分布差異最大。

主成分分析(PCA)結(jié)果(圖2)與聚類(lèi)圖結(jié)果一致,XXN和BN聚類(lèi)于1簇。未鑒定到屬的OTU以及豐度較低的微生物種群占50%左右,其他優(yōu)勢(shì)菌屬主要集中在50個(gè)種屬間,分別為亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)、Azospira、Aquicella、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Hallangium和鏈霉菌屬(Steptomyces)等,豐度均在1%以上。其中Chitinophagaceae科在4種薄殼山核桃根際土壤樣品中豐度均在5%以上,Chitinophagaceae科由Balneola、Filimonas、Flavisolibacter、Gracilimonas、Lacibacter、Niastella、Terrimonas和Chitinophaga共8個(gè)屬組成[16]。

圖2 不同分類(lèi)水平的根際細(xì)菌組成聚類(lèi)主成分分析

2.3 根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

將4種薄殼山核桃品種根際土壤樣品的OTU分布進(jìn)行Venn圖分析,結(jié)果見(jiàn)圖3。4種薄殼山核桃的根際土壤樣品中均有分布的OTU數(shù)量為2 145,共有OTU數(shù)量最多的是BN和XXN(5 338),最少是BN和WSD(3 450);3種美國(guó)薄殼山核桃品種的根際土壤樣品共有最多的組合是BN、XXN和 MH(3 429),說(shuō)明這3個(gè)品種根際土壤微生物群落組成的同源性較高,該結(jié)果與圖1一致;4種薄殼山核桃的根際土壤樣品中獨(dú)有OTU數(shù)從大到小依次為BN(2 634)、MH(2 378)、WSD(1 775)和XXN(1 009)。

在門(mén)分類(lèi)水平上對(duì)4種薄殼山核桃根際土壤樣品所含菌屬進(jìn)行聚類(lèi),對(duì)聚類(lèi)后的各樣品中不同OTU所含序列豐度進(jìn)行Heatmap分析(圖4),該圖能夠反映門(mén)水平上各根際土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性。變形菌門(mén)在4種薄殼山核桃的根際土壤微生物菌群中豐度最高。MH根際土壤細(xì)菌群落中黏膠球形菌門(mén)豐度高于其他3種薄殼山核桃品種;XXN根際土壤細(xì)菌群落的衣原體門(mén)和裝甲菌門(mén)豐度高于其他3種薄殼山核桃品種;BN根際土壤細(xì)菌群落的藍(lán)藻門(mén)豐度高于其他3種薄殼山核桃品種。

3 討論

根際指受植物根部釋放物質(zhì)而影響微生物活性的土壤區(qū)域,由于受植物種類(lèi)、生長(zhǎng)階段和土壤性質(zhì)等影響,根際土壤微生物的數(shù)量和種類(lèi)要多于根外的土壤微生物,它們?cè)诟系姆敝澈头植际芨瞪L(zhǎng)發(fā)育的影響而表現(xiàn)出較為明顯的根際效應(yīng)。由于根際土壤微生物在植物的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換中扮演著重要角色,一定程度上決定著植物生產(chǎn)力的高低[17]。因此,根際土壤微生物多樣性一直以來(lái)是根際效應(yīng)研究的主體[18-19]。該研究基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)4種薄殼山核桃的根際土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行了初步研究,α多樣性指數(shù)顯示,4種薄殼山核桃的根際土壤細(xì)菌多樣性無(wú)顯著性差異;β多樣性分析結(jié)果表明,4種薄殼山核桃的根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門(mén)、屬水平相似,但在低豐度的根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)方面存在一定特異性。變形菌門(mén)、類(lèi)細(xì)菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)在4種薄殼山核桃的根際土壤細(xì)菌中都屬于優(yōu)勢(shì)菌群。從屬水平和OUT多樣性分析結(jié)果來(lái)看,BN、XXN和MH的根際土壤微生物群落組成的同源性較高,但不同品種薄殼山核桃根際土壤的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)存在差異性,這也說(shuō)明薄殼山核桃根際土壤菌群結(jié)構(gòu)存在一定的種間差異。有研究發(fā)現(xiàn),不同種的海棠根系代謝活力存在一定差異,導(dǎo)致其根系分泌物的物質(zhì)數(shù)量和組成不同,進(jìn)而直接或間接影響根際土壤微生物的數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)[20]。

綠色、黃色、紅色、藍(lán)色分別代表波尼(BN)、馬漢(MH)、肖肖尼(XXN)和 威斯頓(WSD)這4個(gè)不同薄殼山核桃品種。圖中數(shù)據(jù)代表 不同品種山核桃根際土壤之間共有OTU數(shù)量。

圖4 基于門(mén)分類(lèi)水平的不同土壤樣品OTU分布的Heatmap 分析Fig.4 Heatmap tree based on OTU analysis of soil bacteria at the phylum level in soil samples from the rhizosphere of Carya illinoensis relative to variety

化感植物通過(guò)根系分泌各種化感物質(zhì)對(duì)根際微生物的種類(lèi)、數(shù)量和分布產(chǎn)生影響,進(jìn)一步對(duì)根際定殖的微生物分類(lèi)群和功能群進(jìn)行選擇[10]。水稻根際存在30多種特異微生物,其中7種被鑒定為黏細(xì)菌(myxobacteria),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),黏細(xì)菌對(duì)水稻根系分泌物中的酚酸類(lèi)物質(zhì)具有明顯的趨化促進(jìn)作用[11]。薄殼山核桃根系分泌的胡桃醌在土壤種性質(zhì)極其穩(wěn)定,且不隨季節(jié)發(fā)生改變,是一種典型的化感植物[8]。有研究表明,假單胞菌屬能通過(guò)自身水解酶降解胡桃醌等化感物質(zhì)而在核桃根際有效定植[9],筆者的研究結(jié)果與其一致。Chitinophagaceae菌群在4種薄殼山核桃根際土壤中豐度較高,而大量研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)該菌群廣泛存在于水稻[4]、小麥[5]、人參[6]和紫莖澤蘭[10]等產(chǎn)化感物質(zhì)的植物根際土壤中。因此,推測(cè)薄殼山核桃根系的化感物質(zhì)胡桃醌可能誘導(dǎo)假單胞菌屬和Chitinophagaceae菌群這類(lèi)具有趨化性的細(xì)菌在其根際中大量定植。

土壤理化因子、林木種類(lèi)及不同營(yíng)林方式是影響林木根際微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素[21]?；兄参锿ㄟ^(guò)根系分泌各種化感物質(zhì)對(duì)根際微生物的種類(lèi)、數(shù)量和分布產(chǎn)生影響,進(jìn)一步對(duì)根際定殖的微生物分類(lèi)群和功能群進(jìn)行選擇[22-23]。土壤溫度、pH值及有機(jī)質(zhì)含量通過(guò)影響土壤微生物的數(shù)量與種類(lèi)間接影響根際微生物的多樣性[24-25]。哪些環(huán)境因子影響著薄殼山核桃的根際細(xì)菌多樣性?不同營(yíng)林方式對(duì)薄殼山核桃根際細(xì)菌多樣性的影響如何?這些問(wèn)題還需通過(guò)進(jìn)一步試驗(yàn)開(kāi)展深入研究。

綜上所述,筆者通過(guò)Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)4種薄殼山核桃根際土壤細(xì)菌多樣性及菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)薄殼山核桃根際土壤的細(xì)菌以變形菌門(mén)和類(lèi)細(xì)菌門(mén)為主要優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi),同時(shí)發(fā)現(xiàn)了薄殼山核桃根際土壤中含有的特有菌屬主要是假單胞菌屬和Chitinophagaceae菌群,關(guān)于這2類(lèi)菌群對(duì)胡桃醌的趨化性研究仍需一步開(kāi)展。

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CommunityStructureandDiversityofSoilBacteriainRhizospheresUnderDifferentVarietiesofCaryaillinoensis.

SHENGJing-ya1,ZHUHai-jun2,LIUGuang-qin2,WANQing1

(1.Institute of Leisure Agriculture, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2.Institute of Pomology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

The Miseq molecular technology was used to explore difference between 4 varieties ofCaryaillinoensis(“BN”、“MH”、“XXN” and “WSD”) in community structure and diversity of soil bacteria in rhizosphere. It was found that the 4 varieties did not vary much in community structure and diversity of soil bacteria in rhizosphere at the phylum and genus levels or in α-diversity index. Proteobacteria, Bacteroidetes and Gemmatimonadete were dominant phyla.Pseudomonas(1%) and Chitinophagaceae (5%) were quite high in mean abundance in the rhizosphere of all the four varieties of Carya illinoensis, which might be attributed to the chemotaxis of juglone. This study has tentatively elaborated community structure and diversity of the soil bacteria in rhizosphere of theCaryaillinoensistrees and may serve as theoretical basis for future studies on rhizosphere effect ofCaryaillinoensis.

Caryaillinoensis； rhizosphere bacteria； diversity； juglone

X825

： A

： 1673-4831(2017)09-0816-06

10.11934/j.issn.1673-4831.2017.09.007

生靜雅(1984—),女,江蘇南京人,助理研究員,碩士,研究方向?yàn)楸ど胶颂业雀晒N栽培研究。E-mail: shengjingya1984@126.com

(責(zé)任編輯： 許 素)

2016-10-10

2015年中央財(cái)政林業(yè)科技推廣項(xiàng)目([2015]TJS03)

① 通信作者E-mail: oneqq-17@163.com