李 斌，呂 政

（1.福建省公安廳刑事技術(shù)總隊(duì)，福建 福州350003；2.福州市鼓樓區(qū)公安局，福建 福州350003）

利用AutoMate ExpressTM系統(tǒng)提取陳舊性骨骼DNA

李 斌1，呂 政2

（1.福建省公安廳刑事技術(shù)總隊(duì)，福建 福州350003；2.福州市鼓樓區(qū)公安局，福建 福州350003）

目的 建立利用AutoMate ExpressTM系統(tǒng)提取陳舊性骨骼DNA的方法。 方法 將骨骼用冷凍研磨機(jī)研磨成骨粉，經(jīng)AutoMate ExpressTM系統(tǒng)提取后，用Identifiler?Plus、MiniFilerTM試劑盒擴(kuò)增分型。 結(jié)果10例保存在不同環(huán)境中、死亡時(shí)間在10～20年的骨骼樣本利用AutoMate ExpressTM系統(tǒng)3 h內(nèi)完成DNA提取，有8例獲得完整STR分型。 結(jié)論AutoMate ExpressTM系統(tǒng)能快速、高效地提取陳舊性骨骼DNA，可應(yīng)用于法醫(yī)實(shí)際案件檢驗(yàn)。

法醫(yī)遺傳學(xué)；骨骼；DNA；AutoMate ExpressTM系統(tǒng)

近年來(lái)，骨骼DNA檢驗(yàn)技術(shù)已取得很大進(jìn)展，在實(shí)際案件的偵破中發(fā)揮重要作用。但是，對(duì)于陳舊性骨骼，由于細(xì)胞含量少，以及長(zhǎng)時(shí)間受埋葬環(huán)境的影響，其DNA的提取仍然是鑒定工作的難點(diǎn)[1]。本研究利用AutoMate ExpressTM系統(tǒng)自動(dòng)快速提取陳舊性骨骼DNA，并結(jié)合運(yùn)用MiniFilerTM試劑盒，獲取理想的STR分型結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 樣本材料

本研究選取的骨骼來(lái)自美國(guó)北德州大學(xué)法醫(yī)遺傳中心實(shí)驗(yàn)室日常檢案中收集的10例白骨化骨頭（隨機(jī)編為1～10號(hào)樣本），其中股骨、肱骨各5例；保存環(huán)境有土壤、埋葬的棺杶和暴露在公路、山林等；尸體估計(jì)死亡時(shí)間在10～20年。

1.2 儀器與試劑

PrepFiler Express BTATM試劑盒、QuantifilerTM法醫(yī)人類(lèi)DNA定量試劑盒、Identifiler?Plus試劑盒、MiniFilerTM試劑盒，AutoMate ExpressTM系統(tǒng)、7500型熒光定量PCR儀、3130xl型基因分析儀。以上儀器和試劑全部來(lái)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 骨骼前處理

用手術(shù)刀片刮除并洗凈骨骼表面的垢物，置于紫外光下照射30 min。將骨骼的骨干鋸成小骨片，取小骨片置燒杯中用5%次氯酸鈉溶液浸泡15 min后棄去液體，用水洗凈次氯酸鈉直至沒(méi)有氯氣味，再用無(wú)水乙醇浸泡5 min棄去液體，小骨片置于通風(fēng)櫥中自然風(fēng)干。而后，將小骨片用冷凍研磨機(jī)磨成骨粉備用。

1.3.2 DNA提取

稱(chēng)取骨粉0.2 g置于2 mL的管中，加入375μL PrepFiler BTATMLysis緩沖液、5μL 1 mol/L DTT、10μL PK。56℃溫浴振蕩消化2.5 h，離心半徑8.6 cm，13 300 r/min，離心2 min，轉(zhuǎn)移上清液至樣品管中，與PrepFiler Express BTATM試劑盒一起放入AutoMate ExpressTM系統(tǒng)中，選擇Prepfiler BTA程序提取DNA。每次實(shí)驗(yàn)有空白對(duì)照。具體操作步驟按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 DNA定量

采用QuantifilerTM法醫(yī)人類(lèi)DNA定量試劑盒在7500型熒光定量PCR儀上進(jìn)行DNA定量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 STR擴(kuò)增及其電泳分型

用Identifiler?Plus和MiniFilerTM試劑盒進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25μL，模板量為10μL，Identifiler? Plus試劑盒擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為29個(gè)循環(huán)、MiniFilerTM試劑盒擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物在3130xl型基因分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，用GeneMapper?ID v3.2軟件分析。

2 結(jié) 果

10例保存在不同環(huán)境中、死亡時(shí)間在10～20年的骨骼樣本，經(jīng)過(guò)AutoMate ExpressTM系統(tǒng)處理，提取到的DNA質(zhì)量濃度在0.012～0.218 ng/μL，用Identifiler? Plus試劑盒擴(kuò)增，有3例獲得完整STR分型；結(jié)合MiniFilerTM試劑盒，獲得完整STR分型樣本數(shù)提高到8例（表1）。其中，10～12年的骨骼樣本經(jīng)AutoMate ExpressTM系統(tǒng)處理，提取的DNA質(zhì)量濃度較高，在0.108～0.218 ng/μL，可獲得較好的STR分型。如1號(hào)樣本土中埋葬約10年的股骨，用AutoMate ExpressTM系統(tǒng)提取DNA后，經(jīng)Identifiler?Plus試劑盒擴(kuò)增，獲得完整STR分型，譜帶相對(duì)熒光單位（RFU）最高峰值為1 631 RFU（圖1）。

表1 不同骨骼樣本情況和DNA分型結(jié)果

圖1 土中埋葬約10年的股骨Identifiler?Plus分型

用AutoMate ExpressTM系統(tǒng)處理13年以上的骨骼樣本，提取的DNA質(zhì)量濃度在0.012～0.084 ng/μL，用Identifiler?Plus試劑盒擴(kuò)增，峰高不平衡，出現(xiàn)不同程度的等位基因丟失現(xiàn)象，較難獲得理想的STR分型。結(jié)合MiniFilerTM試劑盒擴(kuò)增，大部分可獲得完整的STR分型。如樣本10暴露在山上樹(shù)林死亡時(shí)間約20年的股骨，提取DNA經(jīng)Identifiler?Plus試劑盒擴(kuò)增，獲得不完全DNA分型，大片段基因座如CSF1PO、D2S1338、D18S51有等位基因丟失現(xiàn)象，譜帶最高峰值為644RFU。結(jié)合MiniFilerTM試劑盒擴(kuò)增，所有基因座均得到DNA分型，譜帶最高峰值為1 471 RFU（圖2）。

圖2 樣本10的基因分型

3 討 論

提取陳舊性骨骼DNA所面臨的難點(diǎn)在于如何有效去除PCR抑制物，減少外部污染，獲得大量和高質(zhì)量的DNA模板。AutoMate ExpressTM系統(tǒng)在解決上述問(wèn)題上有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）提取時(shí)間短。使用AutoMate ExpressTM系統(tǒng)，骨粉消化時(shí)間只需2～2.5 h（筆者通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)延長(zhǎng)消化時(shí)間直至過(guò)夜，并沒(méi)有提高DNA提取效果），系統(tǒng)中運(yùn)行0.5 h，總共需3 h就能完成提取過(guò)程，與高林林等[2]研究結(jié)果相同，并且可同時(shí)做13個(gè)樣本，快速、高效。而傳統(tǒng)方法[3-5]需24 h消化、脫鈣后才能開(kāi)始提取步驟。（2）防止污染。骨骼是低拷貝樣本，AutoMate ExpressTM系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便，采用磁性樹(shù)脂的吸附能力，將DNA特異性地結(jié)合在磁性樹(shù)脂上，以達(dá)到純化目的，減少污染的可能性。其他方法如使用QIAquickTM二氧化硅柱吸附純化DNA[6]，操作步驟多，加劇DNA流失，影響DNA回收率，增加了污染的機(jī)會(huì)。（3）有利操作人員的健康。AutoMate ExpressTM系統(tǒng)使用PrepFiler Express BTATM試劑盒由儀器檢驗(yàn)；而目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道[3，7]骨骼DNA提取方法多使用有機(jī)溶劑等化學(xué)試劑。

在使用AutoMate ExpressTM系統(tǒng)提取骨骼DNA時(shí)，由于系統(tǒng)對(duì)樣本消化后的消化液體積要求不能超過(guò)230μL，而骨粉會(huì)吸收裂解液，限制了能夠使用的骨粉量。因此，建議在AutoMate ExpressTM系統(tǒng)上處理陳舊性骨骼，骨粉的最大量不宜超過(guò)0.2 g。PrepFiler BTATMLysis緩沖液需要375μL，才能保證56℃溫浴后能吸取到230μL的上清液。

當(dāng)用Identifiler?Plus試劑盒進(jìn)行常規(guī)STR檢驗(yàn)，只檢出性別等小片段等位基因時(shí)，說(shuō)明骨骼陳舊，DNA降解嚴(yán)重，DNA量少。這時(shí)可結(jié)合采用miniSTR檢驗(yàn)，能顯著提高微量、降解DNA的檢出成功率[8]。

[1]胥少汀，徐印，葛寶豐.實(shí)用骨科學(xué)[M].3版.北京：人民軍醫(yī)出版社，2005：1892-1893.

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DNA Extraction from Old Bones by AutoMate ExpressTMSystem

LI Bin1,LüZheng2
（1.Criminal Technology Agency of Fujian Province Public Security Department,Fuzhou 350003,China; 2.Gulou District Public Security Bureau of Fuzhou City,Fuzhou 350003,China）

Objective To establish a method for extracting DNA from old bones by AutoMate ExpressTMsystem.Methods Bones were grinded into powder by freeze-mill.After extraction by AutoMate ExpressTM, DNA were amplified and genotyped by Identifiler?Plus and MinFilerTMkits.Results DNA were extracted from 10 old bone samples,which kept in different environments with the postmortem interval from 10 to 20 years,in 3 hours by AutoMate ExpressTMsystem.Complete STR typing results were obtained from 8 samples.Conclusion AutoMate ExpressTMsystem can quickly and efficiently extract DNA from old bones,which can be applied in forensic practice.

forensic genetics;bone;DNA;AutoMate ExpressTMsystem

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.04.010

1004-5619（2017）04-0380-03

2015-08-06）

（本文編輯：柳 燕）

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014J01273）

李斌（1972—），女，博士，主任法醫(yī)師，主要從事DNA檢驗(yàn)及鑒定；E-mail：1378856710@qq.com