董塔娜，裴 明，李 娜，朱細(xì)燕，孫俊紅

（1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原030001；2.徐州市公安局刑警支隊(duì)，江蘇 徐州221000）

大鼠骨骼肌挫傷后Fzd2表達(dá)與損傷時(shí)間的關(guān)系

董塔娜1，裴 明2，李 娜1，朱細(xì)燕1，孫俊紅1

（1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原030001；2.徐州市公安局刑警支隊(duì)，江蘇 徐州221000）

目的 檢測(cè)大鼠骨骼肌挫傷后卷曲受體蛋白2（frizzled-2，F(xiàn)zd2）mRNA及其蛋白表達(dá)量與損傷時(shí)間的關(guān)系，探討其是否可以作為損傷時(shí)間推斷的指標(biāo)。 方法 利用RT-qPCR和Western印跡法檢測(cè)正常對(duì)照組及損傷后4～48 h每4 h大鼠骨骼肌中Fzd2 mRNA和蛋白水平的表達(dá)量。 結(jié)果Fzd2 mRNA在損傷后24 h、36 h、40 h相對(duì)表達(dá)量增高，24 h組表達(dá)量達(dá)正常對(duì)照組的兩倍（P＜0.05）；而Fzd2蛋白在損傷后相對(duì)表達(dá)量變化不明顯（P＞0.05）。 結(jié)論 大鼠骨骼肌損傷后Fzd2 mRNA在一定時(shí)間內(nèi)的表達(dá)變化情況可以作為多指標(biāo)聯(lián)合推斷損傷時(shí)間的依據(jù)。

法醫(yī)病理學(xué)；損傷時(shí)間推斷；卷曲受體蛋白2；骨骼肌挫傷

卷曲受體蛋白2（frizzled-2，F(xiàn)zd2）是Wnt通路上細(xì)胞膜Fzd受體家族中的一員，是一種7次跨膜蛋白[1]。在經(jīng)典的Wnt通路中，當(dāng)Wnt與卷曲蛋白-低密度脂蛋白受體相關(guān)復(fù)合物結(jié)合時(shí)，Axin復(fù)合物的形成受到抑制，細(xì)胞內(nèi)β-鏈蛋白（β-catenin）積聚進(jìn)而激活一系列下游基因[2，3]。研究表明，Wnt通路參與生長(zhǎng)、發(fā)育及損傷修復(fù)等多種生物學(xué)過(guò)程[4]。其中Wnt5a參與機(jī)體固有的免疫反應(yīng)，Wnt5a通過(guò)激活Toll/NF-κB調(diào)控IL-6、IL-8、IL-1β以及MIP-1β等炎癥相關(guān)因子的表達(dá)[5]。Wnt通路還在調(diào)控骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞活化中起重要作用[6]，Wnt1、Wnt3a及Wnt5a表達(dá)量的增多可以促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖[7]，而小鼠及人類Wnt3a主要與Fzd2、Fzd4以及Fzd5緊密結(jié)合[1]，所以推測(cè)Fzd2可能與骨骼肌損傷修復(fù)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）和Western印跡法技術(shù)研究大鼠肌肉挫傷后Fzd2 mRNA和蛋白表達(dá)量的變化情況及其與損傷時(shí)間的關(guān)系，探討是否可以用于推斷損傷時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RNAiso Plus 9108、PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒、Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）試劑盒（日本TaKaRa公司），BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物（中國(guó)BOSTER公司），兔抗大鼠Fzd2多克隆抗體、兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體（南京巴傲得公司），HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）。

Sigma 2-16PK臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司），Infinite?200 PRO NanoQuant檢測(cè)儀（瑞士TECAN公司），Bio-Rad CFX384 TouchTM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司），BioSpectrum 810成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）。

1.2 動(dòng)物模型建立及檢材提取

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠78只，10～12周齡，體質(zhì)量250～300 g，均由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為正常對(duì)照組和損傷后4、8、 12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h組，每組6只。3%戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉大鼠，采用參考文獻(xiàn)[8]方法制作大鼠骨骼肌挫傷模型。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)損傷模型大鼠行頸椎脫臼處死，取大鼠右后肢股四頭肌損傷處肌肉組織100 mg置于液氮中，并儲(chǔ)存在-80℃。正常對(duì)照組直接頸椎脫臼處死，取相應(yīng)位置肌肉組織儲(chǔ)存。

1.3 總RNA提取與RT-qPCR

利用RNAiso Plus 9108提取肌肉挫傷樣本中總RNA，Infinite?200 PRO NanoQuant檢測(cè)儀測(cè)量總RNA純度及濃度，D260/D280在1.8～2.0可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取400ng總RNA利用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

內(nèi)參基因Rpl13、Rpl32及目的基因Fzd2的引物及探針設(shè)計(jì)參照參考文獻(xiàn)[9]中的方法進(jìn)行，利用Allele ID6.0軟件進(jìn)行引物及探針設(shè)計(jì)，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 內(nèi)參基因Rpl13、Rpl32及目的基因Fzd2的RT-qPCR引物及探針

按Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)混合液，利用Bio-Rad CFX384 TouchTM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)條件為95℃30 s，95℃5 s，62℃40 s，40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)體系為Taq DNA聚合酶12.5μL，內(nèi)參基因和目的基因上下游引物及探針共3組各0.5μL，10%二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）3μL，去離子水1μL，cDNA 4μL，構(gòu)成總體積25μL的反應(yīng)體系。隨后，以5倍梯度稀釋cDNA，將其作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)量Fzd2、Rpl13和Rpl32的擴(kuò)增效率。正常對(duì)照組和損傷各組cDNA樣本各取4μL分別加入反應(yīng)體系，對(duì)內(nèi)參基因和目的基因進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，利用2-ΔΔCt法得到Fzd2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 總蛋白提取及Western印跡法

利用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒提取挫傷肌肉組織中的總蛋白質(zhì)，參照BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒說(shuō)明書(shū)配制BCA工作液和蛋白提取液的混合液，利用Infinite? 200 PRO NanoQuant測(cè)量蛋白濃度。提取的蛋白樣本中加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，-80℃儲(chǔ)存。

按照SDS-PAGE凝膠制備試劑盒說(shuō)明，配制分離膠和濃縮膠，以GAPDH蛋白為內(nèi)參蛋白，分別利用兔抗大鼠Fzd2多抗，兔抗大鼠GAPDH多抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體及超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物進(jìn)行Western印跡法，隨后通過(guò)BioSpectrum 810成像系統(tǒng)得到條帶信息。正常對(duì)照組和損傷各組Fzd2條帶光密度值經(jīng)相應(yīng)GAPDH條帶光密度值均一化后得到每組Fzd2蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以正常對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算不同損傷時(shí)間組Fzd2蛋白相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)RT-qPCR測(cè)得的Fzd2 mRNA相對(duì)表達(dá)量及Western印跡法條帶光密度值進(jìn)行t檢驗(yàn)及單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取與RT-qPCR

Infinite?200 PRO NanoQuant測(cè)定總RNA的D260/D280值均在1.8～2.0，RNA純度較理想，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

對(duì)cDNA進(jìn)行梯度稀釋后測(cè)量目的基因（Fzd2）及內(nèi)參基因（Rpl13、Rpl32）的擴(kuò)增效率，得到擴(kuò)增效率分別為112.1%、105.5%和103.3%，相關(guān)系數(shù)分別為0.990、0.997和0.997。

2.2 不同損傷時(shí)間Fzd2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

如表2所示，F(xiàn)zd2 mRNA相對(duì)表達(dá)量在肌肉損傷后48 h內(nèi)變化幅度較大。24 h前Fzd2 mRNA相對(duì)表達(dá)量與正常對(duì)照組基本一致，24 h時(shí)增多至正常對(duì)照組的2.17倍，隨后恢復(fù)至對(duì)照組水平，在36h和40h又分別增長(zhǎng)為對(duì)照組的1.41倍和1.63倍（P＜0.05）。

表2 肌肉損傷后不同時(shí)間點(diǎn)Fzd2 mRNA及蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量 （n=6，x±s）

2.3 不同損傷時(shí)間Fzd2蛋白的表達(dá)水平

圖1為Western印跡法化學(xué)顯色后的電泳圖，GAPDH蛋白在不同組別間表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，可以用于Fzd2蛋白表達(dá)量的均一化處理。如表2所示，F(xiàn)zd2蛋白表達(dá)量在肌肉挫傷后48 h內(nèi)均增多，但相較于正常對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示其蛋白表達(dá)量在損傷后均質(zhì)性較差。

圖1 Fzd2及GAPDH蛋白質(zhì)Western印跡法電泳

3 討 論

早期損傷時(shí)間推斷一直是法醫(yī)損傷學(xué)工作中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。Fzd2作為Wnt通路上的重要組成部分，參與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞活化和損傷修復(fù)的過(guò)程[4-6]。在β-catenin依賴性Wnt通路中，當(dāng)Wnt蛋白與由Fzd和LRP 5/6構(gòu)成的受體復(fù)合物結(jié)合時(shí)，Axin復(fù)合物的形成受到抑制，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin積聚到一定水平后與Tcf/Lef結(jié)合形成TCF-β-catenin復(fù)合物，該復(fù)合物為Wnt通路下游目的基因的轉(zhuǎn)錄激活物[2]。且Fzd2在人類基因組及物種間表達(dá)具有一定的同質(zhì)性[10]，有利于該指標(biāo)在動(dòng)物模型研究后用于損傷時(shí)間推斷，為人類損傷時(shí)間推斷提供幫助。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT-qPCR和Western印跡法分析大鼠骨骼肌挫傷后Fzd2 mRNA表達(dá)量及蛋白水平變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)zd2 mRNA在損傷后24、36和40 h表現(xiàn)為增高（P＜0.05），其中24 h表達(dá)量達(dá)到正常對(duì)照組的兩倍以上，其他時(shí)間點(diǎn)Fzd2 mRNA表達(dá)量的變化差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。參照本課題組前期研究[11]，認(rèn)為只有24 h時(shí)Fzd2 mRNA的表達(dá)量存在有效上調(diào)，可以作為損傷時(shí)間推斷的參考。這種變化機(jī)制可能與Fzd2在心肌梗死后成肌纖維細(xì)胞中的上調(diào)相似，即損傷除了激活經(jīng)典Wnt通路，還可能激活了非經(jīng)典的Wnt通路[12]，而非經(jīng)典的Wnt通路中Wnt3a、Wnt4、Wnt5主要與Fzd4、Fzd5結(jié)合[1]。其次，Wnt通路與Notch通路在分子水平上存在相互串聯(lián)、相互作用[13]，Wnt和Notch通路共同參與衛(wèi)星細(xì)胞等多種組織、細(xì)胞的增殖和分化[14]。在血管形成的調(diào)控中，Notch通路的激活可以幫助柄細(xì)胞和尖端細(xì)胞維持自身表型、抑制分化；Wnt通路則促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[15]。在表皮損傷修復(fù)中兩者共同平衡增殖和分化水平[16]。綜上所述，骨骼肌損傷后24 h Wnt通路可能促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，而24 h后Notch通路作用增強(qiáng)，導(dǎo)致Fzd2僅在24 h表達(dá)量增高。

Fzd2蛋白在損傷后存在不同程度增多，但與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析其原因，可能與RNF43和ZNRF3的激活有關(guān)，隨著Wnt通路的激活，作為靶基因的RNF43和ZNRF3被激活，負(fù)反饋調(diào)控引起Fzd受體的泛素化，該過(guò)程往往僅需5 min[17，18]，待檢測(cè)時(shí)Fzd2蛋白部分可能已被泛素化，使得測(cè)得的Fzd2蛋白增長(zhǎng)水平受限，失去統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。也有可能是Fzd2蛋白質(zhì)在損傷后短時(shí)間內(nèi)變化幅度小，以及不同程度的泛素化導(dǎo)致樣本間同質(zhì)性差。此外，樣本數(shù)量過(guò)少的局限性、實(shí)驗(yàn)操作手法導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差過(guò)大、實(shí)驗(yàn)手段靈敏度不足、多克隆抗體特異性較低以及內(nèi)參蛋白校正準(zhǔn)確度不足等都可能引起蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在今后的實(shí)驗(yàn)中將選用更靈敏和準(zhǔn)確的方法進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，這種mRNA與蛋白水平變化的差異在其他指標(biāo)的研究中也有發(fā)生，提示在今后的指標(biāo)篩選中應(yīng)盡量選擇均質(zhì)性高，受內(nèi)、外環(huán)境因素干擾較少的指標(biāo)。

本研究提示Fzd2 mRNA的表達(dá)量在大鼠骨骼肌挫傷后與損傷時(shí)間具有相關(guān)性，其表達(dá)量變化可以作為推斷損傷早期時(shí)間的參考，但介于個(gè)體差異、實(shí)驗(yàn)室間實(shí)驗(yàn)方法等的差異，要應(yīng)用于實(shí)際檢案還需要繼續(xù)探索其他指標(biāo)以進(jìn)行多指標(biāo)聯(lián)合推斷損傷時(shí)間。

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Relationship between Wound Age and the Expression of Fzd2 in Rats Skeletal Muscle after Contusion

DONG Ta-na1,PEI Ming2,LI Na1,ZHU Xi-yan1,SUN Jun-hong1
（1.Forensic Medicine of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Criminal Police Branch, Xuzhou Public Security Bureau,Xuzhou 221000,China）

Objective To investigate the relationship between wound age and the expressions of frizzled-2（Fzd2）mRNA and its protein in rats skeletal muscle after contusion,and to explore its possibility of being an index for wound age estimation.Methods The mRNA and protein expressions of Fzd2 in rats skeletal muscle of the control group and the experimental group within 4-48 h after contusion were detected per 4 h by RT-qPCR and Western blotting.Results The relative expression of Fzd2 mRNA increased at 24 h,36 h and 40 h after contusion,and the expression at 24 h was twice as the control group（P＜0.05）.The relative expression of Fzd2 protein changed inconspicuously after contusion（P＞0.05）. Conclusion The changes of Fzd2 mRNA expression after contusion in a certain time can be a basis to estimate wound age by combined multi-indicators.

forensic pathology;wound age estimation;frizzled-2;skeletal muscle contusion

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.04.002

1004-5619（2017）04-0344-04

2016-07-05）

（本文編輯：鄒冬華）

董塔娜（1993—），女，蒙古族，碩士研究生，主要從事?lián)p傷時(shí)間推斷相關(guān)研究；E-mail：dongtana93＠163.com

孫俊紅，男，副教授，主要從事?lián)p傷病理學(xué)和猝死病理學(xué)研究；E-mail：junhong.sun＠sxmu.edu.cn