王毅

摘 要：很多現(xiàn)代微生物技術(shù)都已經(jīng)被用在白酒釀造之中，本文對(duì)幾種當(dāng)前廣泛應(yīng)用的方式進(jìn)行了介紹，尤其對(duì)以PCR為基礎(chǔ)的DNA指紋圖譜分類鑒定技術(shù)做了重點(diǎn)的介紹和說明，并且說明了幾種鑒定技術(shù)在當(dāng)前白酒釀造領(lǐng)域方面的應(yīng)用情況，希望可以有助于以后對(duì)于微生物群落進(jìn)行研究奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而推動(dòng)我國(guó)白酒釀造技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。

關(guān)鍵詞：基因；微生物；多樣性；菌株；分離

我國(guó)釀造白酒的歷史由來已久了，其釀造環(huán)境有很多外在的影響因素可能會(huì)影響到白酒生產(chǎn)的質(zhì)量，其中最空氣、水源和土壤等等都會(huì)影響到環(huán)境微生物的構(gòu)成，而在發(fā)酵過程中，窖泥和微生物環(huán)境共同決定了微生物多樣化的情況，進(jìn)而對(duì)傳統(tǒng)白酒的產(chǎn)品風(fēng)格帶來了一定程度的影響。把現(xiàn)代微生物技術(shù)和傳統(tǒng)的白酒釀造技術(shù)結(jié)合起來，并且在發(fā)酵工藝中進(jìn)行推廣應(yīng)用，就能夠進(jìn)一步推動(dòng)我國(guó)白酒釀造技術(shù)的發(fā)展，彌補(bǔ)技術(shù)和理論方面的空白。

1 傳統(tǒng)的微生物鑒定分類的方法

傳統(tǒng)的微生物分類堅(jiān)定方式就是用最直接的方式來鑒定白酒中的微生物。過程按照先后順序分為5個(gè)步驟，分別是采樣、計(jì)數(shù)、培養(yǎng)和分離以及最后的鑒定。首先在采集步驟們對(duì)于不同部分都采集一部分樣品，包括酒曲、酒醪、窖泥以及周圍的水和空氣。對(duì)樣品中的微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)就是第二個(gè)階段了。這個(gè)階段主要有三種方式可以進(jìn)行。第一種最為簡(jiǎn)便快捷的就是顯微鏡法，但是這種方式無(wú)法區(qū)分死菌和活菌。第二種是活菌計(jì)數(shù)方式，可以直接顯示活菌的數(shù)量，即有繁殖能力的微生物群，第三種是最大可能計(jì)數(shù)法，這種計(jì)數(shù)方式可以用來測(cè)定具有特殊功能的菌群。第三個(gè)步驟是富集培養(yǎng)，富集培養(yǎng)階段起到的作用是擴(kuò)大微生物的數(shù)量，增加可以研究的樣本，為接下來的研究打好基礎(chǔ)。第四個(gè)步驟是把菌群分離，其方式是進(jìn)行平板劃線，采用的是梯度稀釋的方法，這樣就可以實(shí)現(xiàn)分離菌群的效果，更加方便研究。最后一個(gè)步驟是生化實(shí)驗(yàn)，按照相應(yīng)的手冊(cè)和規(guī)范，對(duì)菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)，然后將試驗(yàn)的結(jié)果運(yùn)用顯微鏡來進(jìn)行觀察，最后堅(jiān)定菌株，這樣就完成了微生物鑒定的工作

2 基于PCR的DNA指紋圖譜分類鑒定技術(shù)

生物技術(shù)在近年已經(jīng)在分子水平方面得到了完善，其中PCR技術(shù)進(jìn)步最為明顯，這樣一來，就可以用分子來鑒定微生物了。和舊有的堅(jiān)定方式相比，方式更為快速、結(jié)果更為簡(jiǎn)便，并且也可以直接將未知的微微生物檢測(cè)出來。

2.1 PCR-DGGE克隆分析技術(shù)

這種技術(shù)也可以稱之為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和變性梯度凝膠電泳技術(shù)。其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的用處是對(duì)體外特異性目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。而變形梯度凝膠電泳技術(shù)的原理是在聚丙烯酰胺凝膠里加入尿素添加劑和變性劑甲酰胺，這樣就會(huì)直接形成一個(gè)線性梯度，其排列方式是從低到高。在相同的溫度下，DNA的解鏈速率不同就會(huì)產(chǎn)生不同的電泳遷移率。通過電泳區(qū)別率方面的區(qū)別，就可以分離出DNA片段。之后把條帶中的DNA通過PCR的形式進(jìn)行擴(kuò)增，就可以進(jìn)行微生物分類方面的鑒定了。

2.2 SSCP技術(shù)

這種技術(shù)是根據(jù)DNA具有多態(tài)性這一特點(diǎn)，并且結(jié)合上文提到的PCR技術(shù)，就可以分析遺傳學(xué)方面的特征。霉菌全長(zhǎng)的ITS區(qū)序列包含了不同的序列，以及中間的ITSI和ITS2區(qū)的完整序列，信息是很豐富的，所以全場(chǎng)序列的分析技術(shù)經(jīng)常被用來鑒定霉菌分子生物。

2.3 末端限制性片段長(zhǎng)度分析（T-RFLP）技術(shù)

T-RFLP是一種分析生物群落的指紋技術(shù)，用于鑒定分析不同微生物群落結(jié)構(gòu)以及它們的多樣性。方法是將真菌或細(xì)菌設(shè)計(jì)一對(duì)合適的引物，并用熒光物質(zhì)對(duì)引物的一端進(jìn)行標(biāo)記，經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切后用特定的自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)檢測(cè)到的帶有熒光標(biāo)記的DNA片段與相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)判斷微生物區(qū)系多樣性，可以鑒定到微生物種和屬；根據(jù)熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱可以確定該種的豐度。

2.4 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）分子標(biāo)記技術(shù)

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)是建立在RFLP基礎(chǔ)上的選擇性聚合酶鏈反應(yīng)，利用可產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶酶切研究對(duì)象的基因組序列，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的酶切片段。將這些酶切片段與含有與其有共同粘性末段的人工接頭連接，形成模板，再在模板末段添加具有選擇性核苷酸（1～3個(gè)）的不同引物，然后PCR擴(kuò)增，結(jié)果只有那些兩端序列與選擇性核苷酸配對(duì)的酶切片段被擴(kuò)增。

3 磷脂脂肪酸法分類

這種方式最早在上個(gè)世紀(jì)七十年代后期開始研究了，在用途上用來分析微生物的定量。這種分析方式對(duì)于舊有的方式存在的缺點(diǎn)都有所彌補(bǔ)，可以直接對(duì)微生物中的復(fù)雜群落進(jìn)行研究，總體上來說，檢測(cè)存在著快捷和可靠的優(yōu)勢(shì)。在進(jìn)行測(cè)定的時(shí)候可以通過磷脂脂肪酸的種類的不同，對(duì)于不同菌類繁殖能力進(jìn)行研究。通過相關(guān)的圖譜分析還可以定性和定量分析微生物種類群，就可以確定類群的數(shù)量和種類。此外這種方式還經(jīng)常用來對(duì)活體微生物群落進(jìn)行標(biāo)記，一般認(rèn)為生物體細(xì)胞內(nèi)是恒定的，所以對(duì)于微生物變化的過程，這種方式可以直接進(jìn)行揭示。

4 Biolog微平板

Biolog技術(shù)由美國(guó)Biolog公司于1989年開發(fā)成功，最初應(yīng)用于純種微生物的鑒定，至今已經(jīng)能夠鑒定包括細(xì)菌、酵母、霉菌在內(nèi)的近2000多種病原微生物和環(huán)境微生物。Biolog微平板可以用于估價(jià)微生物群落代謝多樣性和功能多樣性的研究，與其他鑒定系統(tǒng)相比，Biolog方法在用于環(huán)境微生物的研究時(shí)，靈敏度高，分辨力強(qiáng)，并且數(shù)據(jù)的讀取和記錄可以由計(jì)算機(jī)輔助完成，自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化程度增高，簡(jiǎn)化了鑒定程序，提高了鑒定效率。

5 基因序列的同源性分析技術(shù)

5.1 16SrRNA/rDNA序列分析1

6SrRNA/rDNA序列分析已經(jīng)成為了細(xì)菌種屬鑒定和分類的標(biāo)準(zhǔn)方法。通過將待測(cè)菌株的16SrDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序并進(jìn)行數(shù)據(jù)的同源性比對(duì)分析。然后按照一定的標(biāo)準(zhǔn)，把測(cè)序結(jié)果分成若干個(gè)操作分類單元。然后將OTU所代表的序列提交到GenBankBLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過尋找相似度最高的16SrDNA序列，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，就可以對(duì)菌株進(jìn)行準(zhǔn)確、迅速而科學(xué)的定位。

5.2 18SrRNA/rDNA序列分析原核生物細(xì)胞中的16SrDNA和真核生物細(xì)胞中的18SrDNA的堿基序列都是十分保守的，并且不受微生物所處環(huán)境條件的影響。因此，通過分析比較微生物種之間16SrDNA和18SrDNA的同源性，可以真實(shí)的揭示它們的親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育地位。對(duì)于真核生物而言，18SrRNA可以鑒定其系統(tǒng)發(fā)育地位。

結(jié)束語(yǔ)

如果想要了解白酒釀造中的微生物的多樣性和數(shù)量以及其變化規(guī)律，就少不了對(duì)制曲工藝和釀造環(huán)境等因素進(jìn)行分析，進(jìn)而對(duì)不同窖齡的白酒都進(jìn)行有效的分類和堅(jiān)定。本文介紹了幾種鑒定白酒中微生物的方式，并且對(duì)發(fā)酵過程中微生物的演變情況做了研究，希望可以讓白酒發(fā)酵方面的理論更為完善。進(jìn)而為未來的微生物變化差異的研究奠定了基礎(chǔ)，也有利于研究霉菌和細(xì)菌的變化差異，有助于釀制出不同風(fēng)格、不同品味的白酒。

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