蔡龍，張風衛(wèi)，王珊珊，周紅娟，駱思媛，商學釵

(杭州市紅十字會醫(yī)院 中心實驗室，浙江 杭州 310003)

臍帶血來源的調節(jié)性T細胞對SLE病人淋巴細胞的作用初探

蔡龍，張風衛(wèi)，王珊珊，周紅娟，駱思媛，商學釵

(杭州市紅十字會醫(yī)院 中心實驗室，浙江 杭州 310003)

目的通過分析臍帶血調節(jié)性T細胞(CD4+CD25+細胞)的基本特性以及對系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)患者淋巴細胞的抑制功能，為治療SLE等疾病提供新的思路。方法收集臍帶血3例、SLE患者外周血6例和健康人外周血3例，肝素抗凝；檢測CD4+CD25+及Foxp3+細胞比例；磁珠分選法分離各樣本中CD4+CD25+細胞和CD4+CD25-細胞，分析各亞群細胞的純度并進行體外擴增試驗及體外抑制功能試驗。結果臍帶血中CD4+CD25+細胞和CD4+Foxp3+細胞比例最高，SLE患者外周血中最少；臍帶血中CD4+CD25+細胞體外擴增能力比健康成人和SLE患者的CD4+CD25+細胞強。擴增后的臍帶血CD4+CD25+細胞的體外抑制功能較擴增前及其它兩者擴增后均增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論臍帶血中調節(jié)性T細胞比例多，生物活性強，輸注臍帶血來源的調節(jié)性T細胞可以成為治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的理想途徑。

臍帶血，調節(jié)性T細胞，系統(tǒng)性紅斑狼瘡

調節(jié)性T細胞(regulatory T cells, Tregs)即以調節(jié)自身反應性T細胞為主要功能的一類T細胞，通常起著維持自身耐受和避免免疫反應過度損傷機體的重要作用。其最有特征性的細胞群是胸腺來源的自然CD4+CD25+細胞，連續(xù)地表達白細胞介素2(IL-2)受體的α鏈[1-2]。Sakaguchi等[3]發(fā)現(xiàn)如果將出生3天的小鼠的胸腺切除，或用抗CD25抗體等手段除去其體內(nèi)的CD4+CD25+細胞，小鼠將會發(fā)生嚴重的器官特異性自身免疫性疾病。相反，如果給這些實行了胸腺切除或除去了CD25+細胞的小鼠再注射CD4+CD25+細胞，小鼠的自身免疫性疾病便不會發(fā)生。

高表達CD25的T細胞(即CD4+CD25high)抑制功能較強，在體內(nèi)免疫負調節(jié)過程中起主導作用。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)患者外周血中的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞，特別是CD4+CD25high細胞數(shù)量較正常對照明顯減少。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，將CD4+CD25+調節(jié)性T細胞輸入狼瘡鼠體內(nèi)，小鼠癥狀明顯好轉[4]。成人外周血中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞含量較少，且分離純化有一定困難，成為制約調節(jié)性T細胞輸注療法的一大難題。Godfrey WR等研究發(fā)現(xiàn)臍帶血中含有較多的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞[5-6]。本研究擬通過分析臍帶血調節(jié)性T細胞的基本特性以及對SLE患者淋巴細胞的抑制功能，為治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 實驗試劑與設備 CD4CD25細胞磁珠分離試劑盒、T細胞刺激試劑盒(Anti-CD3/CD28 mAb-coated dynabeads)(Miltenyi biotec公司)；CD4CD25檢測試劑盒(CD4-FITC、CD25-Cy5)、Foxp3-PE(eBioScience公司)；Foxp3 mAb(BD Pharmingen公司)；細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶(Corning公司)；流式細胞儀(Beckman coulter，型號為EPICS-XL。)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)；離心機(Eppendorf)；倒置顯微鏡(Olympus公司)；MiniMACS免疫磁珠分選儀(MiltenyiBiotech公司)。

1.2 樣本來源 經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準后進行樣本收集。臍帶血來源于在我院分娩的產(chǎn)婦。在征得產(chǎn)婦本人同意，待胎兒分娩后，從離體后的胎盤中抽取臍帶血約100mL左右；共6例。選擇未經(jīng)治療的本院SLE初診患者6例，抽取外周血40mL；選擇同期健康體檢者6人，抽取外周血60mL；收集樣本前均征得本人同意并簽訂知情同意書。

1.3 CD4CD25細胞比例及Foxp3+細胞比例檢測 抽取離體后臍帶血、SLE患者外周血和健康人外周血，肝素抗凝，按照PE anti-human Foxp3 Staining Set試劑盒說明書操作：在每個流式上樣管中加入100μL全血，標記表面抗原CD4CD25，用預冷的Flow Cytometry Staining Buffer洗滌細胞，重懸細胞后加入1ml的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)，避光4℃孵育30～60min；加入2mL Permeabilization Buffer洗滌細胞2次，正常大鼠血清4℃封閉15min；直接PE-Foxp3抗體5μL，4℃孵育30min；加入2mL Permeabilization Buffer洗滌細胞1次，500μL Flow Cytometry Staining Buffer重懸細胞，上機檢測并分析。以CD4+細胞設門，分析CD25+細胞，CD25+Foxp3+細胞所占的比例。

1.4 CD4+CD25+細胞和CD4+CD25-細胞的分離 取臍帶血、SLE患者外周血和健康人外周血肝素抗凝，用2倍體積PBS進行稀釋，F(xiàn)icoll分離獲得單個核細胞，通過人CD4+細胞磁珠分離試劑盒，陰性選擇獲得CD4+T細胞，加入CD25+磁珠，陽性選擇獲得CD4+CD25+細胞，陰性選擇獲得CD4+CD25-細胞，通過流式細胞儀分析各細胞群的純度。

1.5 體外擴增試驗 將磁珠分選獲得的臍帶血CD4+CD25+細胞以及外周血CD4+CD25+T細胞以1×105/mL的濃度懸于含10% FCS的1640培養(yǎng)液中，加入4倍數(shù)量的CD3CD28抗體包被的磁珠和外源性的人IL-2(終濃度為200U/mL)，于37度、5%的CO2及飽和濕度條件下擴增12天，每隔兩天更換培養(yǎng)上清液，第6天重新計數(shù)，再將細胞調整為1×105/mL，按上述同樣方法擴增。第12天，收集擴增細胞，計數(shù)備用。同時在每個流式上樣管中加入100μL細胞懸液，細胞數(shù)約為1×106個，按照1.3方法流式細胞技術檢測擴增后的臍帶血、成人外周血和SLE患者外周血Tregs細胞中Foxp3細胞所占的比例。

1.6 體外抑制功能試驗 將SLE患者外周血的CD4+CD25-細胞調整濃度為1×106/mL，5uM的CFSE于37度條件上染色10分鐘，1640培養(yǎng)液洗涕兩次，作為反應細胞加入96孔板中，每孔5×104細胞，再分別向各孔中加入相同數(shù)量的擴增前和擴增后的臍帶血、健康成人外周血、SLE患者的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞以及健康成人外周血的CD4+CD25-細胞(作為對照組，效靶比均為1:1)。終濃度3ug/mL 的anti-CD3/CD28抗體作為刺激物，每孔終體積為200uL。于37度、5%的CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)72小時后收集細胞以及培養(yǎng)上清液，細胞通過流式細胞儀FL1通道檢測增殖水平。抑制率計算公式：(1-培養(yǎng)體系中加入Tregs時CD4+CD25-細胞增殖率/培養(yǎng)體系中未加入Tregs時CD4+CD25-細胞增殖率) x100%。

1.7 統(tǒng)計分析 檢測結果采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行描述性統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臍帶血中CD4+CD25+細胞比例 臍帶血中含有一群界限比較分明的CD4+CD25+細胞，健康成人的居中，SLE患者外周血CD4+CD25+細胞少(如封三圖1)。CD4+CD25high的細胞比例以及Foxp3+細胞的比例均有以上特征。

2.2 Tregs體外擴增后的數(shù)量變化 臍帶血調節(jié)性T細胞體外擴增的效率優(yōu)于健康成人和SLE患者的外周血調節(jié)性T細胞(如圖1)。

圖1 臍帶血、成人外周血和SLE患者外周血Tregs進行體外擴增后細胞擴增倍數(shù)(圖中數(shù)據(jù)為6次獨立實驗數(shù)據(jù)的平均值)

2.3 擴增后的CD4+CD25+細胞的foxP3表達水平 臍帶血擴增后的細胞的Foxp3表達最高，健康成人外周血的相對較低，SLE患者外周血CD4+CD25+細胞的Foxp3幾乎無表達，3者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，封三圖2)。

2.4 擴增前后的CD4+CD25+細胞的抑制功能 與擴增前及擴增后健康成人、SLE患者外周血比較，臍帶血擴增后的CD4+CD25+細胞的抑制功能均增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；健康成人外周血擴增后的CD4+CD25+細胞的抑制功能與擴增前差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，SLE患者外周血擴增后的CD4+CD25+細胞的抑制功能較擴增前下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見封三圖3。

3 討論

調節(jié)性T細胞(Tregs)在免疫調節(jié)和維持外周免疫耐受方面起重要作用[7]。SLE作為一種典型的自身免疫病，調節(jié)性T細胞在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用倍受學者們的關注。許多研究表明[8]與正常人相比，SLE中調節(jié)性T細胞數(shù)量降低。我們的研究也發(fā)現(xiàn)SLE患者的調節(jié)性T細胞數(shù)量明顯少。

輸注體內(nèi)或體外擴增的Tregs已成為多種疾病的潛在治療方法[9-10]，但從成人外周血獲得的Tregs數(shù)量有限，需要經(jīng)過體外擴增以獲得足夠的數(shù)量，輸注調節(jié)性T細胞的來源問題需要解決。臍帶血中具有豐富的干細胞，且其免疫細胞較為幼稚，免疫功能尚未成熟，免疫原性低，屬于一類免疫豁免細胞，不需要經(jīng)過嚴格配對使用，異體移植無免疫排斥反應，適合應用于不同個體之間的移植，不會產(chǎn)生任何毒副作用。目前，臍帶血廣泛應用于治療血液系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病。祁秋干等[11]人使用臍血間充質干細胞治療2例嚴重SLE，隨訪8年，2例患者病情穩(wěn)定，無復發(fā)癥狀。楊桂鮮等[12]、阮光萍等[13]將臍帶血間充質干細胞移植治療SLE也取得較好的臨床效果。我們研究發(fā)現(xiàn)臍帶血Tregs體外擴增的效率也優(yōu)于健康成人和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的外周血Tregs，經(jīng)過12天的培養(yǎng)，數(shù)量能擴增70倍以上，而且能保持其抑制型表型如:表達Foxp3等。可能是由于臍帶血來源的T細胞絕大部分都是幼稚型的，受到抗原刺激后，增殖較快。

在免疫抑制功能方面，我們以SLE患者的外周血CD4+CD25-T細胞作為靶細胞，擴增前后的臍帶血Tregs的抑制功能要優(yōu)于健康成人和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者，而且擴增后的臍帶血Tregs的抑制功能比其擴增前的抑制功能明顯提高。有研究表明[14]，抗原特異性的臍帶血Tregs在體外抑制效應T細胞擴增的能力比非特異性的Tregs更強。本實驗擴增過程中，使用了CD3CD28包被的磁珠進行刺激，是否與此有關，還需進一步研究。健康成人外周血Tregs擴增前后抑制功能無明顯變化，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血Tregs擴增后的抑制功能明顯下降。這可能與長期受到的抗原刺激或內(nèi)環(huán)境有關，作用機理方面需要進一步研究。

我們研究還發(fā)現(xiàn)擴增前的SLE患者外周血的Tregs與健康成人的無明顯差異，這說明SLE患者的外周血Tregs在體外能抑制CD4+CD25-T細胞的增生，總體抑制能力不足可能與細胞數(shù)量的減少有關。

本研究初步結果表明，臍帶血調節(jié)性T細胞擴增性強，抑制功能強，在治療SLE等自身免疫性疾病中具有重要的研究和應用價值。

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EffectofregulatoryTcellsinthehumanumbilicalcordbloodonSLEpatients’lymphocyte:apreliminarystudy

CAI Long，ZHANG Feng-wei，WANG Shan-shan，ZHOU Hong-juan，LUO Si-yuan，SHANG Xue-chai

(CentralLaboratory，HangzhouRedCrossHospital，Hangzhou31003，China)

ObjectiveTo have an in-depth understanding of the basic biological characteristics of umbilical cord blood regulatory T cells and its inhibiting effect on lymphocyte of SLE patients so as to develop new method for treating the disease.MethodBlood samples from 3 cases placenta, 6 cases with SLE and 3 cases healthy people were firstly collected. Normal heparin was used as anticoagulant. CD4+CD25+and Foxp3+cells ratio were detected. CD4+CD25+and CD4+CD25-cells were undergoing purity analysis, in vitro amplification test and in vitro inhibition function test which were isolated in each sample by magnetic bead separation method.FindingsThe proportion of CD4+CD25+cells was highest in the umbilical cord blood and least in the peripheral blood of SLE patients. The CD4+CD25+cells amplification function and inhibitory function in vitro of umbilical cord blood were stronger than those of peripheral blood of healthy people and SLE patients. The expanded CD4+CD25+cells from cord blood had a stronger immunosuppressive function compared with the expanded cells from the peripheral blood of healthy people and SLE patients, particularly, the CD4+CD25+cells from umbilical cord blood had a much stronger inhibitory function after expanded (P<0.05).ConclusionThe proportion and biological activity of regulatory T cells from the umbilical cord blood were found to be optimal. Transfusing these regulatory T cells can serve as a desirable approach in treating autoimmune diseases, such as SLE.

umbilical cord blood; CD4+CD25+cells; regulatory T cells; systemic lupus erythematosus

R3

：A

：1674-6449(2017)04-0396-04

2016-06-23

蔡龍(1976 - )，男，湖北英山人，本科，副主任技師。

10.3969/j.issn.1674-6449.2017.04.011