蔡龍，張風(fēng)衛(wèi)，王珊珊，周紅娟，駱?biāo)兼拢虒W(xué)釵

(杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310003)

臍帶血來源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)SLE病人淋巴細(xì)胞的作用初探

蔡龍，張風(fēng)衛(wèi)，王珊珊，周紅娟，駱?biāo)兼拢虒W(xué)釵

(杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310003)

目的通過分析臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+細(xì)胞)的基本特性以及對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)患者淋巴細(xì)胞的抑制功能，為治療SLE等疾病提供新的思路。方法收集臍帶血3例、SLE患者外周血6例和健康人外周血3例，肝素抗凝；檢測(cè)CD4+CD25+及Foxp3+細(xì)胞比例；磁珠分選法分離各樣本中CD4+CD25+細(xì)胞和CD4+CD25-細(xì)胞，分析各亞群細(xì)胞的純度并進(jìn)行體外擴(kuò)增試驗(yàn)及體外抑制功能試驗(yàn)。結(jié)果臍帶血中CD4+CD25+細(xì)胞和CD4+Foxp3+細(xì)胞比例最高，SLE患者外周血中最少；臍帶血中CD4+CD25+細(xì)胞體外擴(kuò)增能力比健康成人和SLE患者的CD4+CD25+細(xì)胞強(qiáng)。擴(kuò)增后的臍帶血CD4+CD25+細(xì)胞的體外抑制功能較擴(kuò)增前及其它兩者擴(kuò)增后均增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論臍帶血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例多，生物活性強(qiáng)，輸注臍帶血來源的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以成為治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的理想途徑。

臍帶血，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，系統(tǒng)性紅斑狼瘡

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs)即以調(diào)節(jié)自身反應(yīng)性T細(xì)胞為主要功能的一類T細(xì)胞，通常起著維持自身耐受和避免免疫反應(yīng)過度損傷機(jī)體的重要作用。其最有特征性的細(xì)胞群是胸腺來源的自然CD4+CD25+細(xì)胞，連續(xù)地表達(dá)白細(xì)胞介素2(IL-2)受體的α鏈[1-2]。Sakaguchi等[3]發(fā)現(xiàn)如果將出生3天的小鼠的胸腺切除，或用抗CD25抗體等手段除去其體內(nèi)的CD4+CD25+細(xì)胞，小鼠將會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的器官特異性自身免疫性疾病。相反，如果給這些實(shí)行了胸腺切除或除去了CD25+細(xì)胞的小鼠再注射CD4+CD25+細(xì)胞，小鼠的自身免疫性疾病便不會(huì)發(fā)生。

高表達(dá)CD25的T細(xì)胞(即CD4+CD25high)抑制功能較強(qiáng)，在體內(nèi)免疫負(fù)調(diào)節(jié)過程中起主導(dǎo)作用。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)患者外周血中的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，特別是CD4+CD25high細(xì)胞數(shù)量較正常對(duì)照明顯減少。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，將CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞輸入狼瘡鼠體內(nèi)，小鼠癥狀明顯好轉(zhuǎn)[4]。成人外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量較少，且分離純化有一定困難，成為制約調(diào)節(jié)性T細(xì)胞輸注療法的一大難題。Godfrey WR等研究發(fā)現(xiàn)臍帶血中含有較多的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[5-6]。本研究擬通過分析臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的基本特性以及對(duì)SLE患者淋巴細(xì)胞的抑制功能，為治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備 CD4CD25細(xì)胞磁珠分離試劑盒、T細(xì)胞刺激試劑盒(Anti-CD3/CD28 mAb-coated dynabeads)(Miltenyi biotec公司)；CD4CD25檢測(cè)試劑盒(CD4-FITC、CD25-Cy5)、Foxp3-PE(eBioScience公司)；Foxp3 mAb(BD Pharmingen公司)；細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning公司)；流式細(xì)胞儀(Beckman coulter，型號(hào)為EPICS-XL。)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)；離心機(jī)(Eppendorf)；倒置顯微鏡(Olympus公司)；MiniMACS免疫磁珠分選儀(MiltenyiBiotech公司)。

1.2 樣本來源 經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行樣本收集。臍帶血來源于在我院分娩的產(chǎn)婦。在征得產(chǎn)婦本人同意，待胎兒分娩后，從離體后的胎盤中抽取臍帶血約100mL左右；共6例。選擇未經(jīng)治療的本院SLE初診患者6例，抽取外周血40mL；選擇同期健康體檢者6人，抽取外周血60mL；收集樣本前均征得本人同意并簽訂知情同意書。

1.3 CD4CD25細(xì)胞比例及Foxp3+細(xì)胞比例檢測(cè) 抽取離體后臍帶血、SLE患者外周血和健康人外周血，肝素抗凝，按照PE anti-human Foxp3 Staining Set試劑盒說明書操作：在每個(gè)流式上樣管中加入100μL全血，標(biāo)記表面抗原CD4CD25，用預(yù)冷的Flow Cytometry Staining Buffer洗滌細(xì)胞，重懸細(xì)胞后加入1ml的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)，避光4℃孵育30～60min；加入2mL Permeabilization Buffer洗滌細(xì)胞2次，正常大鼠血清4℃封閉15min；直接PE-Foxp3抗體5μL，4℃孵育30min；加入2mL Permeabilization Buffer洗滌細(xì)胞1次，500μL Flow Cytometry Staining Buffer重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)并分析。以CD4+細(xì)胞設(shè)門，分析CD25+細(xì)胞，CD25+Foxp3+細(xì)胞所占的比例。

1.4 CD4+CD25+細(xì)胞和CD4+CD25-細(xì)胞的分離 取臍帶血、SLE患者外周血和健康人外周血肝素抗凝，用2倍體積PBS進(jìn)行稀釋，F(xiàn)icoll分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，通過人CD4+細(xì)胞磁珠分離試劑盒，陰性選擇獲得CD4+T細(xì)胞，加入CD25+磁珠，陽性選擇獲得CD4+CD25+細(xì)胞，陰性選擇獲得CD4+CD25-細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀分析各細(xì)胞群的純度。

1.5 體外擴(kuò)增試驗(yàn) 將磁珠分選獲得的臍帶血CD4+CD25+細(xì)胞以及外周血CD4+CD25+T細(xì)胞以1×105/mL的濃度懸于含10% FCS的1640培養(yǎng)液中，加入4倍數(shù)量的CD3CD28抗體包被的磁珠和外源性的人IL-2(終濃度為200U/mL)，于37度、5%的CO2及飽和濕度條件下擴(kuò)增12天，每隔兩天更換培養(yǎng)上清液，第6天重新計(jì)數(shù)，再將細(xì)胞調(diào)整為1×105/mL，按上述同樣方法擴(kuò)增。第12天，收集擴(kuò)增細(xì)胞，計(jì)數(shù)備用。同時(shí)在每個(gè)流式上樣管中加入100μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)約為1×106個(gè)，按照1.3方法流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增后的臍帶血、成人外周血和SLE患者外周血Tregs細(xì)胞中Foxp3細(xì)胞所占的比例。

1.6 體外抑制功能試驗(yàn) 將SLE患者外周血的CD4+CD25-細(xì)胞調(diào)整濃度為1×106/mL，5uM的CFSE于37度條件上染色10分鐘，1640培養(yǎng)液洗涕兩次，作為反應(yīng)細(xì)胞加入96孔板中，每孔5×104細(xì)胞，再分別向各孔中加入相同數(shù)量的擴(kuò)增前和擴(kuò)增后的臍帶血、健康成人外周血、SLE患者的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及健康成人外周血的CD4+CD25-細(xì)胞(作為對(duì)照組，效靶比均為1:1)。終濃度3ug/mL 的anti-CD3/CD28抗體作為刺激物，每孔終體積為200uL。于37度、5%的CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)72小時(shí)后收集細(xì)胞以及培養(yǎng)上清液，細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀FL1通道檢測(cè)增殖水平。抑制率計(jì)算公式：(1-培養(yǎng)體系中加入Tregs時(shí)CD4+CD25-細(xì)胞增殖率/培養(yǎng)體系中未加入Tregs時(shí)CD4+CD25-細(xì)胞增殖率) x100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 檢測(cè)結(jié)果采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臍帶血中CD4+CD25+細(xì)胞比例 臍帶血中含有一群界限比較分明的CD4+CD25+細(xì)胞，健康成人的居中，SLE患者外周血CD4+CD25+細(xì)胞少(如封三圖1)。CD4+CD25high的細(xì)胞比例以及Foxp3+細(xì)胞的比例均有以上特征。

2.2 Tregs體外擴(kuò)增后的數(shù)量變化 臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外擴(kuò)增的效率優(yōu)于健康成人和SLE患者的外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(如圖1)。

圖1 臍帶血、成人外周血和SLE患者外周血Tregs進(jìn)行體外擴(kuò)增后細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)(圖中數(shù)據(jù)為6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值)

2.3 擴(kuò)增后的CD4+CD25+細(xì)胞的foxP3表達(dá)水平 臍帶血擴(kuò)增后的細(xì)胞的Foxp3表達(dá)最高，健康成人外周血的相對(duì)較低，SLE患者外周血CD4+CD25+細(xì)胞的Foxp3幾乎無表達(dá)，3者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，封三圖2)。

2.4 擴(kuò)增前后的CD4+CD25+細(xì)胞的抑制功能 與擴(kuò)增前及擴(kuò)增后健康成人、SLE患者外周血比較，臍帶血擴(kuò)增后的CD4+CD25+細(xì)胞的抑制功能均增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；健康成人外周血擴(kuò)增后的CD4+CD25+細(xì)胞的抑制功能與擴(kuò)增前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SLE患者外周血擴(kuò)增后的CD4+CD25+細(xì)胞的抑制功能較擴(kuò)增前下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見封三圖3。

3 討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)在免疫調(diào)節(jié)和維持外周免疫耐受方面起重要作用[7]。SLE作為一種典型的自身免疫病，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用倍受學(xué)者們的關(guān)注。許多研究表明[8]與正常人相比，SLE中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量降低。我們的研究也發(fā)現(xiàn)SLE患者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量明顯少。

輸注體內(nèi)或體外擴(kuò)增的Tregs已成為多種疾病的潛在治療方法[9-10]，但從成人外周血獲得的Tregs數(shù)量有限，需要經(jīng)過體外擴(kuò)增以獲得足夠的數(shù)量，輸注調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的來源問題需要解決。臍帶血中具有豐富的干細(xì)胞，且其免疫細(xì)胞較為幼稚，免疫功能尚未成熟，免疫原性低，屬于一類免疫豁免細(xì)胞，不需要經(jīng)過嚴(yán)格配對(duì)使用，異體移植無免疫排斥反應(yīng)，適合應(yīng)用于不同個(gè)體之間的移植，不會(huì)產(chǎn)生任何毒副作用。目前，臍帶血廣泛應(yīng)用于治療血液系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病。祁秋干等[11]人使用臍血間充質(zhì)干細(xì)胞治療2例嚴(yán)重SLE，隨訪8年，2例患者病情穩(wěn)定，無復(fù)發(fā)癥狀。楊桂鮮等[12]、阮光萍等[13]將臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療SLE也取得較好的臨床效果。我們研究發(fā)現(xiàn)臍帶血Tregs體外擴(kuò)增的效率也優(yōu)于健康成人和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的外周血Tregs，經(jīng)過12天的培養(yǎng)，數(shù)量能擴(kuò)增70倍以上，而且能保持其抑制型表型如:表達(dá)Foxp3等。可能是由于臍帶血來源的T細(xì)胞絕大部分都是幼稚型的，受到抗原刺激后，增殖較快。

在免疫抑制功能方面，我們以SLE患者的外周血CD4+CD25-T細(xì)胞作為靶細(xì)胞，擴(kuò)增前后的臍帶血Tregs的抑制功能要優(yōu)于健康成人和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者，而且擴(kuò)增后的臍帶血Tregs的抑制功能比其擴(kuò)增前的抑制功能明顯提高。有研究表明[14]，抗原特異性的臍帶血Tregs在體外抑制效應(yīng)T細(xì)胞擴(kuò)增的能力比非特異性的Tregs更強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增過程中，使用了CD3CD28包被的磁珠進(jìn)行刺激，是否與此有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。健康成人外周血Tregs擴(kuò)增前后抑制功能無明顯變化，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血Tregs擴(kuò)增后的抑制功能明顯下降。這可能與長(zhǎng)期受到的抗原刺激或內(nèi)環(huán)境有關(guān)，作用機(jī)理方面需要進(jìn)一步研究。

我們研究還發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增前的SLE患者外周血的Tregs與健康成人的無明顯差異，這說明SLE患者的外周血Tregs在體外能抑制CD4+CD25-T細(xì)胞的增生，總體抑制能力不足可能與細(xì)胞數(shù)量的減少有關(guān)。

本研究初步結(jié)果表明，臍帶血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增性強(qiáng)，抑制功能強(qiáng)，在治療SLE等自身免疫性疾病中具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。

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EffectofregulatoryTcellsinthehumanumbilicalcordbloodonSLEpatients’lymphocyte:apreliminarystudy

CAI Long，ZHANG Feng-wei，WANG Shan-shan，ZHOU Hong-juan，LUO Si-yuan，SHANG Xue-chai

(CentralLaboratory，HangzhouRedCrossHospital，Hangzhou31003，China)

ObjectiveTo have an in-depth understanding of the basic biological characteristics of umbilical cord blood regulatory T cells and its inhibiting effect on lymphocyte of SLE patients so as to develop new method for treating the disease.MethodBlood samples from 3 cases placenta, 6 cases with SLE and 3 cases healthy people were firstly collected. Normal heparin was used as anticoagulant. CD4+CD25+and Foxp3+cells ratio were detected. CD4+CD25+and CD4+CD25-cells were undergoing purity analysis, in vitro amplification test and in vitro inhibition function test which were isolated in each sample by magnetic bead separation method.FindingsThe proportion of CD4+CD25+cells was highest in the umbilical cord blood and least in the peripheral blood of SLE patients. The CD4+CD25+cells amplification function and inhibitory function in vitro of umbilical cord blood were stronger than those of peripheral blood of healthy people and SLE patients. The expanded CD4+CD25+cells from cord blood had a stronger immunosuppressive function compared with the expanded cells from the peripheral blood of healthy people and SLE patients, particularly, the CD4+CD25+cells from umbilical cord blood had a much stronger inhibitory function after expanded (P<0.05).ConclusionThe proportion and biological activity of regulatory T cells from the umbilical cord blood were found to be optimal. Transfusing these regulatory T cells can serve as a desirable approach in treating autoimmune diseases, such as SLE.

umbilical cord blood; CD4+CD25+cells; regulatory T cells; systemic lupus erythematosus

R3

：A

：1674-6449(2017)04-0396-04

2016-06-23

蔡龍(1976 - )，男，湖北英山人，本科，副主任技師。

10.3969/j.issn.1674-6449.2017.04.011