嚴(yán)寶冬

黑龍江格林赫思生物科技有限公司 大慶 166400

慶大霉素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的研究

嚴(yán)寶冬

黑龍江格林赫思生物科技有限公司 大慶 166400

目的：對(duì)慶大霉素發(fā)酵的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)對(duì)幾種主要原輔料玉米淀粉、玉米粉、黃豆餅粉、蛋白胨、輕質(zhì)碳酸鈣的用量進(jìn)行調(diào)整，最后確定的培養(yǎng)基組合大大提高了發(fā)酵生產(chǎn)水平，而且降低了生產(chǎn)成本。

慶大霉素；培養(yǎng)基；發(fā)酵；優(yōu)化

慶大霉素是一類由微生物或其他生命過(guò)程中合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物或其人工衍生物，它們?cè)诤艿蜐舛葧r(shí)就能抑制或干擾它種生物（包括病原菌，病毒，癌細(xì)胞等）的生命活動(dòng)，因而可用作優(yōu)良的化學(xué)治療劑，也是臨床上廣泛使用的處方藥。慶大霉素屬于氨基糖苷類抗生素，主要是由絳紅小單孢菌（Micromonospora purpurea）、棘孢小單孢菌（M.echinospora）發(fā)酵產(chǎn)生的一種殺菌力較強(qiáng)的多組分氨基糖胺類廣譜抗生素。1963年由美國(guó)先令公司W(wǎng)einstein等發(fā)現(xiàn)，1969男被用于臨床，國(guó)外稱之艮他霉素或正泰霉素。慶大霉素同時(shí)也是我國(guó)獨(dú)立自主研制成功的廣譜抗生素。1966年，我國(guó)著名的微生物學(xué)家王岳和助手從小單孢菌中分離到全國(guó)聞名的慶大霉素產(chǎn)生菌，并且在 1967年開始研制，到1969年底獲得成功。之所以取名“慶大霉素”，是為了慶?！熬糯蟆币约肮と穗A級(jí)的偉大勝利。目前，慶大霉素仍然是臨床上和畜牧業(yè)治療各種革蘭氏陰性菌感染的主要抗生素之一。因此，慶大霉素的相關(guān)研究仍然具有重要意義。

我國(guó)慶大霉素的生產(chǎn)歷史已經(jīng)有四十余年，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)慶大霉素的生產(chǎn)廠家主要為?？埂熍_(tái)只楚藥業(yè)、南陽(yáng)普康集團(tuán)、上海先鋒，總體來(lái)說(shuō)生產(chǎn)水平不高，生產(chǎn)工藝改進(jìn)也不大，生產(chǎn)菌種大多選擇絳紅小單孢菌，一般采用深層液態(tài)發(fā)酵法，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)水平一般維持在1200-1400U/ml左右，產(chǎn)量較低。國(guó)外生產(chǎn)菌株多使用棘孢小單孢菌或橄欖星小單孢菌，發(fā)酵周期較長(zhǎng)、成本較高，這也使得生產(chǎn)受到一定的限制。

目前對(duì)于慶大霉素提高單位效價(jià)的措施主要是優(yōu)良菌種的篩選和工藝的優(yōu)化兩種方式。大多數(shù)工廠對(duì)慶大霉素提高發(fā)酵單位的措施主要是工藝優(yōu)化。雖然國(guó)內(nèi)外眾多科研工作者曾經(jīng)致力于采用傳統(tǒng)的誘變育種手段來(lái)改造小單孢菌的生物合成，但是往往收效甚微。

慶大霉素生產(chǎn)的培養(yǎng)基主要為玉米淀粉、玉米粉、黃豆餅粉、蛋白胨、輕質(zhì)碳酸鈣，本文主要針對(duì)這幾種培養(yǎng)基的最佳用量進(jìn)行正交化組合，得到最佳的培養(yǎng)基用量組合，從而提高慶大霉素的發(fā)酵生產(chǎn)水平。

1.資料和方法

1.1 菌種：絳紅小單孢菌（黑龍江格林赫思生物科技有限公司生產(chǎn)用菌種）。

1.2 培養(yǎng)基

玉米淀粉、玉米粉、黃豆餅粉、蛋白胨、輕質(zhì)碳酸鈣、硫酸銨、硝酸鉀等。

1.3 設(shè)備

1.3.1 實(shí)驗(yàn)室設(shè)備：搖瓶機(jī)，500ml三角瓶

1.3.2 發(fā)酵罐：1500L發(fā)酵罐

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 搖瓶發(fā)酵

將子瓶斜面菌種在無(wú)菌室內(nèi)挑取2cm2接種于滅菌后的搖瓶培養(yǎng)基中，每瓶500ml三角瓶裝量50ml培養(yǎng)基，37±1℃、360r/min培養(yǎng)135小時(shí)，放瓶取樣，檢測(cè)慶大霉素生物效價(jià)及其組分比例。

1.4.2 1500L發(fā)酵罐發(fā)酵

將5瓶子瓶斜面菌種在無(wú)菌室用無(wú)菌水洗下，制成孢子懸浮液，將孢子懸浮液接入1500L發(fā)酵罐，罐壓0.05Mpa，通氣量1:1，攪拌速度120r/min，，發(fā)酵培養(yǎng)135小時(shí) ，放罐，測(cè)定慶大霉素生物效價(jià)及其組分比例。

1.5 效價(jià)測(cè)定

采用抗生素微生物檢定法。

2 結(jié)果與討論

2.1 搖瓶發(fā)酵結(jié)果

2.1.1 正交法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵試驗(yàn)的影響因素很多，培養(yǎng)基中主要是碳源氮源，為菌體生長(zhǎng)提供了大部分能量，所以選擇培養(yǎng)基中5個(gè)主要因素進(jìn)行研究：玉米淀粉、玉米粉、黃豆餅粉、蛋白胨、輕質(zhì)碳酸鈣，根據(jù)單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定各因素的最佳含量范圍，采取五因素三水平正交試驗(yàn)?zāi)Ｊ剑蛩厮奖硪姳?。

表1 正交試驗(yàn)水平表

按照四水平五因素的實(shí)驗(yàn)安排，共做 16組實(shí)驗(yàn)，每一組實(shí)驗(yàn)平行5瓶，所得結(jié)果為5瓶的平均結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 L9（35）正交試驗(yàn)結(jié)果

從表2中極差可以看出，以上5個(gè)因素對(duì)慶大霉素產(chǎn)量影響的順序?yàn)椋河衩椎矸郏镜鞍纂耍军S豆餅粉＞玉米粉＞輕質(zhì)碳酸鈣，實(shí)驗(yàn)組中最佳結(jié)果是第八組，（A2B4C3D2E1），從分析數(shù)據(jù)中得出，最優(yōu)培養(yǎng)基配方為A2B4C3D2E1，通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)得出，這個(gè)配方的慶大霉素效價(jià)最終保持在1450u/ml左右，產(chǎn)量穩(wěn)定。根據(jù)原始配方，平行做出現(xiàn)用的培養(yǎng)基發(fā)酵試驗(yàn)，最終效價(jià)穩(wěn)定在1200u/ml左右，新的最優(yōu)配方效價(jià)提高了16.7%。

所以確定最終培養(yǎng)基配方為玉米淀粉5.5g/L，玉米粉1.6g/L，黃豆餅粉4.0g/L，蛋白胨0.65g/L，輕質(zhì)碳酸鈣0.6g/L。

2.2 1500L噸發(fā)酵罐驗(yàn)證結(jié)果

將優(yōu)化的培養(yǎng)基配方在1.5噸發(fā)酵罐上進(jìn)行驗(yàn)證，連續(xù)上罐7次，其結(jié)果見表3

從表3可以看出，慶大霉素的發(fā)酵過(guò)程中，應(yīng)用新的最優(yōu)培養(yǎng)基配方，連續(xù)實(shí)驗(yàn)效果很穩(wěn)定，并且經(jīng)過(guò)成本核算，生產(chǎn)成本較原有的培養(yǎng)基配方成本低，增加了生產(chǎn)利潤(rùn)，降低了單位能耗。

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)所采用的優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵所得結(jié)果，各組分比例滿足新藥典要求，并且雜志顯著降低，為下游的色譜分離工作帶來(lái)很大便利。

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