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(廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點研究室,廣東廣州 510006)

周露,楊慧文,程軒軒,張旭紅,潘育方,楊全*

(廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點研究室,廣東廣州 510006)

目的:探討白簕中性均一多糖組分(ATP1-1)對鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的I型糖尿病小鼠的降糖作用及機(jī)制。方法:采用多次小劑量注射鏈脲佐菌素(MLD-STZ)的方法,建立C57BL/6小鼠I型糖尿病模型。成模小鼠隨機(jī)分成高血糖模型組、二甲雙胍組、ATP1-1高劑量組和ATP1-1低劑量組,以同周齡正常小鼠為正常對照組,每組10只,給藥4周。于給藥后檢測小鼠空腹血糖值(FBG)以及肝糖原含量,采用RT-PCR的方法測定肝臟中葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、葡萄糖轉(zhuǎn)運體2(GLUT2)mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:與模型組相比,ATP1-1高、低劑量組的血糖均顯著下降(p<0.05),其中40 mg·kg-1ATP1-1給藥組血糖抑制率為 29.4%;兩劑量組均可有效增加糖尿病小鼠肝糖原含量(p<0.05);RT-PCR結(jié)果顯示,ATP1-1高、低劑量組GK mRNA、GLUT2 mRNA表達(dá)顯著增加(p<0.01),G6Pase mRNA表達(dá)降低(p<0.05)。結(jié)論:ATP1-1可以有效降低糖尿病小鼠血糖,該作用機(jī)制與調(diào)節(jié)糖代謝中的關(guān)鍵酶及相關(guān)轉(zhuǎn)運體有關(guān)。

白簕,多糖,降血糖,RT-PCR

糖尿病是一種血糖代謝紊亂的全身慢性代謝性疾病,是21世紀(jì)全球面臨的最嚴(yán)重、最危急的疾病之一。國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)數(shù)據(jù)顯示,2015年全球糖尿病患者總數(shù)為4.15億,預(yù)計到2040年,該數(shù)字將增加至6.42億,全球醫(yī)療費用的12%將用于糖尿病治療,尋找開發(fā)糖尿病治療藥物已成為研究熱點[1]。

白簕(Acanthopanaxtrifoliatus(L.)Merr.)為五加科(Araliaceae)五加屬(Acanthopananx)攀援狀灌木,廣泛分布于我國中部和南部,嶺南地區(qū)資源豐富[2]。本品味苦、辛,性涼,具有疏風(fēng)、消腫、止癢等功效[3]。文獻(xiàn)[4-9]研究表明,白簕化學(xué)成分主要涉及酚類、黃酮、多糖、萜類、揮發(fā)油等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)白簕粗多糖及脫色后多糖具有明顯的降糖功效[10-11]。為深入探討其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及降糖作用機(jī)制,本研究對白簕粗多糖進(jìn)行分離純化,獲得含量較高的中性均一多糖ATP1-1,研究其對STZ誘導(dǎo)的I型糖尿病小鼠的糖代謝影響的相關(guān)機(jī)制,為白簕的資源深層次藥用開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences

1 材料與方法

1.1材料與儀器

白簕 采自廣東恩平,經(jīng)廣東藥科大學(xué)劉基柱副教授鑒定為五加科植物白簕(Acanthopanaxtrifoliatus(L.)Merr.),標(biāo)本保存于廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院標(biāo)本館;纖維素DE-52 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;鏈脲佐菌素(STZ) 批號:C1616118,aladdin公司;二甲雙胍 批號:1404031004,石家莊市普力制藥有限公司;Trizol 批號:108306,美國Invitrogen公司;6×loading buffer,DL 500 DNA Maker,primeScript RT-PCR kit試劑盒 寶生物大連有限公司;糖原檢測試劑盒 南京建成生物制品研究所;SPF級C57BL/6小鼠 雄性,體重20～22 g,動物許可證號:SCXK(粵)2013-0002,購于廣東省動物實驗中心;引物由上海生工合成;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

FA1004型電子分析天平 上海良平儀器儀表有限公司;XW-80A型微型渦旋混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市澳華儀器有限公司;BGZ-30型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司;721型紫外分光光度計 上海精密儀器有限公司;安穩(wěn)型血糖儀 三諾生物傳感技術(shù)有限公司;ST 16R冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司;T100TMThermal cycler PCR、小型水平電泳槽 美國Bio-Rad公司;Tanon 1220凝膠成像系統(tǒng) 廣州譽維生物科技儀器有限公司;Nano-100微量分光光度計 杭州奧盛儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 白簕多糖的分離 取經(jīng)脫色、脫蛋白處理后的白簕粗多糖適量,溶于蒸餾水,離心所得上清液通過DEAE-52纖維素柱(3.5 cm×60 cm)進(jìn)行初步分離:依次用蒸餾水、0.05、0.2 mol·L-1的NaCl溶液進(jìn)行分段洗脫,采用苯酚-硫酸法跟蹤檢測洗脫液中多糖含量并分別收集洗脫液,得到3個多糖組分。分別為含量較高的中性多糖ATP1和酸性多糖ATP2、ATP3。取適量凍干后的ATP1溶于1 mL去離子水中加入SephadexG-75層析柱,用去離子水洗脫,苯酚-硫酸法繪制洗脫曲線得到對稱單峰ATP1-1。ATP1-1采用高效滲透凝膠色譜法檢測純度和分子量,結(jié)果顯示ATP1-1為單一對稱峰,數(shù)均分子量Mn=2270,重均分子量Mw=2310,分布寬度D=1.02,以上結(jié)果證實ATP1-1為均一多糖。對ATP1-1進(jìn)行富集,濃縮,冷凍干燥,儲存于-20 ℃。

1.2.2 動物造模與分組 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,禁食12 h,腹腔注射STZ 50 mg·kg-1·d-1,連續(xù)注射5 d。STZ注射結(jié)束7 d后,檢測小鼠空腹血糖,檢測前禁食不禁水8 h,以血糖濃度高于11.1 mmol·L-1視為造模成功。

待模型穩(wěn)定后,將成模小鼠隨機(jī)分成4組(n=10):高血糖模型組、二甲雙胍組、ATP1-1高劑量組、ATP1-1低劑量組,取未造模正常小鼠作為空白對照組。陽性對照組灌胃185 mg·kg-1二甲雙胍溶液,高、低劑量給藥組分別灌胃80、40 mg·kg-1ATP1-1溶液,模型組和正常組分別灌胃等體積的雙蒸水。連續(xù)給藥4周,給藥期間正常飲食,自由飲水。

1.2.3 空腹血糖的測定 末次給藥后,禁食不禁水8 h,測定各組小鼠的空腹血糖水平。并按照公式計算血糖抑制率:

血糖抑制率(%)=(給藥前空腹血糖值-給藥結(jié)束后空腹血糖值)/給藥前空腹血糖值×100

1.2.4 檢測肝糖原含量 末次給藥后,解剖小鼠,取肝臟保存于-80 ℃待測。按試劑盒說明書操作測定肝糖原含量。

1.2.5 RT-PCR檢測肝臟中GK、G6Pase、GLUT2 mRNA表達(dá) Trizol RNA抽提試劑盒提取肝臟中總RNA,測定總RNA純度和含量。以提取總RNA為模板,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄cDNA,反應(yīng)條件:30 ℃,10 min;42 ℃,30 min;95 ℃,5 min,合成后的cDNA 4 ℃保存。

表3 ATP1-1對小鼠糖尿病的肝糖原影響Table 3 Effect of ATP1-1 on hepatic glycogen of diabetic model mice(±s,n=10)

注:與模型組相比,*p<0.05,**p<0.01;與正常組相比,#p<0.05,##p<0.01。

PCR引物序列見表1,PCR擴(kuò)增按試劑盒說明書操作,上機(jī)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性1 min,94 ℃變性30 s,退火(溫度見表1)30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)數(shù)見表1,所得擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像儀觀察,并用Imagej軟件對條帶進(jìn)行灰度分析,以β-actin基因表達(dá)量為內(nèi)參照,比較分析GK mRNA、G6Pase mRNA、GLUT2 mRNA基因的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 ATP1-1對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

由表2可知,給藥前,各組的糖尿病小鼠空腹血糖水平均大于11.1 mmol/L,視為造模成功;給藥4周,模型組血糖比較穩(wěn)定,二甲雙胍組和ATP1-1各劑量組血糖均有降低。二甲雙胍組、ATP1-1高、低劑量組血糖抑制率分別為25.78%、17.7%、29.4%,其中40 mg·kg-1低劑量組血糖值與高糖組相比有極顯著性差異(p<0.01),說明ATP1-1對STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠有較好的降血糖作用。

表2 ATP1-1對糖尿病小鼠血糖影響Table 2 Effect of ATP1-1 on blood glucose of diabetic mice(±s,n=10)

注:與模型組相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.2 ATP1-1對糖尿病小鼠肝糖原含量的影響

由表3可知,模型組小鼠肝糖原含量明顯低于正常組(p<0.05)。給藥4周后,與模型組相比,二甲雙胍組、80、40 mg·kg-1ATP1給藥組小鼠肝糖原含量均明顯上升(p<0.05),其中40 mg·kg-1低劑量組與模型組組相比,呈現(xiàn)極顯著性差異(p<0.01);給藥組與二甲雙胍組肝糖原無明顯差異,說明ATP1-1可以較好地促進(jìn)糖尿病小鼠肝糖原的合成。

2.3 ATP1-1對糖尿病小鼠GK、G6Pase、GLUT2 mRNA表達(dá)的影響

由圖1結(jié)果可知,給藥4周后,與模型組比,各組GK及GLUT2 mRNA表達(dá)水平顯著升高(p<0.01),同時,G6Pase mRNA表達(dá)水平顯著降低(p<0.05)。2%瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示GK、G6Pase、GLUT2和β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物相應(yīng)在101、128、136、188 bp附近有清晰的目的基因和內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增帶,與相應(yīng)設(shè)計的擴(kuò)增長度相符,未見其他擴(kuò)增產(chǎn)物,見圖2。

圖1 各組小鼠肝臟中GK、G6Pase、GLUT2表達(dá)水平Fig.1 mRNA expression levels of GK、G6Pase、GLUT2 in liver of diabetic model mice注:與模型組相比,*p<0.05,**p<0.01;與正常組相比,#p<0.05,##p<0.01。

3 討論

本實驗采用的MLD-STZ糖尿病小鼠模型,與人類T1DM發(fā)病機(jī)理相似,死亡率低,發(fā)病率高,血糖穩(wěn)定[12],是目前比較理想的Ⅰ型糖尿病模型制備方法。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)白簕粗多糖具有較好的降血糖作用,在此基礎(chǔ)上,本論文對白簕多糖進(jìn)行系統(tǒng)分離,獲得含量較高的中性均一多糖ATP1-1,并對ATP1-1的降糖藥效進(jìn)行深入研究。

肝臟是葡萄糖代謝的主要器官之一[13],當(dāng)血糖升高時,肝臟將葡萄糖轉(zhuǎn)化為肝糖原,降低血糖;當(dāng)血糖過低時,通過糖異生的方式來產(chǎn)生葡萄糖,使血糖維持穩(wěn)定。本實驗結(jié)果表明,ATP1-1可以有效增加糖尿病小鼠肝糖原含量,推測其可能通過促進(jìn)肝臟對葡萄糖的轉(zhuǎn)化,從而達(dá)到降血糖的效果。

圖2 2%瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物圖Fig.2 2% agarose gel electrophoresis of PCR products注:A:GK;B:G6Pase;C:GLUT2;D:β-actin。M:Marker;1:正常組;2:模型組;3:二甲雙胍組;4:低劑量組;5:高劑量組。

GK是糖代謝中的關(guān)鍵酶,催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖,促進(jìn)肝糖原的合成,從而降低血糖。G6Pase是肝臟糖異生的關(guān)鍵酶,催化糖異生的最后一步6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖,當(dāng)G6Pase表達(dá)下降時,糖異生減弱,血糖下降。GLUT2是肝臟最主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運體,運送葡萄糖進(jìn)出肝臟,與GK協(xié)調(diào)作用使胰島素分泌反應(yīng)的強(qiáng)度受血中葡萄糖濃度的調(diào)節(jié)[14]。有研究表明二甲雙胍主要通過增加對葡萄糖的利用、抑制肝臟糖異生來降低糖尿病小鼠血糖,增加肝糖原含量[15]。本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可有效增加GK、GLUT2的表達(dá),降低G6Pase含量,與二甲雙胍的降糖機(jī)制相符,說明該研究方法可行。ATP1-1給藥4周后,給藥組動物的GK、GLUT2表達(dá)增加(p<0.01),G6Pase表達(dá)下降(p<0.05),表明ATP1-1可通過提高GLUT2和GK表達(dá),降低G6Pase表達(dá),從而促進(jìn)葡萄糖在肝臟中的轉(zhuǎn)化,抑制糖異生,最終達(dá)到降低血糖的作用,由此推斷參與糖代謝的調(diào)節(jié)是ATP1-1的降糖機(jī)制之一。

4 結(jié)論

本研究采用STZ誘導(dǎo)的小鼠糖尿病模型,探究白簕中性均一多糖ATP1-1組分的降糖機(jī)制。實驗結(jié)果表明,ATP1-1低(40 mg·kg-1)、高(80 mg·kg-1)劑量組均可有效地降低糖尿病小鼠血糖,并提高肝糖原含量。同時,ATP1-1低、高劑量組均可上調(diào)糖尿病小鼠GK、GLUT2的表達(dá),下調(diào)G6Pase的表達(dá)。據(jù)此,推測ATP1-1為白簕多糖降糖的有效活性物質(zhì)之一,其降糖機(jī)制與調(diào)節(jié)糖代謝中的關(guān)鍵酶及相關(guān)轉(zhuǎn)運體有關(guān)。

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StudyonhypoglycemiceffectandthemechanismofaneutralhomogeneouspolysaccharidefromAcanthopanaxtrifoliatus
onstreptozotocin-induceddiabeticmice

ZHOULu,YANGHui-wen,CHENGXuan-xuan,ZHANGXu-hong,PANYu-fang,YANGQuan*

(Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Production & Development of Cantonese Medicinal Materials,School of Traditional Chinese Medicine,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China)

Objective:To investigate the hypoglycemic effect and mechanism of a neutral homogeneous polysaccharide fromAcanthopanaxtrifoliatus(L.)Merr.(ATP1-1)on typeⅠdiabetic mice induced by STZ. Methods:TypeⅠdiabetic animal model of C57BL/6 mice was established by multiple intraperitoneal injection of low dose streptozotocin(MLD-STZ). Diabetic mice were randomly divided into hyperglycemia group,positive control group of metformin,high-dose and low-dose groups of ATP1-1. Normal mice were used as blank control,10 mice for each group. The above components were administered intragastrically for 4 weeks. Hepatic glycogen and fasting blood glucose were determined at the end of administration. The mRNA expression of GK,G6Pase,GLUT2 were also observed by RT-PCR assay. Results:Compared with hyperglycemia group,FBG levels of the drug groups(high-dose and low-dose of ATP1-1)were decreased after 4 weeks’ administration(p<0.05),meanwhile,hepatic glycogen content of the drug groups were increased(p<0.05). The inhibition rate of blood glucose for 40 mg·kg-1dose group was 29.4%. RT-PCR results showed that ATP1-1 could increase the mRNA expressions of GK and GLUT2(p<0.01),while reduce the mRNA expression of G6Pase(p<0.05). Conclusion:ATP1-1 could decrease the blood glucose of type I diabetic mice,regulation of glycometabolism might be one of the mechanisms.

Acanthopanaxtrifoliatus;polysaccharide;antihyperglycemic;RT-PCR

2017-02-20

周露(1992-)，女，碩士，研究方向：中藥有效成分與藥理活性研究，E-mail:zhoulu_92@163.com。

*通訊作者:楊全(1972-)，男，博士，教授，研究方向：中藥資源，E-mail：yangquan7208@vip.163.com。

國家自然科學(xué)基金項目(81503217)。

TS201.4

:A

:1002-0306(2017)17-0288-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.056