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(棗莊學院生命科學學院,山東棗莊 277160)

高溫高壓條件制備石榴皮鞣花酸的試驗研究

徐加喜,高迪,朱曉梅,鄭丹丹,王京龍,張立華*

(棗莊學院生命科學學院,山東棗莊 277160)

目的:探索制備石榴皮鞣花酸新方法。方法:以高壓蒸汽滅菌器為反應裝置,分別研究了水解溫度(壓強)、水解時間和硫酸濃度(v/v)對鞣花酸得率的影響,并對工藝參數(shù)進行優(yōu)化。結(jié)果:在最佳工藝條件:水解溫度(壓強)115 ℃(169 kPa)、水解時間2 h、硫酸濃度6%(v/v)時,鞣花酸得率最高達3.09%,與常壓相比得率提高了25.10%。結(jié)論:高溫高壓條件下水解石榴皮單寧制備鞣花酸效率較高,為生產(chǎn)工藝的改進提供了技術(shù)依據(jù)。

石榴皮,鞣花酸,高溫高壓,水解,得率

1 材料與方法

1.1材料與儀器

石榴 采自棗莊嶧城石榴園,品種為大青皮,經(jīng)專家鑒定為石榴科植物石榴的果實;甲醇、乙腈 色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司;鞣花酸標準品 上海源葉生物科技有限公司;其他試劑 國產(chǎn)分析純。

DHG-9053A電熱恒溫干燥箱 揚州鴻都電子有限公司;LK-2000A高速粉碎機 新昌縣城關(guān)紅利數(shù)控制造廠;KQ3200DE超聲波清洗機 昆山超聲儀器廠;TDL-40B低速臺式大容量離心機 上海安亭科學儀器廠;YXQ-LS-7511高壓蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;FA1104B精密電子天平 上海越平科學儀器有限公司;1260高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 鞣花酸的制備過程 石榴皮→粉碎→超聲提取→乙醇熱回流提取→水解反應→甲醇萃取→鞣花酸。

1.2.2 鞣花酸含量檢測

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱:BDS C18柱(150 mm×46 mm,5 μm);流動相:1.2%磷酸溶液∶乙腈=85∶15;檢測波長:254 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;進樣量:20 μL[19]。

1.2.2.2 標準品溶液的制備 精密稱取鞣花酸標準品25.00 mg,置于小燒杯中,用適量甲醇加熱溶解,冷卻至室溫,甲醇定容至25 mL,搖勻,做標準品母液。

精密移取標準品母液0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、3.50 mL于5 mL容量瓶中用甲醇定容至刻度,搖勻。按1.2.2.1項下色譜條件,分別取20 μL進樣分析,制作標準曲線。

1.2.2.3 樣品分析 在前期處理的基礎上,將水解后的沉淀加入100 mL甲醇,65 ℃回流萃取3 h。取上清液定容至100 mL,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,進樣20 μL,依據(jù)色譜峰的保留時間定性,峰面積定量,根據(jù)標準曲線回歸方程獲得鞣花酸的質(zhì)量濃度x。鞣花酸得率(W)的計算公式如下:

式中,x為待測鞣花酸的質(zhì)量濃度,μg·mL-1;v為甲醇萃取液定容體積,mL;m為制備20 mL單寧提取液所需的石榴皮粉末的質(zhì)量,μg;V1為提取的單寧提取液總體積,mL。

1.2.3 石榴皮單寧的提取 取新鮮石榴,手工剝皮水洗,經(jīng)恒溫干燥箱烘干(65 ℃),使用高速粉碎機粉碎,過60～80目篩,封裝于保鮮袋中,4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

稱取上述石榴皮粉末100.0 g,置于圓底燒瓶中,按料液比1∶10 (m/v)加入60%乙醇溶液,超聲(300 W)提取30 min[20]后,80 ℃回流浸提2 h,冷卻至室溫,過濾得單寧提取液,量取總體積(V1)。4 ℃儲藏備用。

1.2.4 單因素實驗及方法 選定水解溫度(壓強)、水解時間、硫酸濃度三個因素作單因素實驗,以鞣花酸得率為指標研究各因素對鞣花酸得率的影響。

1.2.4.1 水解溫度(壓強) 在水解時間1 h、體系硫酸濃度為5%(v/v)的條件下,取上述單寧提取液20 mL于50 mL錐形瓶中,以高壓蒸汽滅菌器為反應裝置,設置水解溫度依次為:100 ℃(101 kPa)、105 ℃(121 kPa)、110 ℃(143 kPa)、115 ℃(169 kPa)、120 ℃(199 kPa),研究不同水解溫度(壓強)對鞣花酸得率影響。

1.2.4.2 水解時間 在水解溫度為120 ℃,體系硫酸濃度為5%(v/v)的條件下,取上述單寧提取液20 mL于50 mL錐形瓶中,以高壓蒸汽滅菌器為反應裝置,設置水解時間依次為:0.5、1、1.5、2、2.5 h,研究不同水解時間對鞣花酸得率影響。

1.2.4.3 硫酸濃度 在水解時間2 h,水解溫度為120 ℃的條件下,取上述單寧提取液20 mL于50 mL錐形瓶中,以高壓蒸汽滅菌器為反應裝置,設置體系硫酸濃度(v/v)依次為:2%、3%、4%、5%、6%。研究不同硫酸濃度對鞣花酸得率的影響。

1.2.5 正交優(yōu)化實驗 在單因素的基礎上,選取水解溫度(壓強)、水解時間、硫酸濃度三個因素做三因素三水平正交優(yōu)化,以鞣花酸得率為研究指標,確定最佳水解條件。具體因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factor and the levels of orthogonal test

1.2.6 高壓與常壓水解方法

1.2.6.1 高壓處理 在水解溫度(壓強)115 ℃(169 kPa),體系硫酸濃度為6%(v/v)的條件下,取上述單寧提取液20 mL于50 mL錐形瓶中,以高壓蒸汽滅菌器為反應裝置,設置水解時間依次為:1、2 h。

1.2.6.2 常壓處理 在水解溫度(壓強)100 ℃(101 kPa),體系硫酸濃度為6%(v/v)的條件下,取上述單寧提取液20 mL于50 mL錐形瓶中,以恒溫水浴鍋為反應裝置,設置水解時間依次為:1、2 h。

2 結(jié)果與分析

2.1高效液相色譜法測定鞣花酸得率

2.1.1 標準品、樣品液相色譜分析 由圖1、圖2可知,鞣花酸在10.9 min左右出峰,且鞣花酸峰面積明顯,出峰時間和分離效果較好,無拖尾現(xiàn)象。

圖1 標準品色譜圖Fig.1 The chromatogram of standards

圖2 樣品色譜圖Fig.2 The chromatograms of samples

2.1.2 標準曲線 以峰面積y為縱坐標,標準溶液質(zhì)量濃度x為橫坐標,繪制標準曲線(見圖3),線性回歸方程為y=194.42x-66.6,R2=0.9998,鞣花酸在100～700 μg·mL-1內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖3 鞣花酸標準品標準曲線Fig.3 Ellagic acid standard curve

2.2不同溫度(壓強)對鞣花酸得率的影響

水解溫度是單寧水解反應的必要條件。由圖4直觀分析結(jié)果可知,在設備允許的安全溫度范圍內(nèi),水解溫度在100～120 ℃之間,采用高壓蒸汽滅菌器高壓水解1 h,隨著水解溫度的升高、壓強的增大,鞣花酸得率也逐漸升高,在120 ℃條件下鞣花酸的得率最高,為2.72%。這可能是因為隨著溫度的升高、壓強的增大,由于二者的疊加效應,水的離子積常數(shù)會迅速增加,水中的H+和OH-濃度增加,接近弱酸或弱堿,使高溫液態(tài)水自身具有酸、堿催化的功能[21-23],能加速鞣花單寧水解反應生成鞣花酸。此外加壓可以提高反應物的濃度,從而提高水解反應速率[24]。

圖4 不同溫度對鞣花酸得率的影響Fig.4 Effect of different temperature on ellagic acid yield

2.3不同時間對鞣花酸得率的影響

由圖5直觀分析結(jié)果可知,提取時間從0.5～2.5 h,隨著水解時間的增長,鞣花酸的得率先增大再減小,2 h時得率最高。大于2 h時,鞣花酸的得率降低,可能是鞣花酸在高溫高壓條件下被進一步降解,隨著反應時間增加被降解的量也增加,最終使鞣花酸得率減少。

圖5 不同時間對鞣花酸得率的影響Fig.5 Effect of different time on ellagic acid yield

2.4不同硫酸濃度對鞣花酸得率的影響

鞣花單寧在酸性條件下其分子中的葡萄糖基與三羥基苯甲酸之間的酯鍵斷裂,發(fā)生水解反應,生成六羥基聯(lián)苯甲酸,其分子內(nèi)碳碳單鍵發(fā)生旋轉(zhuǎn),羥基和羧基酯化形成兩分子內(nèi)酯,最終生成鞣花酸[25]。由圖6直觀分析結(jié)果可知,硫酸的濃度對石榴皮鞣花酸的得率有影響,且硫酸濃度太低時水解過程進行不徹底。當硫酸的濃度由2%增加到4%時,鞣花酸得率則從1.87%提高到2.88%,增幅明顯;而當硫酸的濃度超過4%時,鞣花單寧水解較充分,鞣花酸得率的增幅平緩。

圖6 不同硫酸濃度對鞣花酸得率的影響Fig.6 Effect of different acid concentration on ellagic acid yield

2.5正交實驗結(jié)果

由表2直觀分析結(jié)果可知,水解時間(B)對鞣花酸得率的影響最大。各因素對鞣花酸得率的影響順序為:B>A>C,即水解時間>水解溫度(壓強)>硫酸濃度。最佳水解工藝為A2B2C3,即水解溫度(壓強)115 ℃(169 kPa)、水解時間2 h、硫酸濃度6%,鞣花酸的最高得率可達3.09%。

表2 正交實驗結(jié)果 Table 2 The result of orthogonal experiment

2.6高壓與常壓條件下鞣花酸得率的比較

由圖7直觀分析結(jié)果可知,水解1 h時,高壓、常壓條件下鞣花酸得率分別為2.64%、2.27%。水解2 h時,高壓處理所得鞣花酸得率為3.09%,與常壓相比提高了25.10%。隨著水解時間的延長,高壓和常壓處理所得鞣花酸的得率都呈上升趨勢。但是,處理時間相同條件下,高壓處理要比常壓處理鞣花酸得率大,效率高?？赡苁且驗榉磻w系壓力增大,使得酸解液與樣品中的有效成分接觸的機會增大[26-27],從而快速達到反應終點的效果。

圖7 高壓與常壓水解制備鞣花酸比較 Fig.7 Comparison of the preparation of ellagic acid by hydrolysis at high pressure and normal pressure

3 結(jié)論

采用高壓蒸汽滅菌器為反應裝置,在高溫高壓條件下制備石榴皮鞣花酸的最佳工藝條件為水解溫度(壓強)115 ℃(169 kPa)、水解時間2 h、硫酸濃度6%,鞣花酸得率最高可達3.09%,與常壓相比得率提高了25.10%。高溫高壓條件下水解石榴皮單寧制備鞣花酸效率較高,為生產(chǎn)工藝的改進提供了技術(shù)依據(jù)。

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Studyonpreparationofellagicacidfrompomegranatepeelbyhightemperatureandhighpressure

XUJia-xi,GAODi,ZHUXiao-mei,ZHENGDan-dan,WANGJing-long,ZHANGLi-hua*

(College of Life Sciences,Zaozhuang University,Zaozhuang 277160,China)

Objective:To explore a new method of preparation of pomegranate ellagic acid. Methods:The effect of hydrolysis temperature(pressure),hydrolysis time and sulfuric acid concentration(v/v)on ellagic acid yield were studied respectively with high pressure steam sterilizer as the reactor,and also the process parameters were optimized. Results:The highest ellagic acid yield was 3.09% under the optimum conditions of hydrolysis temperature(pressure)of 115 ℃(169 kPa),hydrolysis time of 2 h,sulfuric acid concentration of 5%(v/v),and was increased by 25.10% compared with the atmospheric pressure. Conclusion:Under the condition of high temperature and high pressure,granatanine extracten by hydrolysis method of preparation of ellagic acid efficiency was higher. It provided technical basis for the improvement of production process.

pomegranate peel;ellagic acid;high temperature and high pressure;hydrolysis;yield

2017-02-14

徐加喜(1996-)，男，本科，研究方向：植物資源開發(fā)，E-mail：xujiaxi2014@163.com。

*通訊作者:張立華(1968-)，男，博士，教授，研究方向：植物資源開發(fā)及采后生理，E-mail：chinazhanglh@163.com。

山東省重點研發(fā)計劃(2016GSF202010)；棗莊學院大學生創(chuàng)新訓練計劃項目(2017100)。

TS255.1

:B

:1002-0306(2017)17-0174-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.033