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(浙江工業(yè)大學,浙江杭州 310014)

諾麗多糖的單糖組成分析及體外抗氧化活性研究

左麗敏,陸雨,江石平,晏永球,童應(yīng)鵬,陳素紅*,王平*

(浙江工業(yè)大學,浙江杭州 310014)

諾麗多糖,分級醇沉,單糖組成,體外抗氧化活性

1 材料與方法

1.1材料與儀器

諾麗果干 海南萬之堂生物科技有限公司,經(jīng)浙江工業(yè)大學藥學院王平教授鑒定為諾麗正品。

葡萄糖(Glc)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、巖藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man) 成都植標化純生物科技有限公司,均為對照品；娃哈哈純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司;濃硫酸 西隴科學股份公司;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚 阿拉丁試劑有限公司;氫氧化鈉、水楊酸、FeSO4天津市永大化學試劑有限公司;正丁醇、鹽酸 杭州雙林化工試劑廠;氯仿、乙酸、甲醇、H2O2上海凌峰化學試劑有限公司;無水乙醇 安徽安特食品股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 國藥集團化學試劑有限公司,均為分析純試劑；脫色一號樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司。乙腈、甲醇 Tedia公司,為色譜純試劑。

KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;756PC型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;Agilent1260型HPLC色譜儀 美國Agilent公司;SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵 杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司;EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司;Sartorius BS224S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜條件:Agilent C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,流動相為乙腈-0.1%乙酸,梯度洗脫:0→6→20→40→50→54 min,乙腈濃度:8%→12%→18.5%→19.5%→23%→25%。柱溫30 ℃,進樣量20 μL,流速1.0 mL/min,檢測波長245 nm。

1.2.2 諾麗多糖樣品的制備和含量測定 精密配制10、20、30、40、50、60 μg/mL葡萄糖標準品溶液,用苯酚-硫酸法測定吸光度后繪制葡萄糖標準曲線為y=0.0125x+0.0348(R2=0.9991)。

諾麗果干粉碎,過40目篩，加入娃哈哈純凈水。按照預實驗中提取條件(300 g諾麗果干，提取溫度60 ℃、超聲功率80 W、提取時間40 min、液料比30 mL/g)超聲提取得到多糖溶液,過濾濃縮成800 mL,平均分成四份,分別加乙醇至濃度為30%、50%、70%、90%醇沉后離心冷凍干燥,得到四個諾麗粗多糖,用苯酚-硫酸法測定四個乙醇濃度的多糖得率。經(jīng)大孔樹脂[10]脫色和sevage法[11]脫蛋白后濃縮干燥得到A(30%)、B(50%)、C(70%)、D(90%)四個純化后多糖樣品,測定四個多糖樣品中多糖含量,多糖得率與含量計算方法見下列公式(1)和(2)。

多糖得率(%)=C1V1F1/W1×100

式(1)

多糖含量(%)=C2V2F2/W2×100

式(2)

C1-待測粗多糖濃度,V1-待測粗多糖溶液體積,F1-待測粗多糖稀釋倍數(shù),W1-諾麗果干重量;C2-脫色后待測多糖濃度,V2-脫色后待測多糖溶液體積,F2-脫色后多糖稀釋倍數(shù),W2-脫色后諾麗多糖樣品重量。

1.2.3 供試品的制備

1.2.3.1 多糖樣品水解及衍生化 參照文獻[12]中方法,分別稱取10 mg A、B、C、D四個多糖樣品于具塞試管中,加入2 mL 2 mol/L硫酸溶液于110 ℃烘箱中完全水解4 h,冷卻后加入4 mol/L NaOH溶液2 mL中和,離心,取上清液。取1 mL水解樣液,加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液1 mL和0.3 mol/L NaOH溶液1 mL,在70 ℃下水浴反應(yīng)30 min,冷卻至室溫后加入0.3 mol/L HCl溶液1 mL,混勻后加入等體積氯仿萃取三次,棄去有機層,水層稀釋后過0.45 μm膜,供HPLC分析。

1.2.3.2 單糖標準品衍生化 分別配制2 mmol/L葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、巖藻糖對照品溶液,各取0.1 mL對照品溶液,按1.2.3.1中方法衍生化后供HPLC分析。

1.2.4 諾麗多糖的體外抗氧化活性

1.2.4.1 清除DPPH·能力 參照文獻[13]方法,用去離子水將A、B、C、D多糖樣品分別配成濃度0.5、1、2、4、8 mg/mL多糖樣品溶液,配制0.08 mg/mL DPPH·乙醇溶液。A0組2 mL去離子水+2 mL DPPH·溶液,A1組2 mL DPPH·溶液+2 mL樣品溶液,A2組2 mL無水乙醇+2 mL樣品溶液,加樣后避光反應(yīng)30 min,在波長517 nm測定其吸光度。清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100,每組重復3次,取其平均值。以維生素C為陽性對照。

1.2.4.2 清除OH·能力 參照文獻[14]方法,多糖樣品溶液濃度同1.2.4.1,配制3 mmol/L FeSO4、H2O2及水楊酸乙醇溶液。A0組1 mL去離子水+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL H2O2溶液混合,A1組1 mL樣品溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL H2O2溶液混合,A2組1 mL樣品溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL去離子水混合,37 ℃水浴反應(yīng)30 min,在波長510 nm下測定其吸光度。清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100,每組重復3次,取其平均值。以維生素C為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1四個多糖樣品的提取率及含量

四個多糖樣品經(jīng)硫酸-苯酚法含量測定后,其不同濃度乙醇對諾麗多糖的醇沉效果(即提取效果)和初步純化后四個多糖樣品中多糖的含量如表1所示。從表中可以看出乙醇濃度越高醇沉出的多糖越多,其提取效果越好;初步純化后得到的四個多糖樣品中多糖含量區(qū)別不大。

表1 四個多糖樣品的多糖得率和含量Table 1 The polysaccharide yield and content of four polysaccharide samples

2.2方法學考察

2.2.1 標準曲線的制備 混合單糖對照品衍生物分別進樣2,4,6,8,10,20 μL進行HPLC 分析,以單糖的含量為橫坐標,單糖衍生物峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,見表2。

表2 七種單糖衍生物的線性關(guān)系Table 2 Linear relationship for precolumn derivation product of seven monosaccharides

2.2.2 精密度實驗 混合單糖對照品溶液按1.2.3.2方法衍生化后,進樣量10 μL,重復進樣6次,記錄峰面積。Man、Rha、Glc、Gal、Ara、Xyl和Fuc衍生物峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為:0.74%,0.53%,0.50%,1.79%,1.75%,0.35%,0.69%,表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復性實驗 取混合單糖對照品溶液6份,依照1.2.3.2方法進行衍生化后進行HPLC分析,進樣量10 μL,計算各單糖衍生物峰面積的RSD。Man、Rha、Glc、Gal、Ara、Xyl和Fuc衍生物峰面積的RSD 分別為:0.40%,1.11%,0.31%,0.63%,0.36%,0.31%,0.74%,表明該方法的重復性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實驗 多糖樣品衍生化后,在0、3、6、9、12、24 h進行HPLC分析,記錄峰面積后計算Man、Rha、Glc、Gal、Ara、Xyl和Fuc衍生物峰面積的RSD分別為:0.82%,0.56%,0.57%,1.80%,0.98%,0.38%,0.79%,表明多糖樣品衍生物在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 回收率實驗 精密稱取已知單糖含量的諾麗多糖水解液6份,加入等量的單糖對照品,按1.2.3.1方法衍生化,HPLC法測定峰面積,Man、Rha、Glc、Gal、Ara、Xyl和Fuc的平均回收率分別為102.1%,98.6%,104.6%,108.9%、96.1%、97.4%和105.3%,RSD 分別為1.83%,0.60%,0.74%,0.69%、1.41%、1.08%和0.89%。

2.3諾麗多糖的單糖組成及比例

2.3.1 混合單糖標準品HPLC結(jié)果 七種單糖標準品衍生化后在2.1色譜條件下HPLC分析,結(jié)果如圖1,編號1～8號色譜峰分別為PMP、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖的衍生物。

圖1 混合單糖標準品衍生物的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram for precolumn derivatization product of mixture standard monosaccharides注:1.PMP；2.Man；3.Rha；4.Glc；5.Gal；6.Ara；7.Xyl；8.Fuc。

2.3.2 四個多糖樣品單糖組成HPLC結(jié)果 四個多糖樣品衍生化后在1.2.1色譜條件下進行HPLC分析,結(jié)果如圖2,檢測出四個諾麗多糖樣品的單糖組成為Man、Rha、Glc、Gal及Ara,A的單糖摩爾百分比為1.33∶4.24∶77.22∶9.83∶7.38,此部位多糖的單糖主要以Glc為主,其次為Gal和Ara;B的單糖摩爾百分比為2.58∶2.28∶52.20∶31.40∶11.54,此部位多糖的單糖主要以Glc為主,其次為Gal和Ara;C的單糖摩爾百分比為1.32∶6.45∶47.00∶32.91∶12.31,此部位多糖的單糖主要以Glc為主,其次為Gal和Ara;D的單糖摩爾百分比為3.18∶3.39∶27.23∶45.50∶20.70,此部位多糖的單糖主要為Gal,其次為Glc和Ara。四個部位中Man及Rha含量是微量的。

圖2 四個多糖樣品衍生化后的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram for precolumn derivatization product of four polysaccharide samples注:1.PMP；2.Man；3.Rha；4.Glc；5.Gal；6.Ara；8.Fuc。

2.4抗氧化結(jié)果

2.4.1 清除DPPH·能力 DPPH是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基,在517 nm波長處有最大吸收峰,其乙醇溶液呈紫色,當DPPH·與抗氧化劑反應(yīng)后,紫色會隨著被還原而逐漸變淺,吸光度降低[15],以此來評價抗氧化劑的清除能力。此法操作簡單、穩(wěn)定性好、靈敏度高,是常用的評價體外抗氧化活性方法。A、B、C、D四個多糖樣品對DPPH·的清除能力見圖3,從圖中可以看出,諾麗多糖對DPPH·有一定的清除能力,8 mg/mL時D的清除率達到58.96%,在0.5～8.0 mg/mL范圍內(nèi)多糖清除能力呈明顯劑量依賴性。在低濃度時(0.5～2 mg/mL),A對DPPH·的清除能力弱于B、C、D,而其他3個多糖樣品對DPPH·清除能力相差不大;在高濃度(4～8 mg/mL)時,A、B、C、D對DPPH·的清除能力差異明顯(p<0.01)。四個多糖樣品對DPPH·清除能力大小整體趨勢為:D>C>B>A。

圖3 四個多糖樣品對DPPH·的清除能力Fig.3 DPPH· scavenging ability of four polysaccharide samples

2.4.2 清除OH·能力 參考Fenton反應(yīng)體系[16],利用H2O2與Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生·OH,·OH活性高,存活時間短,通過在體系中加入水楊酸來有效地捕捉·OH,產(chǎn)生有色產(chǎn)物,該產(chǎn)物在510 nm處有強吸收,在反應(yīng)體系加入具有清除·OH功能的被測物,與水楊酸競爭與·OH反應(yīng),使有色產(chǎn)物生成量減少。A、B、C、D四個多糖樣品對OH·的清除能力如圖4,從圖中可以看出,諾麗多糖對OH·有一定的清除能力,8 mg/mL時C的清除率達到68.36%,在0.5～8.0 mg/mL范圍內(nèi)多糖清除能力呈明顯劑量依賴性。低濃度(0.5～1 mg/mL)時,四個多糖樣品對OH·的清除能力相仿,在高濃度(2～8 mg/mL)時,四個多糖樣品清除率差異較大(p<0.01),特別是D對OH·的清除率很低。四個多糖樣品對OH·清除能力總體大小趨勢為:C>B>A>D。

圖4 四個多糖樣品對OH·的清除能力Fig.4 OH· scavenging ability of four polysaccharide samples

圖5 四個多糖樣品對的清除能力Fig.5 · scavenging ability of four polysaccharide samples

3 結(jié)論與討論

本實驗用PMP柱前衍生化HPLC法分析了不同濃度的乙醇分級醇沉得到的四個醇沉諾麗多糖的單糖組成及比例,并對Man、Rha、Glc、Gal、Ara、Xyl、Fuc 7種單糖的PMP衍生化產(chǎn)物的HPLC分離分析條件進行了摸索,用乙酸代替了文獻中常用的磷酸鹽緩沖液作為流動相,磷酸鹽緩沖液遇有機試劑易析出結(jié)晶而造成色譜柱堵塞,且色譜柱沖洗過程更加繁瑣,因此用乙酸作為流動相更有利于儀器的使用與維護;并對諾麗多糖單糖組成分析方法做了補充。從數(shù)據(jù)分析可以看出,隨著乙醇濃度的增高,半乳糖及阿拉伯糖的摩爾百分比不斷增加,而葡萄糖摩爾百分比逐漸下降。

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StudyonmonosaccharidecompositionsanalysisandantioxidantactivityinvitroofpolysaccharidesfromNoni

ZUOLi-min,LUYu,JIANGShi-ping,YANYong-qiu,TONGYing-peng,CHENSu-hong*,WANGPing*

(Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China)

Noni polysaccharides;grading-alcoholic precipitation;monosaccharide compositions;antioxidant activityinvitro

2016-12-29

左麗敏(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：天然藥物化學,E-mail：zuolm91@163.com。

*通訊作者:陳素紅(1973-)，女，博士，教授，研究方向：天然藥物化學,E-mail：chensuhong@aliyun.com。 王平(1969-)，女，博士，教授，研究方向：天然藥物化學,E-mail：wangping45@zjut.edu.cn。

重大科技專項重點農(nóng)業(yè)項目(2015C02032)。

TS201.1

:A

:1002-0306(2017)17-0056-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.011