肖洪賀，郭周全，鄭彧，徐志立，索天嬌，楊靜嫻

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

4.1 茯苓不同提取液對Ach誘導(dǎo)的小鼠離體小腸痙攣性收縮的影響

·基礎(chǔ)研究·

茯苓不同提取部位對小鼠胃腸運(yùn)動功能的抑制作用研究△

肖洪賀，郭周全，鄭彧，徐志立，索天嬌，楊靜嫻*

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

目的：探討茯苓不同提取部位對小鼠胃腸運(yùn)動功能的抑制作用，并篩選出最佳提取部位。方法：采用乙酰膽堿(acetyl choline；Ach)誘導(dǎo)的小鼠離體小腸痙攣性收縮模型，以小腸平均張力(mean contractile force；MCF)、收縮頻率(contraction frequency；CF)為指標(biāo)，在離體器官水平上比較茯苓水提液、茯苓25%醇提液、茯苓50%醇提液、茯苓75%醇提液、茯苓100%醇提液對離體小腸收縮的抑制作用；采用新斯的明誘導(dǎo)的胃腸功能亢進(jìn)小鼠模型，以胃殘留率和小腸推進(jìn)率為指標(biāo)，進(jìn)一步驗(yàn)證最佳部位茯苓50%醇提液對小鼠胃排空和小腸推進(jìn)的抑制作用。結(jié)果：茯苓水提液，茯苓25%、50%、75%和100%醇提液均有效緩解Ach誘導(dǎo)的離體小腸痙攣性收縮，顯著降低小腸MCF而對CF影響較小，作用強(qiáng)度順序?yàn)椋很蜍?0%醇提液>茯苓25%醇提液>茯苓75%醇提液>茯苓100%醇提液>茯苓水提液；茯苓50%醇提液低、中、高劑量均有效緩解新斯的明誘導(dǎo)的小鼠胃腸功能亢進(jìn)，提高胃殘留率，降低小腸推進(jìn)率，并呈劑量依賴性關(guān)系。結(jié)論：茯苓水提液，茯苓25%、50%、75%、100%醇提液對小鼠離體小腸痙攣性收縮均有一定的抑制作用，其中50%醇提液作用最強(qiáng)，且對新斯的明引起的小鼠胃腸功能亢進(jìn)有顯著的拮抗作用。

茯苓；離體小腸；胃排空；小腸推進(jìn)；提取部位

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的干燥菌核，性平，味甘、淡，歸心、脾、腎經(jīng)，具有利水滲濕、健脾、寧心等功效?，F(xiàn)代研究表明，茯苓含有多糖、三萜類、甾體類、氨基酸等多種化學(xué)成分，具有利尿、保肝、抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等藥理活性[1-2]。具有健脾作用的中藥或方劑，如白術(shù)[3]、木香[4]、四君子湯[5]、補(bǔ)中益氣湯[6]等，對胃腸運(yùn)動功能都有一定的調(diào)節(jié)作用。作為健脾的常用中藥，茯苓水提液能夠抑制正常小鼠胃排空和小腸推進(jìn)[7]，茯苓粗提物對正常家兔離體空腸和盲腸具有明顯的舒張作用[8]。但茯苓中的主要活性成分茯苓三萜難溶于水，且關(guān)于茯苓抗炎[9]、保肝[10]、抗腫瘤[11]等活性研究中，多采用不同濃度的乙醇進(jìn)行提取。為了更深入了解茯苓的抗胃腸運(yùn)動活性，篩選出其健脾的最佳提取部位，本實(shí)驗(yàn)采用Ach誘導(dǎo)的小鼠離體小腸痙攣性收縮模型，考察茯苓不同提取部位對小鼠離體小腸收縮的抑制作用，篩選最佳提取部位；在整體動物水平上，進(jìn)一步驗(yàn)證最佳提取部位對新斯的明誘導(dǎo)的胃腸功能亢進(jìn)小鼠的拮抗作用，以期為茯苓健脾的研究與應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1藥品與試劑

茯苓購自河北亞寶藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地云南，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)康廷國教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的干燥菌核。

氯化乙酰膽堿(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：A111014)；硫酸阿托品(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：A109524)；甲硫酸新斯的明(上海信誼金朱藥業(yè)有限公司，批號：160304)；無水乙醇(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)；聚山梨酯80(南京化學(xué)試劑有限公司)。

1.2儀器與設(shè)備

JJ224BC型分析天平(常熟市雙杰測試儀器廠)；DFT-50型中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)、RM6240B型多道生理信號采集系統(tǒng)(編號：L30130170，成都儀器廠)、電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)，501型恒溫水浴鍋(金壇市白塔新寶儀器廠)。

1.3動物

SPF級昆明雄性小鼠，體重18～22g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(遼)2015-0001。

2 方法

2.1藥物的制備

2.1.1茯苓提取液的制備 茯苓飲片粉碎，過60目篩，稱取80g，加8倍量蒸餾水，浸泡1h，回流1h，趁熱抽濾，濾渣加6倍量蒸餾水，回流1h，趁熱抽濾，合并兩次濾液，60℃水浴濃縮，以2%的聚山梨酯80水溶液配成2g·mL-1的茯苓水提液(按生藥量計算)。25%、50%、75%、100%茯苓醇提液的制備方法與水提液制備方法相同，均制成2g·mL-1的茯苓醇提液(按生藥量計算)，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2營養(yǎng)性半固體糊(簡稱炭糊)的制備 取羧甲基纖維素鈉10g，溶于250mL蒸餾水中，分別加入16g奶粉、8g白糖、8g淀粉和2g活性炭末，攪拌均勻，配制成300mL約300g的黑色半固體糊狀物，-20℃凍存?zhèn)溆肹12]。

2.1.3臺氏液的制備 臺氏液參照文獻(xiàn)方法配置[13]。

2.2茯苓不同提取液對Ach誘導(dǎo)的小鼠離體小腸痙攣性收縮的影響

參照文獻(xiàn)方法[14]，小鼠禁食不禁水12h，脫頸椎處死，剪開腹部，自幽門1cm處剪取約5cm長的腸管，置4℃臺氏液中，輕柔剝離腸系膜，臺氏液沖洗內(nèi)容物，剪成約1cm長的腸段，置盛有80mL臺氏液的麥?zhǔn)显〔壑衃恒溫水浴溫度為(37±0.2)℃，持續(xù)通入含有95%O2和5%CO2的混合氣體]，連接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)腸管基礎(chǔ)張力1～1.5g，待腸管恢復(fù)規(guī)律的自發(fā)收縮后(約10～15min)，將收縮曲線波谷調(diào)至基線，記錄自發(fā)收縮曲線，5min后加入6mmol·L-1的Ach10μL(終濃度為0.75μmol·L-1)，待收縮曲線平穩(wěn)后(約5～10min)，分別累計加入溶媒、茯苓水提液、茯苓25%醇提液、茯苓50%醇提液、茯苓75%醇提液和茯苓100%醇提液20、20、40、80、160、320μL，每個濃度作用5min，記錄腸管收縮曲線，應(yīng)用RM6240USB3.0b(I)軟件統(tǒng)計平均張力和收縮頻率，按公式(1)計算平均張力抑制率。

(1)

2.3茯苓50%醇提液對新斯的明誘導(dǎo)的胃腸功能亢進(jìn)小鼠胃排空和小腸推進(jìn)的影響

取小鼠60只，按體重隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為空白對照組、模型對照組、陽性對照組(阿托品5mg·kg-1)，茯苓50%醇提液低、中、高劑量組(劑量分別為0.5、1.5、4.5g·kg-1)。分別灌胃(ig)給予相應(yīng)劑量藥物，空白和模型對照組給予等量蒸餾水，1次·d-1，連續(xù)6d。末次給藥前禁食18h，給藥30min后，模型組和各給藥組皮下注射(ih)新斯的明0.5mg·kg-1，空白組ih給予等量0.9%氯化鈉溶液，30min后，各組均ig給予炭糊0.8mL/只，15min后脫頸椎處死。剪開腹腔，結(jié)扎賁門和幽門，取全胃，0.9%氯化鈉溶液清洗，濾紙吸干，稱全胃質(zhì)量，沿胃大彎處剖開，洗去內(nèi)容物，濾紙吸干，稱凈胃質(zhì)量，按公式(2)計算胃殘留率。剪取幽門至回盲部小腸，分離腸系膜，輕輕將小腸拉直，測量幽門至回盲部腸管長度作為小腸全長，從幽門至炭糊前沿的距離作為炭糊推進(jìn)距離，按公式(3)計算小腸推進(jìn)百分率。

胃殘留率=(全胃質(zhì)量-凈胃質(zhì)量)/0.8mL炭糊重×100%

(2)

小腸推進(jìn)率=(炭糊推進(jìn)距離/小腸全長)×100%

(3)

3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

4 結(jié)果

4.1茯苓不同提取液對Ach誘導(dǎo)的小鼠離體小腸痙攣性收縮的影響

4.1.1對離體小腸運(yùn)動的整體影響 如圖1所示，離體小鼠小腸在37℃臺氏液中適應(yīng)10～15min即可恢復(fù)規(guī)律的自發(fā)性收縮，給予10μL Ach后，小腸運(yùn)動曲線基線抬高，振幅增加；給予相應(yīng)茯苓提取液后，基線逐漸降至自發(fā)水平，振幅減小，隨著劑量的增加基線下降至0刻度以下，振幅降至低于自發(fā)活動水平(但收縮頻率變化并不明顯)，提示茯苓提取液能夠緩解Ach誘導(dǎo)的離體小鼠小腸痙攣性收縮。

圖1 茯苓對Ach所致小鼠離體小腸痙攣性收縮的抑制作用(以50%醇提液為例)

4.1.2對離體小腸平均張力的抑制作用 如表1和圖2所示，給藥0.5g·L-1時，除水提液外，其余各提取液均能夠有效抑制Ach引起的離體小腸痙攣性收縮，平均張力抑制率達(dá)到10.71%～12.84%，與溶媒組3.05%比較有統(tǒng)計學(xué)差異；累計給藥至2g·L-1時，各組提取液均有效降低離體小腸平均張力，抑制率達(dá)到25.62%～37.70%，與溶媒組10.22%比較有統(tǒng)計學(xué)差異；茯苓不同部位提取液中，50%醇提液對離體小腸平均張力的抑制作用最強(qiáng)，水提液作用最弱，25%、75%和100%醇提液作用相近；給藥4g·L-1時，茯苓水提液組、75%和100%醇提液組與50%醇提液組比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異，提示茯苓50%醇提液對離體小腸的抑制作用優(yōu)于其他各提取液。

4.1.3對離體小腸收縮頻率的影響 如表2所示，離體小腸給予Ach后，收縮頻率較自發(fā)活動時有所升高，給予各組茯苓提取液后，收縮頻率無顯著變化，提示茯苓對痙攣性收縮離體小腸的收縮頻率影響較小。

表1 茯苓不同提取液對小鼠離體小腸平均張力的抑制作用

注：與等劑量溶媒組比較，*P<0.05，**P<0.01：與等劑量茯苓50%醇提液比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖2 茯苓不同部位提取液對小鼠離體小腸平均張力的抑制作用

4.2 茯苓50%醇提取液對新斯的明誘導(dǎo)的胃腸功能亢進(jìn)小鼠胃排空和小腸推進(jìn)的影響

如表3所示，新斯的明給藥后引發(fā)小鼠胃腸功能亢進(jìn)，加速胃排空和小腸推進(jìn)，胃殘留率由正常組的78.96%降至49.38%，小腸推進(jìn)率由正常組的63.48%增至81.81%；給予茯苓50%醇提取液低、中、高劑量后，胃殘留率由模型組的49.38%增至57.23%～76.05%，高劑量組優(yōu)于低劑量和中劑量組(P<0.05)；小腸推進(jìn)率由模型組的81.81%降至65.16%～70.79%，高劑量組優(yōu)于低劑量組(P<0.05)，但與中劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，表明茯苓50%醇提取液對新斯的明誘導(dǎo)的小鼠胃腸功能亢進(jìn)有顯著拮抗作用，且呈一定劑量依賴性關(guān)系。

表2 茯苓不同提取液對離體小鼠小腸收縮頻率的影響

注：與自發(fā)收縮頻率比較，#P<0.05。

表3 茯苓50%醇提液對胃腸功能亢進(jìn)小鼠胃排空和小腸推進(jìn)的影響

注：與空白對照組比較，##P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與高劑量組比較，△P<0.05。

5 討論

茯苓具有利水滲濕、健脾、寧心的功效，能健脾滲濕而止瀉。有研究表明，茯苓能夠顯著改善脾虛大鼠、小鼠的表觀癥狀及特定生化指標(biāo)[15-16]，茯苓粥對泄瀉亦有較好的緩解作用[17]；茯苓水提液[7]對正常小鼠胃排空和小腸推進(jìn)有顯著的抑制作用，茯苓粗體物亦能夠有效舒張正常家兔離體空腸和盲腸[8]；以茯苓為主的方劑，如四君子湯、參苓白術(shù)散、白術(shù)茯苓湯等，對腸易激綜合征、功能性消化不良、炎癥性腸炎等胃腸道疾病均具有良好的治療作用[18-21]。現(xiàn)代研究表明，腹瀉型腸易激綜合征患者的胃排空和小腸內(nèi)容物轉(zhuǎn)運(yùn)速度明顯加快，恢復(fù)正常的胃腸運(yùn)動功能是治療胃腸道疾病的重要途徑[22-23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，茯苓水提液、茯苓醇提液(25%、50%、75%、100%)均能夠有效降低小鼠離體小腸收縮的平均張力，并且茯苓50%醇提液能夠顯著延緩胃腸功能亢進(jìn)小鼠的胃排空和小腸推進(jìn)，充分說明了茯苓確具有抑制小鼠胃腸運(yùn)動的作用。

然而，茯苓不同提取部位的作用強(qiáng)度并不相同，茯苓50%醇提液作用最強(qiáng)，茯苓水提液的作用最弱。我們知道，茯苓的活性成分主要為茯苓多糖和茯苓三萜，多糖能溶于熱水而三萜不易溶于水，但無論是茯苓水提液還是茯苓100%醇提液，對小鼠離體小腸的收縮均有一定抑制作用，提示茯苓三萜和茯苓多糖對小鼠小腸均有抑制作用，但二者作用都低于茯苓25%、50%、75%醇提液，提示茯苓抑制小鼠小腸收縮的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是茯苓三萜，而茯苓多糖也具有一定的抗小鼠小腸收縮的活性。

同時筆者觀察到，各茯苓提取液均有效降低離體小腸收縮的平均張力，使收縮基線降至自發(fā)收縮水平，小腸由Ach刺激的痙攣性收縮狀態(tài)逐漸變?yōu)槭鎻垹顟B(tài)，而對收縮頻率并無明顯的抑制作用，仍保持一定的收縮頻率和幅度，提示茯苓對小腸的解痙作用具有降低小腸緊張性、而又能一定程度地保持其原有的收縮性能的特點(diǎn)。

綜上，本研究明確了茯苓具有抑制胃腸功能亢進(jìn)小鼠胃腸運(yùn)動的活性，篩選出最佳活性部位為茯苓50%醇提液，并根據(jù)不同提取部位的作用差異，初步推測茯苓三萜是其抑制胃腸活動的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，關(guān)于茯苓或其活性成分抗胃腸運(yùn)動的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] Ríos J L.Chemical constituents and pharmacological properties of Poria cocos[J].Planta medical，2011，77(7)：681-691.

[2] Sun Y.Biological activities and potential health benefits of polysaccharides from Poria cocos and their derivatives[J].International journal of biological macromolecules，2014，1(68)：131-134.

[3] 陳鎮(zhèn)，夏泉，黃趙剛，等.白術(shù)揮發(fā)油對小鼠胃腸功能的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15(8)：66-68.

[4] 侯影，張旭，尹麗波，等.木香生品、麩煨品及活性單體對小鼠胃腸運(yùn)動的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(24)：132-135.

[5] 葉富強(qiáng)，陳蔚文，李茹柳，等.四君子湯提取物對大鼠胃腸活動的影響[J].中藥藥理與臨床，2002，18(3)：2-4.

[6] 張建英，梁玲，聶堅，等.補(bǔ)中益氣湯水提物及萃取物對腸肌的作用[J].遼寧中醫(yī)雜志，2015，42(2)：411-412.

[7] 冉小庫，孫云超，劉霞，等.茯苓對正常小鼠胃腸功能的影響[J].中國現(xiàn)代中藥，2015，17(7)：686-689.

[8] 王軍，韓金峰，程會昌，等.茯苓粗提物對家兔離體空腸和盲腸張力的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，42(3)：196-197.

[9] J W Jeong，H H Lee，M H Han，et al.Ethanol extract of Poria cocos reduces the production of inflammatory mediators by suppressing the NF-kappaB signaling pathway in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages[J].BMC Complement Altern Med，2014，1(14)：101-109.

[10]M Yimam，P Jiao，M Hong，et al.A Standardized Composition from Extracts of Myristica Fragrans，Astragalus Membranaceus，and Poria Cocos Protects Liver from Acute Ethanol Insult[J].J Med Food，2016，19(8)：780-788.

[11]Y H Choi.Induction of apoptosis by an ethanol extract of Poria cocos Wolf.in human leukemia U937 cells[J].Oncol Rep，2015，34(5)：2533-2540.

[12]張勝，吳春福，車軼，等.半夏瀉心湯對小鼠胃排空的影響[J].中藥藥理與臨床，2000，16(1)：1-3.

[13]徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：1071.

[14]駱利平，陳凱云，魏瑩，等.小鼠離體小腸平滑肌實(shí)驗(yàn)方法的研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，25(2)：70-73.

[15]李斌，冉小庫，孫云超，等.茯苓對脾虛水濕內(nèi)停大鼠的健脾利水藥效物質(zhì)研究[J].世界中醫(yī)藥，2015，10(12)：1859-1867.

[16]張兵影，薛志強(qiáng)，鄧建新，等.茯苓健脾作用活性部位的研究[J].菌物研究，2007，5(2)：110-112，118.

[17]陳士瑜.茯苓粥治泄瀉食療方[J].食用菌，1999(3)：42.

[18]張曉丹，許嗣立，賈波，等.白術(shù)茯苓與白術(shù)茯苓湯對脾氣虛腹瀉大鼠模型胃腸形態(tài)及水液代謝的影響[J].四川中醫(yī)，2014，32(3)：61-64.

[19]燕貞.中醫(yī)治療腹瀉型腸易激綜合征的臨床效果觀察[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2015，15(22)：158.

[20]謝磊，賈波，羅云波，等.白術(shù)茯苓湯及水煎液提取分離組分對脾氣虛大鼠血管活性腸肽受體親和力的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(8)：2186-2188.

[21]李玉銀，姚國鵬.參苓白術(shù)散聯(lián)合西藥治療腹瀉型腸易激綜合征隨機(jī)平行對照研究[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2014，28(5)：112-113.

[22]張鳴鳴，姜敏.腸易激綜合征發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，2009，17(24)：2484-2490.

[23]陳仕珠.腸易激綜合征發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，1998，6(12)：87-89.

InhibitingEffectsofDifferentExtractsofPoriaonMiceGastrointestinalFunctioninvitroandinvivo

XIAO Honghe，GUO Zhouquan，ZHENG Yu，XU Zhili，SUO Tianjiao，YANG Jingxian*

(CollegeofPharmacy，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China)

Objective：To investigate the relaxing effects among the five extracts of Poriaon gastrointestinal motility in mice and to discover the optimal extract.Methods：Tetanic contraction mice small intestine induced by acetyl choline (Ach) was adopted to evaluate the spasmolytic activities among the aqueous extract，25% alcohol extract，50% alcohol extract，75% alcohol extract and 100% alcohol extract of Poriainvitro，and the mean contractile force (MCF) and the contraction frequency (CF) were investigated.Then，the stomach residue rate and the small intestine propulsive rate were evaluated on gastrointestinal motility hyper-function mice induced by neostigmine after orally giving 50% alcohol extract of Poria.Results：All of the aqueous extract，25% alcohol extract，50% alcohol extract，75% alcohol extract and 100% alcohol extract of Poria reversed the small intestine tetanic contraction induced by Ach reducing the MCF with no inhibition on the CF.Besides，all of the low，middle and high doses of the 50% alcohol extract of Poria improved the stomach residue rate and reduced the intestine propulsive rate with dose-dependent relation.Conclusion：All of the five extracts of Poria could significantly antagonized mice small intestine tetanic contraction induced by Achinvitro，while the 50% alcohol extract of Poria was of the most efficient action，and the 50% alcohol extract of Poria reinstated the gastrointestinal motility of mice induced by neostigmineinvivo.

Poria；isolated small intestinal；gastric emptying；small intestine propulsion，extract fraction

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201102144)

] 楊靜嫻，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)；Tel：(0411)87586009，E-mail：jingxianyang@yahoo.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.017

2016-08-08)

*[