聶西周，何娟，龍凱花，王春柳，李曄，張瑞瑞，劉峰，*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046； 2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，陜西 西安 710075；3.西安培華學(xué)院，陜西 西安 710100；4.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003；5.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

·中藥工業(yè)·

HPLC測(cè)定頭痛寧膠囊中二苯乙烯苷含量△

聶西周1，何娟2，龍凱花3，王春柳4，李曄4，張瑞瑞5，劉峰2，5*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046； 2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，陜西 西安 710075；3.西安培華學(xué)院，陜西 西安 710100；4.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003；5.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

目的：建立頭痛寧膠囊中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(二苯乙烯苷)的HPLC含量測(cè)定方法。方法：采用Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，以乙腈-水(16∶84)為流動(dòng)相為，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，柱溫35 ℃。結(jié)果：二苯乙烯苷在0.278 5 ～2.785 0 μg濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(r=0.999 8)，二苯乙烯苷的平均回收率為102.31%，RSD為1.21%；頭痛寧膠囊中二苯乙烯苷含量為每粒0.89～1.77 mg。結(jié)論：該法易于操作、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可以作為頭痛寧膠囊中二苯乙烯苷的質(zhì)量控制方法。

頭痛寧膠囊；高效液相色譜法；二苯乙烯苷；含量測(cè)定

頭痛寧膠囊由土茯苓、天麻、制何首烏、防風(fēng)、當(dāng)歸及全蝎六味中藥組成的中成藥，具有熄風(fēng)滌痰、逐瘀止痛之功效，臨床主要用于偏頭痛、緊張性頭痛屬痰瘀阻絡(luò)證[1]，臨床療效顯著[2-4]，已收載于《國(guó)家基本醫(yī)療保險(xiǎn)、工傷保險(xiǎn)和生育藥品目錄》(2009年版)，臨床使用廣泛，已進(jìn)入中藥大品種行列。鑒于何首烏中的2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(二苯乙烯苷)具有抗內(nèi)皮細(xì)胞損傷、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂、抗腦缺血、舒張血管等多方面的藥理作用[5-7]，與頭痛寧膠囊的緩解腦血管痙攣、增加大腦供血供氧、改善大腦微循環(huán)等作用[8]相關(guān)，是制何首烏的主要藥效成分之一?；诙揭蚁┸占仁欠街械乃幮С煞?，本研究建立頭痛寧膠囊中二苯乙烯苷的含量測(cè)定方法，進(jìn)一步提高頭痛寧膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為頭痛寧膠囊的生產(chǎn)全過(guò)程質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國(guó)安捷倫1260系列高效液相色譜儀，四元梯度泵，二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，自動(dòng)進(jìn)樣器，OpenLAB CDS ChemStation工作站。U-2910紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，Sartorius BP211D分析天平，Sartorius BP61分析天平，KH-300DE超聲清洗器等。

1.2 試藥

2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110844-201310，供含量測(cè)定用，純度：91%)。頭痛寧膠囊(陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，批號(hào)：141226、150120、150121、150122、150123、150130、150131、150132、150133、150134，規(guī)格：0.4 g/粒)，水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher)。其它試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(16∶84)，流速：1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm，柱溫35 ℃。理論塔板數(shù)以2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.2 樣品制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品適量，加70%乙醇制成每1 mL含2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷1.114 mg的溶液。

2.2.2 供試品溶液 取頭痛寧膠囊裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物約1.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率40 kHz)，放冷，再稱(chēng)定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按頭痛寧膠囊的處方比例和制備方法，制成不含制何首烏藥材的陰性對(duì)照樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果表明，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，供試品溶液與其它組分分離度良好，陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾，見(jiàn)圖 1。

注：1～2.供試品；3～4.陰性對(duì)照樣品；5～6.對(duì)照品。圖1 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照樣品重疊HPLC圖

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密吸取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品溶液(1.114 mg·mL-1)，用70%乙醇稀釋?zhuān)瑵舛确謩e為55.7、69.625、92.833、139.25、278.5、557 μg·mL-1，在上述條件下測(cè)定峰面積，以2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷濃度(X)與峰面積(Y)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程為Y=10.478 2X-82.389 0(r=0.999 8)。結(jié)果表明二苯乙烯苷在0.278 5～2.785 0 μg濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液5 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，記錄其峰面積值，分別是888.5、890.8、882.3、883.2、888.3、888.3，結(jié)果RSD為0.38%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)供試品溶液(批號(hào)：150134)，分別在0、2、4、6、8、12、24 h測(cè)定，計(jì)算其RSD為0.51%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)供試品(批號(hào)：150134)2.5 g，平行6份，按供試品溶液同法制備，精密吸取5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，平均含量為2.88 mg·g-1，RSD為1.93%，表明本法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的樣品約0.5 g(批號(hào)：150134；含量:2.878 mg·g-1)，平行6份，分別精密加入2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品溶液，按供試品溶液同法制備，測(cè)定含量，結(jié)果表明，平均回收率為102.31%，RSD為1.21%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 供試品含量測(cè)定

分別取10個(gè)批次的頭痛寧膠囊，按照2.2.2項(xiàng)下，制備供試品溶液，以2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，頭痛寧膠囊中二苯乙烯苷含量限度范圍為0.89～1.77 mg/粒，平均值為1.26 mg，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10批樣品測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

參考《中華人民共和國(guó)藥典》[9]，對(duì)頭痛寧膠囊中制何首烏的二苯乙烯苷含量測(cè)定方法進(jìn)行了考察。以稀乙醇為溶劑，分別考察了加熱回流和超聲處的提取效果，結(jié)果表明兩種方法含量測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故選擇快捷方便的超聲提取方法；在溶劑選擇的考察中，分別用甲醇、70%乙醇和藥典所用的稀乙醇作為提取溶媒，采用超聲提取，其平均峰面積與樣品量的比值為70%乙醇大于甲醇、稀乙醇，故確定70%乙醇為提取溶劑；超聲時(shí)間的選擇，分別超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)20、30、40 min，發(fā)現(xiàn)超聲30 min和40 min含量測(cè)定結(jié)果接近，故確定超聲時(shí)間為30 min。本研究還采用Agilent Extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5μm)不同色譜柱，進(jìn)行耐受性的考察，結(jié)果樣品欲測(cè)定峰均能基線(xiàn)分離。

10個(gè)批次的頭痛寧膠囊中二苯乙烯苷含量為每粒0.89～1.77 mg，批間差異較大，并對(duì)差異最大的150120和150133兩批次進(jìn)行了室溫干燥放置16個(gè)月的穩(wěn)定性的考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，批號(hào)為150120的頭痛寧膠囊中二苯乙烯苷含量由原來(lái)的1.77 mg/粒下降至1.10 mg/粒，批號(hào)為150133由0.89 mg/粒下降到0.54 mg/粒，究其原因，主要是由于二苯乙烯苷具有光、熱、酸、堿不穩(wěn)定性[10-11]，且制何首烏飲片在炮制生產(chǎn)過(guò)程對(duì)二苯乙烯苷含量影響非常顯著[12]，飲片的批間差異也很大。提示在藥品生產(chǎn)全程質(zhì)量控制中，既要加強(qiáng)各生產(chǎn)單元的過(guò)程控制，更應(yīng)控制投料飲片的質(zhì)量均一穩(wěn)定，減小藥品的批間差異，逐步實(shí)現(xiàn)質(zhì)量均一、穩(wěn)定、安全、可控。同時(shí)，針對(duì)頭痛寧膠囊中二苯乙烯苷，儲(chǔ)運(yùn)應(yīng)在避光、陰涼環(huán)境下進(jìn)行。

[1] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編·中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)部分：經(jīng)絡(luò)·肢體·腦系分冊(cè)[S]，北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：59-61.

[2] 李小玲.頭痛寧膠囊治療偏頭痛45例[J].陜西中醫(yī)，2014，35(5)：554-555.

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DeterminationofStilbeneGlycosideinToutongningCapsulesbyHPL

CNIEXizhou1，HEJuan2，LONGKaihua3，WANGChunliu4，LIYe4，ZHANGRuirui5，LIUFeng2，5*

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang712046，China；2.ShaanxiBuchangPharmaceuticalLimitedCompany，Xi’an710075，China； 3.Xi′anPeihuaUniversity，Xi’an710100，China； 4.ShaanxiAcademyofTraditionalChineseMedicine，Xi’an710003，China； 5.ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce，Xianyang712046，China)

Objective：To establish a HPLC method for the determination of 2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside(Stilbene glycoside)in Toutongning capsules.Methods：HPLC was applied to the quantitative analysis using a Kromasil C18column(250 mm×4.6 mm，5μm).The flowing phase was acetonitrile-water(16∶84)and detecting wavelength was 320 nm.The flow rate was 1.0 mL·min-1and the column temperature was 35 ℃.Results：The calibration curve had good linear relationship in the range of 0.278 5 ～2.7850 μg(r=0.999 8).The average recovery was 102.31% and RSD was 1.21%.The content of stilbene glucoside in Toutongning capsules was 0.89 ～ 1.77 mg per cap.Conclusion：The method is easy to operate，accurate，reproducible and can be used for the determination of stilbene glycoside in Toutongning capsules.

Toutongning capsules；HPLC；stilbene glycoside；content determination

陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(2016SF-368)；2015年陜西省創(chuàng)新人才推進(jìn)計(jì)劃-重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃(步長(zhǎng)制藥中藥大品種技術(shù)改造和二次開(kāi)發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，2015KCT-19)

] 劉峰，主任藥師，研究方向：中藥新藥研發(fā)和大品種技術(shù)改造及開(kāi)發(fā)研究；Tel：(029)88318318，E-mail：liufeng1720@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.022

2016-06-21)

*[