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        地鱉蟲(chóng)抗腫瘤成分提取方法的研究△

        2017-09-21 06:59:05富堯張慧明許龍呂冬云
        中國(guó)現(xiàn)代中藥 2017年4期
        關(guān)鍵詞:佳木斯大學(xué)索氏脂類(lèi)

        富堯,張慧明,許龍,呂冬云*

        (1.佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154002;2.佳木斯大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154002)

        ·中藥工業(yè)·

        地鱉蟲(chóng)抗腫瘤成分提取方法的研究△

        富堯1,張慧明2,許龍1,呂冬云1*

        (1.佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154002;2.佳木斯大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154002)

        目的:對(duì)地鱉蟲(chóng)的脂類(lèi)提取物的最佳提取方法進(jìn)行研究。方法:通過(guò)對(duì)索氏提取與超聲法的對(duì)比,對(duì)超聲時(shí)間、溫度、原料浸泡時(shí)間、有機(jī)溶劑的選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得出最佳的脂類(lèi)提取條件。結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素分析,得出超聲40 min時(shí)提取率為最高,達(dá)到17.23%,60 min時(shí)提取率反而下降為13.7%;超聲溫度在50 ℃時(shí)提取率最高,達(dá)到15.95%,隨后在溫度達(dá)到60 ℃時(shí)下降到14.02%,70 ℃時(shí)下降到10%以下;浸泡6 h時(shí)提取率最高,達(dá)到18.74%。而繼續(xù)延長(zhǎng)浸泡時(shí)間12、24、48 h,對(duì)脂類(lèi)的提取量沒(méi)有影響;有機(jī)溶劑無(wú)水乙醚提取率最高。結(jié)論:超聲法應(yīng)用無(wú)水乙醚浸泡6 h,超聲溫度50 ℃,超聲時(shí)間40 min為地鱉蟲(chóng)脂類(lèi)物質(zhì)提取的最佳條件。

        地鱉蟲(chóng);提取率;超聲波

        地鱉蟲(chóng)EupolyphagasinensisWalker屬顎亞門(mén),六足總綱,有翅亞綱,蜚蠊目,鱉鐮科,地鱉亞科,地鱉屬?!侗静菥V目》:【釋名】地鱉(《本經(jīng)》)、土鱉(《別錄》)、蚵蟲(chóng)(《綱目》)?!独坠谥扑幮越狻罚何断蹋院?,有毒,入心肝脾三經(jīng)。主留血壅瘀,心腹寒熱洗洗,祛堅(jiān)積癥瘕、下乳通經(jīng)?,F(xiàn)代藥學(xué)表明,其逐瘀、破積的功能對(duì)于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著一定的抑制作用。地鱉蟲(chóng)體內(nèi)的纖溶活性蛋白EPS72對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549有著體外抑制腫瘤的作用[1],EFP蛋白對(duì)S180和H22實(shí)體瘤有一定的抑瘤作用,對(duì)H22和S180腹水瘤細(xì)胞端粒酶活性有一定降低作用,可提高Caspase-3表達(dá)水平,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。同時(shí),地鱉蟲(chóng)抗腫瘤有效脂溶性物質(zhì)在體外對(duì)消化道腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用[3]。脂溶性物質(zhì)不溶于水,對(duì)這種脂溶性物質(zhì)的有效提取成為我們研究的方向。本實(shí)驗(yàn)對(duì)地鱉蟲(chóng)脂類(lèi)物質(zhì)提取的最佳方法進(jìn)行研究。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        地鱉蟲(chóng)粉末(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng),編號(hào):121533);無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚、正乙烷、丙酮(哈爾濱博士德生物有限公司,分析純)。

        旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000A(上海亞榮生化儀器廠);KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司);電子精密天平JA5002(上海精天電子有限公司);離心機(jī)(上海安亭公司);DGX-9023鼓風(fēng)干燥箱(太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);索氏提取器(實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器);1 L燒杯、大試管等。

        1.2 方法

        1.2.1 超聲法提取脂類(lèi)物質(zhì) 取地鱉蟲(chóng)粉末2 g放入大試管中,加入20 mL的有機(jī)溶劑浸泡,分別以浸泡時(shí)間、超聲時(shí)間、超聲溫度、不同的溶劑為單一因素提取脂類(lèi)物質(zhì),濾出溶劑,剩下的殘?jiān)湃牒娓上?0 ℃,10 h烘干。烘干后稱(chēng)重(確保固體物質(zhì)完全干燥),計(jì)算提取率,見(jiàn)公式(1)。含有脂類(lèi)的有機(jī)溶劑匯集到一起,放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中,提取脂類(lèi)物質(zhì)。

        脂類(lèi)(%)=提取出脂類(lèi)重量(g)/樣品重(g)×100%

        (1)

        1.2.2 單因素試驗(yàn) 分別以超聲時(shí)間、超聲溫度、粉末浸泡時(shí)間、不同溶劑進(jìn)行單因素試驗(yàn),最終確定最佳提取工藝。見(jiàn)表1。

        表1 單因素水平

        1.2.3 不同溶劑對(duì)提取率的影響 脂類(lèi)物質(zhì)不溶于水,可溶于有機(jī)溶劑,而且有機(jī)溶劑的種類(lèi)不同,脂類(lèi)的提取量也不相同。我們用無(wú)水乙醚、無(wú)水乙醇、正己烷、丙酮4種常用的脂類(lèi)提取溶劑,用超聲法提取地鱉蟲(chóng)的脂類(lèi)物質(zhì),超聲50 min,30 ℃浸泡6 h后提取,方法同上,烘干稱(chēng)重計(jì)算提取率。

        1.2.4 索氏提取與超聲提取法的比較 取5只試管,標(biāo)號(hào),分別加入地鱉蟲(chóng)粉末2 g,無(wú)水乙醚20 mL,浸泡6 h,30 ℃超聲50 min。殘?jiān)娓捎?jì)算提取率。同時(shí)取等量的粉末與無(wú)水乙醚,加入索氏提取器中進(jìn)行提取,殘?jiān)娓捎?jì)算提取率。將兩種方法進(jìn)行比較。

        2 結(jié)果

        2.1 時(shí)間因素

        超聲時(shí)間以60 min為上限,圖中可以看出隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),脂類(lèi)提取率逐漸增大,呈拋物線趨勢(shì),但是,并不是無(wú)限增大的,超聲40 min時(shí)提取率為最高,達(dá)到17.23%,60 min時(shí)提取率反而下降為13.7%。見(jiàn)圖1。

        圖1 不同的超聲時(shí)間對(duì)脂類(lèi)提取率的影響

        2.2 溫度因素

        超聲時(shí)的溫度對(duì)脂類(lèi)的提取有著一定的影響,從圖中可看出隨著溫度的提高提取效率逐漸增大,超聲溫度在50 ℃時(shí)提取率最高,達(dá)到15.95%,隨后在溫度達(dá)到60 ℃時(shí)下降到14.02%,70 ℃時(shí)下降到10%以下,可見(jiàn)60 ℃是提取溫度的界限。見(jiàn)圖2。

        圖2 不同超聲溫度對(duì)脂類(lèi)提取率的影響

        2.3 浸泡時(shí)間

        傳統(tǒng)的脂類(lèi)提取方法中,對(duì)提取物的浸泡是關(guān)鍵的步驟,通常要浸泡24 h以上,時(shí)間長(zhǎng)、效率低。而效率較高的超聲法提取脂類(lèi)物質(zhì)對(duì)于提取物的浸泡時(shí)間也有著條件的限制。圖中隨著浸泡的時(shí)間延長(zhǎng)提取率逐漸增大,浸泡6 h時(shí)提取率最高,達(dá)到18.74%。而繼續(xù)延長(zhǎng)浸泡時(shí)間(12、24、48 h)對(duì)脂類(lèi)的提取量沒(méi)有影響。見(jiàn)圖3。

        圖3 浸泡時(shí)間對(duì)脂類(lèi)提取率影響

        2.4 試劑因素

        脂類(lèi)物質(zhì)不溶于水,易溶于有機(jī)溶劑。我們選擇了4種常用的有機(jī)溶劑進(jìn)行脂類(lèi)的提取,結(jié)果見(jiàn)圖4。提取率由高到低依次為無(wú)水乙醚>正己烷>丙酮>無(wú)水乙醇。

        圖4 不同有機(jī)溶劑對(duì)脂類(lèi)提取率的影響

        2.5 提取方法的對(duì)比

        索氏提取法為傳統(tǒng)的脂類(lèi)提取方法,超聲法為新型的脂類(lèi)提取方法。超聲法的提取率為18.74%,索氏提取法的提取率為14.78%,將二者進(jìn)行比較明顯可以看出超聲法用時(shí)短、提取率高,可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。見(jiàn)圖5。

        圖5 不同提取方法對(duì)脂類(lèi)提取率的影響

        3 結(jié)論

        地鱉蟲(chóng)中脂類(lèi)物質(zhì)的提取最佳條件為超聲法,應(yīng)用超聲法提取時(shí)間為40 min、提取溫度為50 ℃,提取前浸泡6 h,浸泡于無(wú)水乙醚中。

        4 討論

        地鱉蟲(chóng)作為傳統(tǒng)的中藥對(duì)腫瘤有著一定的抑制作用,目前對(duì)于其纖溶活性蛋白的研究有很多,地鱉蟲(chóng)醇提取物(ESE)蛋白可以抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2的增值,并促進(jìn)其凋亡[4]。地鱉蟲(chóng)多肽F2-2具有降低血小板聚集率、延長(zhǎng)凝血啟動(dòng)時(shí)間、降低最大凝固程度以及增加大鼠離體血管環(huán)張力的作用[5]。目前對(duì)于地鱉蟲(chóng)脂類(lèi)的研究比較少,脂類(lèi)物質(zhì)是油、脂肪、類(lèi)脂的總稱(chēng)。從地鱉蟲(chóng)中提取有效的脂類(lèi)物質(zhì)是目前研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)組對(duì)地鱉蟲(chóng)脂類(lèi)的提取及其對(duì)腫瘤的抑制作用進(jìn)行研究,以往的脂類(lèi)提取方法是索氏提取法,其用時(shí)比較長(zhǎng),條件限制比較嚴(yán)格。而超聲提取法是目前比較常用的脂類(lèi)提取的新方法,我們將二者進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)在其他條件統(tǒng)一的情況下超聲法提取脂類(lèi)物質(zhì)的提取率為18.74%,索氏提取法提取率為14.78%,見(jiàn)圖5。超聲波可以使組織中的各類(lèi)物質(zhì)通過(guò)高頻振動(dòng)和空化作用,使大分子物質(zhì)分解成容易溶解的小分子物質(zhì),有機(jī)溶劑可以溶解脂類(lèi)物質(zhì),從而提出。我們用超聲法分別對(duì)地鱉蟲(chóng)粉末進(jìn)行脂類(lèi)提取條件的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)單一條件下,隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)提取效率逐漸增大,40 min為最高,達(dá)到17.23%,50 min時(shí)降到9.77%,60 min降到更低(見(jiàn)圖1)。超聲是利用高頻率的振動(dòng)使組織內(nèi)脂類(lèi)快速滲出,隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)溫度會(huì)升高,過(guò)高的溫度會(huì)使脂類(lèi)揮發(fā),從而降低提取效率,所以在溫度條件的檢測(cè)中,最佳超聲溫度為50 ℃,此時(shí)提取率最大,見(jiàn)圖2,過(guò)高的超聲頻率會(huì)增加組織的溫度,導(dǎo)致脂類(lèi)氧化分解,降低提取率。傳統(tǒng)的索氏提取需要浸泡提取物質(zhì)24 h以上,這樣可以很好地使有機(jī)溶劑與提取物質(zhì)相互融合,增大提取率,但是有機(jī)溶劑會(huì)揮發(fā),長(zhǎng)時(shí)間的浸泡會(huì)使提取率降低。超聲法所需浸泡時(shí)間短,浸泡6 h的提取率達(dá)到18.74%,12 h反而下降到10.2%,雖然24 h時(shí)又升到了11.8%(見(jiàn)圖3),但因耗時(shí)長(zhǎng)、提升效率低,不宜采納。脂類(lèi)物質(zhì)不溶于水,溶于有機(jī)溶劑,我們采用的4種溶劑中無(wú)水乙醚的提取率最高,達(dá)到24.23%,最低為無(wú)水乙醇17.46%(見(jiàn)圖4)。本實(shí)驗(yàn)從脂類(lèi)物質(zhì)中提取出粗提物,并作用于腫瘤細(xì)胞,同時(shí)觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用。對(duì)于地鱉蟲(chóng)脂類(lèi)成分的分離,以及對(duì)其含量的鑒定將作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

        [1] 王鳳霞.中華真地鱉(Eupolyphaga sinensis)抗腫瘤蛋白分離純化及其體外抗轉(zhuǎn)移活性研究 [D].濟(jì)南:山東大學(xué),2013.

        [2] 韓雅莉,曹付春,余磊,等.地鱉纖溶活性蛋白對(duì)S180和H22荷瘤小鼠腫瘤的抑制及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2011,27(10):1387-1391.

        [3] 鄒璽,劉寶瑞,錢(qián)曉萍,等.土鱉蟲(chóng)脂肪酸乳劑的制備及體內(nèi)抗腫瘤作用[J].腫瘤,2004,27(4):333-334.

        [4] 葛鋼鋒,余陳歡,吳巧鳳.土鱉蟲(chóng)醇提物對(duì)體外腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(3):826-828.

        [5] 黃鎮(zhèn)林,杜清華,王宏濤.土鱉蟲(chóng)多肽 F2-2 的體外藥效研究[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(2):4-6.

        StudyonExtractionofAntitumorConstituentsfromEupolyphagasinensis

        FUYao1,ZHANGHuiming2,XULong1,LYUDongyun1*

        (1.CollegeofLifeScience,JiamusiUniversity,Jiamusi154002,China;2.BasicMedicalSciences,Jiamusi154002,China)

        Objective:To optimize the extraction of lipophile fraction ofEupolyphagasinensis.Methods:Through the comparison of Soxhlet extraction and ultrasonic extraction,the extraction conditions for the lipophile fraction were optimized with ultrasonic time,temperature,soaking time of raw material,organic solvent as the factors.Results:In this study, single factor analysis,The extraction rate was 17.23%, and the extraction rate decreased to 13.7% at 60 min;Ultrasonic temperature at 50 ℃ when the extraction rate of the highest, reaching 15.95%, then the temperature reached 60 ℃ to 14.02%. 70 ℃ down to 10% or less;The highest extraction rate was 18.74% when soaked for 6 h. While the prolonged soaking time 12h, 24h, 48h had no effect on the extraction of lipids;Organic solvent anhydrous ether extraction rate of the highest.Conclusion:The optimized condition was as follows:anhydrous ether soak 6 h,ultrasonic temperature 50,ultrasonic time 40 min.

        EupolyphagasinensisWalker;extraction rate;ultrasonic

        佳木斯大學(xué)學(xué)研究生創(chuàng)新課題(LZR2014_002);佳木斯大學(xué)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(JMSUJCMS2016-064)

        ] 呂冬云,教授,研究方向:應(yīng)用昆蟲(chóng);E-mail:lvdongyun1@eyou.com

        10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.018

        2016-03-16)

        *[

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