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        地鱉蟲抗腫瘤成分提取方法的研究△

        2017-09-21 06:59:05富堯張慧明許龍呂冬云
        中國現(xiàn)代中藥 2017年4期
        關(guān)鍵詞:佳木斯大學(xué)索氏脂類

        富堯,張慧明,許龍,呂冬云*

        (1.佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154002;2.佳木斯大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154002)

        ·中藥工業(yè)·

        地鱉蟲抗腫瘤成分提取方法的研究△

        富堯1,張慧明2,許龍1,呂冬云1*

        (1.佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154002;2.佳木斯大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154002)

        目的:對地鱉蟲的脂類提取物的最佳提取方法進行研究。方法:通過對索氏提取與超聲法的對比,對超聲時間、溫度、原料浸泡時間、有機溶劑的選擇進行實驗,得出最佳的脂類提取條件。結(jié)果:本實驗通過單因素分析,得出超聲40 min時提取率為最高,達到17.23%,60 min時提取率反而下降為13.7%;超聲溫度在50 ℃時提取率最高,達到15.95%,隨后在溫度達到60 ℃時下降到14.02%,70 ℃時下降到10%以下;浸泡6 h時提取率最高,達到18.74%。而繼續(xù)延長浸泡時間12、24、48 h,對脂類的提取量沒有影響;有機溶劑無水乙醚提取率最高。結(jié)論:超聲法應(yīng)用無水乙醚浸泡6 h,超聲溫度50 ℃,超聲時間40 min為地鱉蟲脂類物質(zhì)提取的最佳條件。

        地鱉蟲;提取率;超聲波

        地鱉蟲EupolyphagasinensisWalker屬顎亞門,六足總綱,有翅亞綱,蜚蠊目,鱉鐮科,地鱉亞科,地鱉屬?!侗静菥V目》:【釋名】地鱉(《本經(jīng)》)、土鱉(《別錄》)、蚵蟲(《綱目》)?!独坠谥扑幮越狻罚何断蹋院?,有毒,入心肝脾三經(jīng)。主留血壅瘀,心腹寒熱洗洗,祛堅積癥瘕、下乳通經(jīng)?,F(xiàn)代藥學(xué)表明,其逐瘀、破積的功能對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著一定的抑制作用。地鱉蟲體內(nèi)的纖溶活性蛋白EPS72對人肺癌細胞株A549有著體外抑制腫瘤的作用[1],EFP蛋白對S180和H22實體瘤有一定的抑瘤作用,對H22和S180腹水瘤細胞端粒酶活性有一定降低作用,可提高Caspase-3表達水平,誘導(dǎo)細胞凋亡[2]。同時,地鱉蟲抗腫瘤有效脂溶性物質(zhì)在體外對消化道腫瘤細胞的生長有明顯的抑制作用[3]。脂溶性物質(zhì)不溶于水,對這種脂溶性物質(zhì)的有效提取成為我們研究的方向。本實驗對地鱉蟲脂類物質(zhì)提取的最佳方法進行研究。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        地鱉蟲粉末(國家標準物質(zhì)網(wǎng),編號:121533);無水乙醇、無水乙醚、正乙烷、丙酮(哈爾濱博士德生物有限公司,分析純)。

        旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000A(上海亞榮生化儀器廠);KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲機(昆山市超聲儀器有限公司);電子精密天平JA5002(上海精天電子有限公司);離心機(上海安亭公司);DGX-9023鼓風(fēng)干燥箱(太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司);索氏提取器(實驗室常規(guī)儀器);1 L燒杯、大試管等。

        1.2 方法

        1.2.1 超聲法提取脂類物質(zhì) 取地鱉蟲粉末2 g放入大試管中,加入20 mL的有機溶劑浸泡,分別以浸泡時間、超聲時間、超聲溫度、不同的溶劑為單一因素提取脂類物質(zhì),濾出溶劑,剩下的殘渣放入烘干箱80 ℃,10 h烘干。烘干后稱重(確保固體物質(zhì)完全干燥),計算提取率,見公式(1)。含有脂類的有機溶劑匯集到一起,放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中,提取脂類物質(zhì)。

        脂類(%)=提取出脂類重量(g)/樣品重(g)×100%

        (1)

        1.2.2 單因素試驗 分別以超聲時間、超聲溫度、粉末浸泡時間、不同溶劑進行單因素試驗,最終確定最佳提取工藝。見表1。

        表1 單因素水平

        1.2.3 不同溶劑對提取率的影響 脂類物質(zhì)不溶于水,可溶于有機溶劑,而且有機溶劑的種類不同,脂類的提取量也不相同。我們用無水乙醚、無水乙醇、正己烷、丙酮4種常用的脂類提取溶劑,用超聲法提取地鱉蟲的脂類物質(zhì),超聲50 min,30 ℃浸泡6 h后提取,方法同上,烘干稱重計算提取率。

        1.2.4 索氏提取與超聲提取法的比較 取5只試管,標號,分別加入地鱉蟲粉末2 g,無水乙醚20 mL,浸泡6 h,30 ℃超聲50 min。殘渣烘干計算提取率。同時取等量的粉末與無水乙醚,加入索氏提取器中進行提取,殘渣烘干計算提取率。將兩種方法進行比較。

        2 結(jié)果

        2.1 時間因素

        超聲時間以60 min為上限,圖中可以看出隨著超聲時間的延長,脂類提取率逐漸增大,呈拋物線趨勢,但是,并不是無限增大的,超聲40 min時提取率為最高,達到17.23%,60 min時提取率反而下降為13.7%。見圖1。

        圖1 不同的超聲時間對脂類提取率的影響

        2.2 溫度因素

        超聲時的溫度對脂類的提取有著一定的影響,從圖中可看出隨著溫度的提高提取效率逐漸增大,超聲溫度在50 ℃時提取率最高,達到15.95%,隨后在溫度達到60 ℃時下降到14.02%,70 ℃時下降到10%以下,可見60 ℃是提取溫度的界限。見圖2。

        圖2 不同超聲溫度對脂類提取率的影響

        2.3 浸泡時間

        傳統(tǒng)的脂類提取方法中,對提取物的浸泡是關(guān)鍵的步驟,通常要浸泡24 h以上,時間長、效率低。而效率較高的超聲法提取脂類物質(zhì)對于提取物的浸泡時間也有著條件的限制。圖中隨著浸泡的時間延長提取率逐漸增大,浸泡6 h時提取率最高,達到18.74%。而繼續(xù)延長浸泡時間(12、24、48 h)對脂類的提取量沒有影響。見圖3。

        圖3 浸泡時間對脂類提取率影響

        2.4 試劑因素

        脂類物質(zhì)不溶于水,易溶于有機溶劑。我們選擇了4種常用的有機溶劑進行脂類的提取,結(jié)果見圖4。提取率由高到低依次為無水乙醚>正己烷>丙酮>無水乙醇。

        圖4 不同有機溶劑對脂類提取率的影響

        2.5 提取方法的對比

        索氏提取法為傳統(tǒng)的脂類提取方法,超聲法為新型的脂類提取方法。超聲法的提取率為18.74%,索氏提取法的提取率為14.78%,將二者進行比較明顯可以看出超聲法用時短、提取率高,可為后續(xù)實驗提供依據(jù)。見圖5。

        圖5 不同提取方法對脂類提取率的影響

        3 結(jié)論

        地鱉蟲中脂類物質(zhì)的提取最佳條件為超聲法,應(yīng)用超聲法提取時間為40 min、提取溫度為50 ℃,提取前浸泡6 h,浸泡于無水乙醚中。

        4 討論

        地鱉蟲作為傳統(tǒng)的中藥對腫瘤有著一定的抑制作用,目前對于其纖溶活性蛋白的研究有很多,地鱉蟲醇提取物(ESE)蛋白可以抑制人肝癌細胞株HepG2的增值,并促進其凋亡[4]。地鱉蟲多肽F2-2具有降低血小板聚集率、延長凝血啟動時間、降低最大凝固程度以及增加大鼠離體血管環(huán)張力的作用[5]。目前對于地鱉蟲脂類的研究比較少,脂類物質(zhì)是油、脂肪、類脂的總稱。從地鱉蟲中提取有效的脂類物質(zhì)是目前研究的重點。本實驗組對地鱉蟲脂類的提取及其對腫瘤的抑制作用進行研究,以往的脂類提取方法是索氏提取法,其用時比較長,條件限制比較嚴格。而超聲提取法是目前比較常用的脂類提取的新方法,我們將二者進行比較,發(fā)現(xiàn)在其他條件統(tǒng)一的情況下超聲法提取脂類物質(zhì)的提取率為18.74%,索氏提取法提取率為14.78%,見圖5。超聲波可以使組織中的各類物質(zhì)通過高頻振動和空化作用,使大分子物質(zhì)分解成容易溶解的小分子物質(zhì),有機溶劑可以溶解脂類物質(zhì),從而提出。我們用超聲法分別對地鱉蟲粉末進行脂類提取條件的測定,發(fā)現(xiàn)單一條件下,隨著超聲時間的延長提取效率逐漸增大,40 min為最高,達到17.23%,50 min時降到9.77%,60 min降到更低(見圖1)。超聲是利用高頻率的振動使組織內(nèi)脂類快速滲出,隨著超聲時間的延長溫度會升高,過高的溫度會使脂類揮發(fā),從而降低提取效率,所以在溫度條件的檢測中,最佳超聲溫度為50 ℃,此時提取率最大,見圖2,過高的超聲頻率會增加組織的溫度,導(dǎo)致脂類氧化分解,降低提取率。傳統(tǒng)的索氏提取需要浸泡提取物質(zhì)24 h以上,這樣可以很好地使有機溶劑與提取物質(zhì)相互融合,增大提取率,但是有機溶劑會揮發(fā),長時間的浸泡會使提取率降低。超聲法所需浸泡時間短,浸泡6 h的提取率達到18.74%,12 h反而下降到10.2%,雖然24 h時又升到了11.8%(見圖3),但因耗時長、提升效率低,不宜采納。脂類物質(zhì)不溶于水,溶于有機溶劑,我們采用的4種溶劑中無水乙醚的提取率最高,達到24.23%,最低為無水乙醇17.46%(見圖4)。本實驗從脂類物質(zhì)中提取出粗提物,并作用于腫瘤細胞,同時觀察其對腫瘤細胞的生物學(xué)作用。對于地鱉蟲脂類成分的分離,以及對其含量的鑒定將作為后續(xù)實驗進行。

        [1] 王鳳霞.中華真地鱉(Eupolyphaga sinensis)抗腫瘤蛋白分離純化及其體外抗轉(zhuǎn)移活性研究 [D].濟南:山東大學(xué),2013.

        [2] 韓雅莉,曹付春,余磊,等.地鱉纖溶活性蛋白對S180和H22荷瘤小鼠腫瘤的抑制及誘導(dǎo)細胞凋亡作用[J].中國藥理學(xué)通報,2011,27(10):1387-1391.

        [3] 鄒璽,劉寶瑞,錢曉萍,等.土鱉蟲脂肪酸乳劑的制備及體內(nèi)抗腫瘤作用[J].腫瘤,2004,27(4):333-334.

        [4] 葛鋼鋒,余陳歡,吳巧鳳.土鱉蟲醇提物對體外腫瘤細胞增殖的抑制作用及其機制研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(3):826-828.

        [5] 黃鎮(zhèn)林,杜清華,王宏濤.土鱉蟲多肽 F2-2 的體外藥效研究[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(2):4-6.

        StudyonExtractionofAntitumorConstituentsfromEupolyphagasinensis

        FUYao1,ZHANGHuiming2,XULong1,LYUDongyun1*

        (1.CollegeofLifeScience,JiamusiUniversity,Jiamusi154002,China;2.BasicMedicalSciences,Jiamusi154002,China)

        Objective:To optimize the extraction of lipophile fraction ofEupolyphagasinensis.Methods:Through the comparison of Soxhlet extraction and ultrasonic extraction,the extraction conditions for the lipophile fraction were optimized with ultrasonic time,temperature,soaking time of raw material,organic solvent as the factors.Results:In this study, single factor analysis,The extraction rate was 17.23%, and the extraction rate decreased to 13.7% at 60 min;Ultrasonic temperature at 50 ℃ when the extraction rate of the highest, reaching 15.95%, then the temperature reached 60 ℃ to 14.02%. 70 ℃ down to 10% or less;The highest extraction rate was 18.74% when soaked for 6 h. While the prolonged soaking time 12h, 24h, 48h had no effect on the extraction of lipids;Organic solvent anhydrous ether extraction rate of the highest.Conclusion:The optimized condition was as follows:anhydrous ether soak 6 h,ultrasonic temperature 50,ultrasonic time 40 min.

        EupolyphagasinensisWalker;extraction rate;ultrasonic

        佳木斯大學(xué)學(xué)研究生創(chuàng)新課題(LZR2014_002);佳木斯大學(xué)自然科學(xué)研究項目(JMSUJCMS2016-064)

        ] 呂冬云,教授,研究方向:應(yīng)用昆蟲;E-mail:lvdongyun1@eyou.com

        10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.018

        2016-03-16)

        *[

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