王貴金，宋劍，畢丹，賈繼明

(河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司，河北 石家莊 050035)

·中藥工業(yè)·

淫羊藿提取物中總黃酮含量測定方法的改進(jìn)△

王貴金，宋劍，畢丹，賈繼明*

(河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司，河北 石家莊 050035)

目的：對《中國人民共和國藥典》方法和改進(jìn)法在測定淫羊藿提取物中總黃酮含量的研究分析。方法：以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷4個不同的對照品為對照按照《中國人民共和國藥典》方法測定混合對照品的含量，與改進(jìn)法通過折合分子量計算校正因子，再通過校正因子計算淫羊藿提取物中總黃酮的含量，將結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：《中華人民共和國藥典》中測定淫羊藿中總黃酮含量的方法誤差較大，而改進(jìn)法以朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷為對照品測定淫羊藿提取物的含量，乘以相應(yīng)的校正因子，得到的含量結(jié)果接近真實值。結(jié)論：改進(jìn)方法簡便易行，專屬性強(qiáng)，是理想的測定淫羊藿提取物中總黃酮含量的方法。

淫羊藿苷；總黃酮；淫羊藿提取物

肌萎靈凍干粉用于治療運動神經(jīng)元疾病、進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥、硬皮病、多發(fā)性硬化、多發(fā)性神經(jīng)炎、多發(fā)性肌炎、先天性肌病等疾病所致的肌肉萎縮，也可用于重癥肌無力的治療[1]。本制劑由人參提取物和淫羊藿提取物兩味中藥組成，《中華人民共和國藥典》僅收載了人參提取物的總皂苷的含量測定方法[2]，而淫羊藿提取物中總黃酮的含量測定方法的研究未見報道，直接使用《中華人民共和國藥典》中對淫羊藿藥材中總黃酮含量測定方法測定[2]，誤差較大，鑒于黃酮類成分有較好的生物活性[3-8]，為了更好地控制肌萎靈凍干粉的質(zhì)量，保證臨床用藥的安全有效，作者對淫羊藿提取物中總黃酮的含量測定方法進(jìn)行研究，與《中華人民共和國藥典》中淫羊藿藥材的總黃酮的含量測定方法進(jìn)行比較，并對藥典方法進(jìn)行改進(jìn)，通過折合分子量計算出校正因子，應(yīng)用于淫羊藿提取物的總黃酮的含量測定方法中，增加了方法的準(zhǔn)確性和專屬性。

1 儀器與試藥

Cary60紫外-可見分光光度計(美國安捷倫公司)；XP105DR型十萬分之一電子天平(Mettlet Toledo)；Millipore A10型超純水機(jī)(美國密理博公司)；KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

朝藿定A、朝藿定B(成都曼斯特生物制品有限公司，純度大于98%)；朝藿定C(中國食品藥品檢定研究院，批號：111780-200801，純度99.1%)；淫羊藿苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111607-200402，供含量測定用)；淫羊藿提取物(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號分別為20141003，20141101，20150101)；乙醇(北京化學(xué)試劑廠，分析純)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取朝藿定A對照品11.62 mg、朝藿定B對照品10.12 mg、朝藿定C對照品11.30 mg、淫羊藿苷對照品10.16 mg，置不同的100 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液，分別精密吸取儲備液1 mL置不同10 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 混合對照品的制備 精密稱取朝藿定A對照品6.32 mg、朝藿定B對照品5.68 mg、朝藿定C對照品10.46 mg、淫羊藿苷對照品19.62 mg，置同一100 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液，精密吸取儲備液1 mL置50 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取20141003批淫羊藿提取物33.21 mg、20141101批淫羊藿提取物34.56 mg、20150101批淫羊藿提取物35.34 mg，置不同的50 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液，分別精密吸取儲備液1 mL置不同50 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 最大波長的選擇

取2.1項下對照品、混合對照品、供試品(批號20141003)分別在200～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)對照品和供試品均在270 nm左右最大吸收，吸收峰相似，故選擇270 nm作為淫羊藿提取物總黃酮含量測定的波長，見圖1。

圖1 最大波長掃描圖譜

2.3 線性關(guān)系考察

分別取2.1.1項下的對照品儲備液，分別精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL至不同的10 mL量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻。以稀乙醇為空白，照紫外分光光度法在270 nm處測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制4個對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，朝藿定A的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.027X+0.001 7，r=0.999 9(n=5)，表明朝藿定A對照品溶液在5.81～29.05 μg·mL-1線性良好；朝藿定B的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.030 6X+0.000 7，r=0.999 8(n=5)，表明朝藿定B對照品溶液在5.06～25.30 μg·mL-1線性良好；朝藿定C的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.03X-0.002 2，r=0.999 9(n=5)，表明朝藿定C對照品溶液在5.65～28.25 μg·mL-1線性良好；淫羊藿苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.035 8X-0.000 1，r=0.999 8(n=5)，表明淫羊藿苷對照品溶液在5.08～25.40 μg·mL-1線性良好。

2.4 精密度試驗

分別取2.1.1項下的對照品溶液，以稀乙醇為空白，照紫外分光光度法在270 nm處測定吸光度(n=5)，結(jié)果朝藿定A的RSD為0.25%，朝藿定B的RSD為0.17%，朝藿定C的RSD為0.21%，淫羊藿苷RSD為0.26%，精密度結(jié)果良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

分別取2.1.1項下的對照品溶液，以稀乙醇為空白，照紫外分光光度法在270 nm處分別于0、2、4、8、12、24 h測定吸光度(n=6)，結(jié)果朝藿定A的RSD為0.35%，朝藿定BRSD為0.28%，朝藿定C的RSD為0.31%，淫羊藿苷RSD為0.37%，對照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 《中華人民共和國藥典》法對混合對照品的含量測定

分別取2.1.1項對照品溶液和2.1.2項下的混合對照品的溶液，以稀乙醇為空白，照《中華人民共和國藥典》2015版，淫羊藿總黃酮含量測定項下的紫外分光光度法在270 nm處測定吸光度并計算含量，結(jié)果見表1。

表1 《中華人民共和國藥典》法對混合對照品含量測定結(jié)果

2.7 含量計算方法的改進(jìn)

根據(jù)混合對照品中每個對照品取樣所占的不同百分比，結(jié)合對照品的不同分子量，與百分比進(jìn)行相乘，計算的折合分子量相加即為混合對照品的折合分子量，再用混合對照品的折合分子量與對照品分子量作比值，此比值作為含量計算時需要折合的校正因子，即可計算出相對準(zhǔn)確的結(jié)果，將表1的含量結(jié)果以校正因子進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表2

表2 混合對照品含量測定結(jié)果的改進(jìn)

2.8 《中華人民共和國藥典》法與改進(jìn)法對3批樣品的含量測定

取2.1項下的淫羊藿苷對照品和供試品溶液以稀乙醇為空白，照紫外分光光度法在270 nm處測定吸光度(藥典法)并根據(jù)校正因子(改進(jìn)法，校正因子見表2中)計算含量，結(jié)果見表3。

表3 《中華人民共和國藥典》法與改進(jìn)法對3批樣品含量測定結(jié)果

3 結(jié)果與討論

從表1結(jié)果可以看出，按照《中華人民共和國藥典》2015版淫羊藿總黃酮含量測定方法，以淫羊藿苷為對照品計算混合對照品的含量，僅為91.03%，混合對照品的實際含量應(yīng)該接近100%，而以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C為對照品，按照藥典方法測定混合對照品的含量，均大于100%。而表2的改進(jìn)法中分別以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷為對照品測定的含量，結(jié)果分別乘以相應(yīng)的校正因子，得到混合對照品的含量，除了以朝藿定A為對照的結(jié)果外，其他3個對照品計算的含量值都接近100%，與實際結(jié)果相符合。因此測定淫羊藿提取物的總黃酮含量，使用藥典中淫羊藿苷為對照品時，含量結(jié)果應(yīng)該用改進(jìn)法乘以校正因子1.12，結(jié)果才更加接近真實值。

淫羊藿提取物作為注射用肌萎靈凍干粉的制劑投料中間體，其總黃酮的含量測定準(zhǔn)確性對制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有著至關(guān)重要的作用。

《中華人民共和國藥典》中測定淫羊藿總黃酮的方法主要是針對淫羊藿藥材而制定，在朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C含量不高的情況下，誤差較小，但是當(dāng)淫羊藿提取物得到純化后，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C含量對總黃酮含量影響很大，按照藥典方法以淫羊藿苷為對照品計算誤差很大，因為從表2改進(jìn)法結(jié)果可以看出，淫羊藿苷在4個主要成分中分子量最小，比折合分子量值還小，所以藥典方法測定淫羊藿總黃酮的值偏低，必須乘以校正因子進(jìn)行校正。

用4個對照品進(jìn)行校正因子折合計算中，除了朝藿定A以外，其余結(jié)果均與實際值相符，說明此方法可行，朝藿定A之所以有誤差一是它的分子量最大，比折合分子量大很多；二是它在總量中含量很小，二者結(jié)合導(dǎo)致計算誤差偏大，建議在計算淫羊藿提取物中總黃酮含量時，可以選擇朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷為對照品并乘以校正因子。

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ImprovementofDeterminationMethodofTotalFlavonoidsinEpimediumExtract

WANGGuijin，SONGJian，BIDan，JIAJiming*

(HebeiYilingMedicalResearchAcademyCo.Ltd.，Shijiazhuang050035，China)

Objective：To improve the pharmacopoeia method for determination of total flavonoids inEpimediumextract.Methods：Epimedin A，epimedin B，epimedin C and icariin were used as reference substance to determine the total flavonoids with the pharmacopoeia method as the contrast.Results：The improved method had a better accuracy of measurement comparing to pharmacopoeia method.Conclusion：The improved method is easy，accurate，specific，and better suitable for determine the content of total flavonoids inEpimediumextract

Icariin；total flavonoids；Epimediumextract

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973)項目(2012CB518600)

] 賈繼明，正高級工程師，研究方向：天然產(chǎn)物研究；E-mail：jiajiming@yiling.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.021

2016-05-10)

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