申潔，李珮，畢武，何春年，肖培根

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院衛(wèi)生部腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410008)

·基礎(chǔ)研究·

蘋(píng)果屬植物葉中α-葡萄糖苷酶抑制劑的初步研究△

申潔1,2，李珮1,2，畢武1，2，3，何春年1，2*，肖培根1，2

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院衛(wèi)生部腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410008)

目的：初步評(píng)價(jià)蘋(píng)果葉提取物及主要化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。方法：采用經(jīng)典α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定方法，對(duì)蘋(píng)果屬不同種(品種)、不同產(chǎn)地來(lái)源的20種共40份蘋(píng)果葉提取物與3種主要化合物進(jìn)行了α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選，并與陽(yáng)性對(duì)照藥阿卡波糖進(jìn)行比較。結(jié)果：在樣品濃度為2 mg·mL-1的濃度體系下，所測(cè)樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶均有不同程度的抑制作用，其中23份提取物和2個(gè)化合物(根皮素和槲皮素)的IC50值低于阿卡波糖的IC50值，且絕大多數(shù)提取物的IC50值低于其所含的化合物IC50值。結(jié)論：根皮素、槲皮素和根皮苷等成分是蘋(píng)果屬植物葉提取物抑制α-葡萄糖苷酶的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，且可能還含有其它協(xié)同作用的成分存在，值得深入研究；不同種(品種)、不同產(chǎn)地來(lái)源的蘋(píng)果屬植物葉片提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性存在一定的差異，多數(shù)提取物顯示了較強(qiáng)的活性。本實(shí)驗(yàn)為蘋(píng)果屬植物葉片資源的可持續(xù)利用和開(kāi)發(fā)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

蘋(píng)果屬；蘋(píng)果屬葉片；α-葡萄糖苷酶；抑制活性；資源利用

蘋(píng)果屬(Malus)為薔薇科(Rosaceae)植物，分布于北溫帶廣大地區(qū)。我國(guó)是世界蘋(píng)果屬植物的起源中心和多樣性中心，具有豐富的野生資源和繁多的栽培品種，其中蘋(píng)果MaluspumilaMill.是世界上最著名的水果之一，栽培面積和果實(shí)產(chǎn)量均為世界最高[1-4]。以前該屬植物的研究主要集中于食品行業(yè)對(duì)其果實(shí)的風(fēng)味、品質(zhì)和產(chǎn)量等方面，對(duì)該屬植物葉片資源研究相對(duì)較少。

蘋(píng)果屬約有35種，在我國(guó)約有20余種[2]，部分蘋(píng)果屬植物葉有一定的藥用保健價(jià)值，例如：西府海棠的果可入藥，主治泄瀉、痢疾[1]；蘋(píng)果葉，能涼血解毒[1]，據(jù)《滇南本草》記載：“敷臍上治陰癥。又治產(chǎn)后血迷，經(jīng)水不調(diào)，蒸熱發(fā)燒，服之效”[2]。尖嘴林檎和楸子的果實(shí)都可健脾消食[1]；毛山荊子葉可入藥，可用于痙攣性酸痛和急性腹瀉[1]；湖北海棠嫩葉常做茶飲，可消暑，也具有消積化食，溫和健脾的功效[1-2]。現(xiàn)代研究表明蘋(píng)果屬植物葉中含有豐富的多酚類化合物，主要化合物有根皮苷、根皮素、槲皮素等[5-7]。該屬植物葉具有降糖、抗氧化、抗過(guò)敏、抗齲齒、降低膽固醇、防治心腦血管疾病等多種藥理活性[8-11]。

α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-glucosidase inhibitors，AGI)是一類通過(guò)延緩腸道內(nèi)碳水化合物的水解和吸收從而到達(dá)有效控制餐后血糖上升的糖尿病治療藥物，具有控制餐后血糖、保護(hù)胰島細(xì)胞功能及改善多種糖尿病并發(fā)癥等作用，目前已經(jīng)成為單純飲食控制不佳的2型糖尿病患者的首選藥物及1型糖尿病患者使用胰島素治療的首選輔助藥物。從天然植物中尋找具有更低毒副作用、更高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，湖北海棠和平邑甜茶的葉片做茶飲具有一定的降糖作用。蘋(píng)果葉的主要化合物根皮素，也有一定的降糖作用，但針對(duì)整個(gè)蘋(píng)果屬植物葉降糖方面的研究較少。鑒于我國(guó)蘋(píng)果屬植物葉資源豐富且有潛在的降糖價(jià)值，但未得到系統(tǒng)比較研究和有效利用的現(xiàn)狀，本課題組廣泛取樣，選取40份蘋(píng)果屬植物樣品，涵蓋26份野生種和11份常見(jiàn)栽培品種，以及文獻(xiàn)報(bào)道樣品中含有的主要化合物根皮素、根皮苷和槲皮素等成分。開(kāi)展了蘋(píng)果屬植物葉抑制α-葡萄糖苷酶的初步活性評(píng)價(jià)，旨在為該屬豐富的資源利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

蘋(píng)果屬植物葉片于2014年9月底和10月初采自北京市和遼寧省興城市，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所程存剛研究員和北京農(nóng)學(xué)院姚允聰研究員鑒定，保存在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所親緣中心，樣品信息見(jiàn)表1。本實(shí)驗(yàn)所用為其干燥葉片的70%乙醇提取物。蘋(píng)果屬植物葉片主要化合物根皮苷、根皮素(自制，為本實(shí)驗(yàn)室從多穗柯甜茶中分離得到，并經(jīng)UV、IR、NMR 等光譜鑒定，HPLC檢測(cè)純度大于98 %)，槲皮素(購(gòu)于成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司)。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，G5003-100UN，美國(guó)Sigma公司)；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，N1377-1G，美國(guó)Sigma公司)；阿卡波糖(德國(guó)Bayer公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器

SPE-111中藥秒級(jí)程控提取機(jī)(北京金鼎科技發(fā)展有限公司)，BioRad550型微孔板掃描酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物的制備

將蘋(píng)果屬植物葉片陰干，粉碎，取約20 g，精密稱定，加入70%的乙醇500 mL浸泡5 min，利用中藥秒級(jí)程控提取裝置提取3 min，所得提取溶液過(guò)濾，收集濾液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得流浸膏，進(jìn)一步用真空干燥箱烘干，獲得干浸膏粉末，保存于-20 ℃冰箱中。

準(zhǔn)確稱取樣品干浸膏粉末5 mg，置Eppendorf管中，加入1 mL DMSO溶解，配置成濃度約5 mg·mL-1的樣品溶液母液，待用。

2.2 PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

精密稱取對(duì)硝基苯酚(PNP)約0.01 g，于10 mL容量瓶中，加入PBS溶解并定容至刻度，得到PNP儲(chǔ)備液10.10 mmol·L-1。將PNP儲(chǔ)備液稀釋為0.1、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0 mmol·L-1的濃度，吸取不同濃度的PNP溶液150 μL于96孔酶標(biāo)板內(nèi)，再依次分別加入0.2 mol·L-1的碳酸鈉溶液100 μL終止反應(yīng)，混勻，在405 nm下測(cè)定吸光值。以PNP濃度為橫坐標(biāo)和吸光度值為縱坐標(biāo)，制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程：Y=7.308 3X-0.0011，r=0.999 0，表明PNP在0～0.1 mmol·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 酶活性測(cè)定方法和酶活性抑制率的計(jì)算

為適應(yīng)本實(shí)驗(yàn)篩選的實(shí)際要求，按照已有方法[12-15]改進(jìn)，以PNPG為底物，α-葡萄糖苷酶可以特異性地水解PNPG中的糖苷鍵，生成的水解產(chǎn)物 PNP在405 nm下有吸光值，通過(guò)測(cè)定吸光值計(jì)算水解產(chǎn)物PNP的含量，來(lái)計(jì)算樣品提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性。確定以96孔板為反應(yīng)載體，最終反應(yīng)體積為250 μL。

因樣品母液，用PBS稀釋時(shí)會(huì)產(chǎn)生混懸物，故樣品仍選用DMSO稀釋，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[16]DMSO會(huì)對(duì)使測(cè)定的吸光度(A)值升高。本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系中DMSO的終體積濃度為4%，使A值升高1.40%，影響較小，故仍選擇終體積濃度4%的DMSO樣品液進(jìn)行α-葡萄糖苷酶活性測(cè)試反應(yīng)。

反應(yīng)體系：分別吸取0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)40 μL和待測(cè)樣品溶液10 μL，加入2 mmol·L-1的PNPG和0.1 U·mL-1的α-葡萄糖苷酶各50 μL，搖勻，在37 ℃保溫反應(yīng)20 min后，加入0.2 mol·L-1碳酸鈉溶液100 μL終止反應(yīng)，于405 nm下測(cè)定吸光度。隨行用磷酸鹽緩沖液代替酶液作空白對(duì)照，重復(fù)3次，取平均值，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)生的PNP含量變化來(lái)計(jì)算α-葡萄糖苷酶活性。

由于樣品提取物都含有色素，因此樣品需要測(cè)定背景吸收，以10 μL的DMSO代替樣品溶液進(jìn)行校正，α-葡萄糖苷酶活性的抑制率按下式計(jì)算：

抑制率(%)=(Am-Ay)/Am× 100

式中：Am為酶與底物反應(yīng)后的吸收度值(扣除相應(yīng)空白)；Ay為加入抑制劑后酶反應(yīng)的吸收度(扣除相應(yīng)空白)。

2.4 反應(yīng)體系酶濃度的確定

按照“2.3”項(xiàng)下方法，用0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)代替樣品溶液，加入濃度分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 U·mL-1的酶溶液，其他條件不變，反應(yīng)結(jié)束后，在405 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算回歸方程為Y=11.58X+0.0403，r=0.998 9。在其它組分濃度不變的條件下，反應(yīng)體系中酶濃度加大則反應(yīng)速度越快，當(dāng)酶濃度為0.1 U·mL-1時(shí)，酶量與反應(yīng)產(chǎn)物PNP之間呈良好的濃度依賴關(guān)系，酶反應(yīng)速度可以達(dá)到篩選測(cè)定的要求，最終實(shí)驗(yàn)選定濃度為0.1 U·mL-1的α-葡萄糖苷酶溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 α-葡萄糖苷酶濃度對(duì)酶活性測(cè)定的影響(n=3)

圖2 阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用(n=3)

2.5 阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

按照“2.3”項(xiàng)下方法，用濃度分別為0、0.2、0.4、0.8、1.6、2、2.4、3、4 mg·mL-1阿卡波糖陽(yáng)性藥溶液代替樣品溶液，其它條件不變，反應(yīng)結(jié)束后，在405 nm處測(cè)定吸光度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，在固定底物和酶濃度的情況下，改變阿卡波糖的濃度，阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有良好的量效關(guān)系，其抑制曲線良好，其IC50值為1.377 mg·mL-1(2.133×10-3mol·L-1)結(jié)果見(jiàn)圖2，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)體系符合此次篩選的需要。

2.6 測(cè)定蘋(píng)果屬植物葉片提取物及主要化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

按“2.3”項(xiàng)下方法對(duì)40份蘋(píng)果屬葉提取物和3種主要化合物進(jìn)行初步篩選，樣品初篩濃度為2 mg·mL-1。篩選結(jié)果如表1所示，根據(jù)樣品初步篩選的結(jié)果，對(duì)26份抑制率高于50%的提取物進(jìn)行了復(fù)篩(因砬山品種樣品份數(shù)較多，砬山1-6、1-7、1-9樣品未測(cè)定)。復(fù)篩時(shí)樣品稀釋成6個(gè)合適的濃度梯度，按照“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行篩選，通過(guò)Graphpad Prism 7軟件計(jì)算出各個(gè)樣品的IC50值。除紅花麗江山荊子(pgs-07)、垂瓣垂絲海棠(pgs-09)、窄葉海棠(pgs-06)葉片提取物溶液測(cè)定時(shí)不穩(wěn)定，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性不成量效關(guān)系，未測(cè)得IC50值外，其它23份樣品均獲得IC50值，結(jié)果見(jiàn)表1。

測(cè)定結(jié)果表明，蘋(píng)果屬植物葉提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶均具有一定的抑制作用，其中有26份提取物與根皮素和槲皮素2個(gè)化合物在2 mg·mL-1濃度時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性較好，抑制率均高于80%。在測(cè)得的23份有IC50值的樣品中，除6份樣品(黃盧氏湖北海棠pgs-39、楸子pgs-40、櫻葉海棠pgs-43、紅果三葉海棠pgs-41、隴東海棠pgs-44和砬山1-4 pgs-54)IC50值大于0.1 mg·mL-1外，其余17份樣品IC50值均小于0.1 mg·mL-1，明顯低于陽(yáng)性對(duì)照藥阿卡波糖的IC50值1.377 mg·mL-1和三個(gè)化合物的IC50值。表明所測(cè)樣品有一半以上具有較強(qiáng)的抑制α-葡萄糖苷酶活性。

表1 蘋(píng)果屬植物葉片提取物及其主要化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率和IC50值(n=3)

表1(續(xù))

注：-.在2 mg·mL-1時(shí)，抑制率低于50%，未測(cè)定IC50值；-*.未測(cè)得IC50值；本文主要參照1974《中國(guó)植物志》第36卷中對(duì)蘋(píng)果屬的分類系統(tǒng)[17]，同時(shí)結(jié)合李育農(nóng)[18]教授的分類處理(文中標(biāo)注#)。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)在經(jīng)典的α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定方法的基礎(chǔ)上，對(duì)實(shí)驗(yàn)具體條件和參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，可以快速評(píng)價(jià)蘋(píng)果屬植物葉片提取物和化合物的活性。通過(guò)對(duì)40份蘋(píng)果屬植物葉提取物和3種主要化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性研究，發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果屬不同種(品種)、不同產(chǎn)地來(lái)源的20種共40份蘋(píng)果葉提取物與3種主要化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性存在一定的差異，多數(shù)蘋(píng)果屬植物葉片顯示了較強(qiáng)的活性，為蘋(píng)果屬植物葉片資源進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。

從蘋(píng)果屬植物分類來(lái)看，真正蘋(píng)果組的蘋(píng)果系9份樣品多具有較高的抑制率和較低的IC50值；山荊子系10份樣品中的不同種海棠樣品也多具有較高的抑制率和較低的IC50值，而不同的山荊子種多具有較低的抑制率。花楸蘋(píng)果組測(cè)定的樣品數(shù)雖然相對(duì)較少，但隴東海棠系和三葉海棠系的5種樣品種有4份顯示較高的抑制率和較低的IC50值。11份栽培品種除個(gè)別活性不強(qiáng)外，大多具有較高的抑制率和較低的IC50值。北美引進(jìn)的兩個(gè)種抑制率較低。日本引進(jìn)的朱眉海棠(pgs-42)活性較強(qiáng)，其IC50值是所有樣品中最低的。但由于本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定樣本量較少，該屬植物葉對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的規(guī)律尚需進(jìn)一步比較研究。

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)樣品主要來(lái)源于遼寧興城和北京昌平兩個(gè)地方，采集時(shí)間均為秋天，前后相差約10 d，但從測(cè)定結(jié)果比較來(lái)看，相同種的樣品，來(lái)源于北京昌平的樣品活性相對(duì)較低，如新疆野蘋(píng)果(pgs-04)、湖北海棠(pgs-10)、垂絲海棠(pgs-09)、錫金海棠(pgs-11)和小金海棠(pgs-13)等，推測(cè)原因可能為，這段采集時(shí)間為葉片中成分快速變化的階段，因采集時(shí)間的不同而導(dǎo)致葉片中有效成分變化較大；或因兩個(gè)產(chǎn)地引進(jìn)原生種后，不同的小氣候與土壤等的因素，影響了葉片中有效成分變化，但確切的原因還需要進(jìn)一步的比較研究。

文獻(xiàn)報(bào)道根皮素、槲皮素和根皮苷等是蘋(píng)果屬植物葉中主要成分，其中根皮苷在蘋(píng)果屬葉片中普遍存在且含量較高，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明根皮素和槲皮素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性優(yōu)于阿卡波糖，但根皮苷的IC50值卻遠(yuǎn)高于它們，這個(gè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道根皮苷有較好的降糖活性不相符[9]，推測(cè)可能是因?yàn)楦ぼ辗肿又泻衅咸烟茄趸?，測(cè)定時(shí)，葡萄糖氧基斷裂消耗了α-葡萄糖苷酶，使得最后測(cè)得根皮苷的IC50值較大，這可以從根皮苷的苷元根皮素的IC50值較低得到解釋。這個(gè)現(xiàn)象同時(shí)也說(shuō)明了經(jīng)典的α-葡萄糖苷酶測(cè)定評(píng)價(jià)降糖活性方法的不足。因大多數(shù)蘋(píng)果屬植物葉提取物的IC50值低于3個(gè)化合物的IC50值，推測(cè)蘋(píng)果葉提取物中可能還含有其他抑制α-葡萄糖苷酶的具有協(xié)同作用的活性成分，值得進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)初步開(kāi)展了蘋(píng)果屬植物葉在降糖方面相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)和活性評(píng)價(jià)研究，由于采用的測(cè)定方法僅為降糖活性評(píng)價(jià)諸多方法中的一種，受到方法本身的限制，上述結(jié)果尚需更多的研究加以完善。

致謝：本文所用蘋(píng)果屬植物樣品在采集中得到中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所王昆研究員、李壯博士和北京農(nóng)學(xué)院秦曉曉博士的大力幫助，特此感謝！

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PreliminaryStudyonα-glucosidaseInhibitorfromMalusLeaves

SHENJie1，2，LIpei1，2，BIWu1，2，3，HEChunnian1，2*，XIAOPengen1，2

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalScience，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China； 2.KeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine，MinistryofEducation，Beijing100193，China； 3.KeyLaboratoryofCancerProteomicsofMinistryofHealthofChina，XiangyaHospital，CentralSouthUniversity，Changsha410008，China)

Objective：The aim of this study is to evaluate the α-glucosidase inhibition of extracts and main compounds inMalus’ leaves.Methods：The effect of extracts on α-glucosidase activity was investigated by enzymatic method in vitro.Forty extracts and three main compounds fromMalus’leaves were screened，and then compared with positive control(acarbose IC501.377 mg·mL-1).Results：The extracts and compounds fromMalus’leaves showed α-glucosidase inhibition obviously.The IC50of 23 categories extracts and 2 compounds(phloretin，quercetin)were lower than acarbose.Some extracts in the leaves ofMalushad remarkable inhibitory effect on α-glucosidase activity and almost had lower IC50compared to 3 compounds.Conclusion：Phloretin，quercetin and phlorizin are the basic composition for inhibiting α-glycosidase enzymes，and it also has potential research about synergistic components of extracts.Different extracts from dissimilar locations have distinctive activities of α-glycosidase inhibition；fortunately，most extracts have strong inhibiting activities.This experiment provides the scientific basis for the plant resources ofMalus’ leaves that can keep on to utilize and develop.

Malus；Malus’ leaves；α-glucosidase；inhibitory activity；resource utilization

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程經(jīng)費(fèi)資助(2016-I2M-1-012)

] 何春年，副研究員，研究方向：藥用植物親緣學(xué)研究；Tel：(010)57833165，E-mail：cnhe@ implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.013

2016-11-07)

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