宛玉祥，李家宇，秦優(yōu)，周卿意駿，蔡萍，張水寒*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410006；2.湖南中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410005)

·基礎(chǔ)研究·

液質(zhì)聯(lián)用鑒定單面針中的化學(xué)成分△

宛玉祥1，2，李家宇1，2，秦優(yōu)1，2，周卿意駿1，2，蔡萍2，張水寒2*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410006；2.湖南中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410005)

目的：利用LC-MS分析技術(shù)快速鑒定單面針中的生物堿結(jié)構(gòu)。方法：采用XAqua C8色譜柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫；體積流量：0.3 mL·min-1；ESI源正離子模式檢測(cè)；根據(jù)對(duì)照品的裂解規(guī)律和參考文獻(xiàn)推測(cè)生物堿的結(jié)構(gòu)。結(jié)果：從單面針的甲醇提取物中鑒定了20個(gè)化合物結(jié)構(gòu)。結(jié)論：LC-MS方法能快速、準(zhǔn)確地鑒定單面針中的化學(xué)成分，為單面針活性成分的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

單面針；生物堿

單面針ZanthoxylumdissitumHemsl.為蕓香科花椒屬植物蚌殼花椒，別名山枇杷、山椒根、黃椒根等[1]，主要分布于我國(guó)西南部、廣東、廣西等地，生長(zhǎng)于山地林中，有祛風(fēng)通絡(luò)、消腫止痛等作用，為民間常用的消腫止痛中藥。近代研究表明單面針主要活性成分是生物堿，目前發(fā)現(xiàn)的生物堿[2]主要為白鮮堿、茵芋堿、花椒堿、血根堿、兩面針堿。國(guó)內(nèi)外對(duì)花椒屬植物研究主要集中在兩面針，單面針作為其同屬植物的野生資源現(xiàn)代研究較少，但是單面針在民間長(zhǎng)期使用。因此，有必要對(duì)單面針中化學(xué)成分進(jìn)行研究。LC-MS技術(shù)由于其高分辨率、高靈敏度的分析特點(diǎn)，已廣泛運(yùn)用到中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、中藥化學(xué)成分分析等領(lǐng)域的研究。本研究采用LC-MS對(duì)單面針中的生物堿結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，為其化學(xué)成分的進(jìn)一步研究、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明和單面針的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1290 HPLC串聯(lián)6530 Q-TOF/MS(美國(guó)Agilent公司)；ML 204/02型精密天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

乙腈、甲酸、甲醇(色譜純，Merck)；水為Milli-Q超純水；去甲烏藥堿對(duì)照品(上海永恒科技有限公司,批號(hào)：H1-111859，純度：98%)；白鮮堿對(duì)照品(批號(hào)：110851-200504)、白屈菜紅堿對(duì)照品(批號(hào)：111718-200501)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，別隱品堿對(duì)照品(Sigma公司，批號(hào)：s450987，純度：98%)；s-reticuline對(duì)照品(TRC公司，批號(hào)：14-SDJ-121-1，純度：98%)；木蘭箭毒堿對(duì)照品(實(shí)驗(yàn)室自制，純度：98%)。

單面針采自國(guó)家中藥材生產(chǎn)(湖南)技術(shù)中心基地，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)楊廣民教授鑒定為單面針ZanthoxylumdissitumHemsl.。

2 方法

2.1 樣品的制備

取1.0 g單面針根部干燥粉末于150 mL錐形瓶中，加入50 mL甲醇超聲提取60 min，過(guò)濾，濾液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，待用。

2.2 色譜條件

Agilent 1290液相色譜儀，色譜柱：XAquaC8柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水，流動(dòng)相B為乙腈；洗脫條件：0～30 min，2%～45% B；30～50 min，45%～90% B；流速為0.3 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為272 nm；進(jìn)樣量為1 μL；柱溫為30 ℃。

2.3 質(zhì)譜條件

ESI離子源，采用正離子檢測(cè)模式，干燥器溫度300 ℃，干燥氣體積流量：8 L·min-1，霧化器壓力：3.8×106Pa，脫溶劑溫度350 ℃，脫溶劑氣體積流量：12 L·min-1，毛細(xì)管電壓：3500 V，錐孔電壓：100 V，掃描范圍m/z120～1200，二級(jí)裂解電壓15～35 eV。

3 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HPLC-Q-TOF/MS對(duì)單面針甲醇提取物進(jìn)行分析鑒定，總離子流圖見(jiàn)圖1，選擇80余個(gè)峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，最終推斷出20個(gè)生物堿結(jié)構(gòu)，其特征性二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖1 單面針甲醇提取物HPLC-Q-TOF/MS的總離子流圖

峰序t/min[M]+或[M+H]+(m/z)特征離子MS/MS(m/z)推斷化合物名稱15.550180.1381180,1212-(4-methoxyphenyl)-N,N-dimethylethanaminium25.942180.1025180,162,135,107朗吉碼胺36.618408.1216408,246,230,202苷帕林48.337596.2334596,434,272,255,1074'-glucosulfonyl-6,7-dihydroxy-benzyltetrahydroisoquinoline59.239434.1812434,272,255,1074'-glucosyl-6,7-dihydroxy-benzyltetrahydroisoquinoline611.701476.2272476,314,269,1074'-glucosyl-6-hydroxy-7-methoxyl-N,N-dimethyltetra-hydroisoquinoline714.380314.1748314,269,175,107Isoliensinine(異蓮心堿)815.700344.1859344,299,175,137tembetarine(N-甲基網(wǎng)葉番荔枝堿)916.142272.1283272,255,107去甲烏藥堿1016.384328.1912328,313,283,1074'-hydroxy-6,7-dimethoxyl-N,N-dimet-hyltetrahydroiso-quinoline1118.046342.1700342,297,265,237木蘭花堿1219.826314.1756314,269,192,107木蘭箭毒堿1321.437370.1648370,206,165,149別隱品堿1423.741348.1228348,332,302兩面針堿1524.276348.1239348,333,318,304,290Chelerythrinechloride(白屈菜紅堿)1630.105246.0765246,231,216,188去甲茵芋堿1731.466260.0915260,244,230,216茵芋堿1833.061230.0811230,215,200花椒堿1934.230200.0695200,185,157Dictamnine(白鮮堿)2035.265246.0765246,230,202擬蕓香品堿

3.1 芐基異喹啉類生物堿

芐基異喹啉類生物堿易失去NH3、CH3NH2或者(CH3)2NH，從而形成[M-17]+、[M-31]+或者[M-45]+的碎片峰，接著只有部分取代基從母核上丟失，形成m/z107、137、151的碎片峰，相應(yīng)的氮原子沒(méi)有丟失形成一個(gè)偶數(shù)的碎片峰。如對(duì)照品S-網(wǎng)脈番荔枝堿、去甲烏藥堿、木蘭箭毒堿的特征碎片離子峰符合這一裂解規(guī)律(對(duì)照品二級(jí)質(zhì)譜圖、裂解途徑見(jiàn)圖2)。據(jù)此推斷化合物4、5、6、7、8、9、10、12為芐基異喹啉類。

注：a.S-reticuline；b.去甲烏藥堿;c.木蘭箭毒堿。圖2 S-reticuline、去甲烏藥堿、木蘭箭毒堿質(zhì)譜裂解途徑

化合物4和5的特征碎片中失去一分子或兩分子葡萄糖后的特征碎片峰與去甲烏藥堿裂解相似，參考文獻(xiàn)[3]，推定化合物4為4′-glucosulfonyl-6,7-dihydroxybenzyltetrahydroisoquinoline，化合物5為4′-glucosyl-6,7-dihydroxybenzyltetrahydroisoquinoline?；衔?與對(duì)照品去甲烏藥堿二級(jí)碎片相同，推定為去甲烏藥堿。季銨型芐基異喹啉生物堿與對(duì)照品木蘭箭毒堿裂解相似，首先失去(CH3)2NH形成M-45的子離子，芐基斷裂產(chǎn)生m/z151、137、107的碎片峰，不同的碎片峰相應(yīng)的取代基不同。若相鄰的兩個(gè)甲氧基會(huì)失去CH4形成M-16的碎片峰，相鄰為甲氧基和羥基會(huì)失去CH3OH形成M-32的碎片峰，相鄰位置為兩個(gè)羥基一般不發(fā)生裂解。若化合物是生物堿苷會(huì)先失去葡萄糖形成相應(yīng)的苷元子離子特征峰，接著與對(duì)照品木蘭箭毒堿裂解相似。綜上所述，參考文獻(xiàn)[4-6]，推定化合物6為4′-glucosyl-6-hydroxy-7-methoxyl-N,N-dimethyltetrahydroisoquinoline，化合物7為異蓮心堿，化合物8為tembetarine，化合物10為4′-hydroxy-6,7-dimethoxyl-N,N-dimethyltetrahydroisoquinoline，化合物12為木蘭箭毒堿。

3.2 呋喃喹啉類生物堿

呋喃喹啉類生物堿母核較穩(wěn)定，主要是取代基發(fā)生斷裂形成M-CH3、M-CH3-CO的碎片離子。如對(duì)照品白鮮堿符合這一裂解規(guī)律(對(duì)照品二級(jí)質(zhì)譜圖、裂解途徑見(jiàn)圖3)，推斷化合物3、16、17、18、19、20為呋喃喹啉類生物堿。

化合物3接有葡萄糖基會(huì)形成[M-C6H10O5]+碎片離子，接著與該類化合物裂解相似。化合物存在甲氧基會(huì)形成[M-CH3]+繼而形成[M-CH3-CO]+的碎片離子，相鄰的甲氧基會(huì)形成M-16的碎片峰，相鄰的甲氧基和羥基會(huì)形成M-32的碎片峰。參考文獻(xiàn)[7-8]，推定化合物3為苷帕林，化合物16為去甲茵芋堿，化合物17為茵芋堿，化合物18為花椒堿，化合物19為白鮮堿，化合物20為擬蕓香品堿。

3.3 其他類型生物堿

化合物13和15與對(duì)照品別隱品堿和白屈菜紅堿保留時(shí)間和二級(jí)碎片峰相同，推定化合物13為別隱品堿，化合物15為白屈菜紅堿(對(duì)照品二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4)。參考文獻(xiàn)[9]，化合物1芐基斷裂失去(CH3)3N形成m/z121的碎片峰，推定為2-(4-methoxyphenyl)-N，N-dimethylethanaminium；化合物2發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生m/z137的碎片峰,接著失去醛基產(chǎn)生m/z107的碎片峰，推定為朗吉碼胺；化合物11、14為同屬植物兩面針中報(bào)道的結(jié)構(gòu)，推定化合物11為木蘭花堿，化合物14為兩面針堿。

圖3 白鮮堿質(zhì)譜裂解途徑

圖4 白屈菜紅堿和別隱品堿質(zhì)譜圖

4 結(jié)論

本文運(yùn)用LC-MS對(duì)單面針中化學(xué)成分進(jìn)行分析，通過(guò)對(duì)照品裂解規(guī)律和對(duì)比文獻(xiàn)推斷了20個(gè)生物堿結(jié)構(gòu)，其中有較多的生物堿在單面針中首次發(fā)現(xiàn)，對(duì)單面針中化學(xué)成分分離純化具有重要的指導(dǎo)作用。HPLC-Q-TOF/MS具有快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，對(duì)于天然產(chǎn)物復(fù)雜體系中活性成分的初步定性研究具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)單面針中存在很多微量生物堿，大多數(shù)生物堿與兩面針相似。運(yùn)用LC-MS對(duì)單面針中化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，對(duì)研究開(kāi)發(fā)以單面針為原料的產(chǎn)品具有重要意義。

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IdentificationofChemicalIngredientinZanthoxylumdissitumHemsl.byLC-MS

WANYuxiang1,2，LIJiayu1,2,QINYou1,2，ZHOUQingyijun1,2,CAIPing1,2,ZHANGShuihan2*

(1.HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410006,China;2.HunanAcademyofChineseMedicine,Changsha410005,China)

Objective：To rapidly identify alkaloids inZanthoxylumdissitumHemsl.using the LC-MS.Methods：The separation was performed on a XAqua C8column(150 mm×2.1 mm，5 μm)with acetonitrile-0.1% formic in water by gradient elution.The flow rate was 0.3 mL·min-1.Electrospray ionization-(ESI)source was applied and operated in positive ion mode.The structure of alkaloids was speculated by MS/MS fragmentation behaviors of standards and related references.Results：20 alkaloids were elucidated from the methanolic extracts ofZ.dissitum.Conclusion：It is a rapid and reliable method to identify the alkaloids inZ.dissitumby LC-MS.The result would provide scientific evidence for development and utilization and study of pharmacodynamic material basis in this plants.

ZanthoxylumdissitumHemsl.；alkaloids

湖南省科技廳項(xiàng)目(2016JJ4055)

] 張水寒，研究員，研究方向：中藥資源、制劑及質(zhì)量；E-mail：zhangshuihan0220@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.005

2016-09-08)

*[