劉凱娜，王曉云，潘贏，程雅婷，龐靜，王健，郭金穎

(河北省秦皇島市食品藥品檢驗中心，河北 秦皇島 066004)

·基礎(chǔ)研究·

全蝎質(zhì)量評價及標(biāo)準(zhǔn)提高研究△

劉凱娜*，王曉云，潘贏，程雅婷，龐靜，王健，郭金穎

(河北省秦皇島市食品藥品檢驗中心，河北 秦皇島 066004)

目的：建立全蝎的質(zhì)量控制方法用于質(zhì)量評價。方法：對全蝎水分、總灰分、酸不溶性灰分進(jìn)行檢查；考察不同浸出物溶劑對測定結(jié)果的影響；采用TLC法對全蝎中脂類成分進(jìn)行定性鑒別；采用HPLC法測定全蝎中特征氨基酸的含量。結(jié)果：擬定了水分、總灰分、酸不溶性灰分限量；浸出物測定以乙醇為溶劑更為科學(xué)；TLC色譜斑點清晰；甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸分別在0.509 1～5.091 0 μg(r=1.000 0)、0.502 5～5.025 0 μg(r=1.000 0)、0.348 2～3.482 0 μg(r=1.000 0)、0.508 8～5.088 0 μg(r=1.000 0)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為102.5%(RSD=2.7%，n=9)，104.1%(RSD=2.8%，n=9)，102.5%(RSD=2.2%，n=9)，102.3%(RSD=2.9%，n=9)。結(jié)論：本法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于全蝎的質(zhì)量控制。

全蝎；檢查項；浸出物；TLC；HPLC；質(zhì)量評價

全蝎為鉗蝎科動物東亞鉗蝎ButhusmartensiiKarsch的干燥體。性平，味辛，有熄風(fēng)止痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)的功能[1]143。市售品多為咸全蝎[2]?，F(xiàn)代研究表明蝎毒為全蝎的主要活性成分[3]。

全蝎現(xiàn)行法定檢驗標(biāo)準(zhǔn)為《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)2015年版一部，包括性狀、顯微鑒別、浸出物、黃曲霉毒素，鑒于當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)較簡單，不足以全面反映藥品質(zhì)量，為了系統(tǒng)地評價全蝎的質(zhì)量特性，本文考察了水分、總灰分、酸不溶性灰分等檢查項；考察了不同浸出物溶劑對測定結(jié)果的影響；建立了全蝎的TLC鑒別方法；建立了全蝎中特征氨基酸的HPLC含量測定方法，為全蝎質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)。

1 材料

島津LC-20A高效液相色譜儀，BHW-09恒溫電加熱器(成都廣普科學(xué)儀器有限公司)，TG16-WS臺式高速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，AG-135電子天平(METTLER TOLEDO，d=0.01 mg)，PHS-3C pH計(上海雷磁儀器廠)，HX113489硅膠G薄層板(MERCK，Silica gel 60)，DL-1028H超聲波清洗器(BANDELIN)。

全蝎對照藥材(批號：121044-200903)，對照品油酸(批號：111621-201205，純度：99.6%)、甘氨酸(批號：140689-201103，純度：100.0%)、精氨酸(批號：140685-201305，105 ℃干燥3 h，純度：100.0%)、L-脯氨酸(批號：140677-200405，含量測定用)、亮氨酸(批號：140687-201102，純度：100.0%)購于中國食品藥品檢定研究院，異硫氰酸苯酯(PITC)(西亞試劑，批號：201203014，含量為98%)，乙腈(MREDA，USA，色譜純)，水為超純水(Milli-Q)，其他試劑均為分析純。

124批全蝎樣品為河北省省級評價抽驗品種，覆蓋全國7個省市57家生產(chǎn)企業(yè)。經(jīng)秦皇島市食品藥品檢驗中心主任藥師邸立杰鑒定為鉗蝎科動物東亞鉗蝎ButhusmartensiiKarsch的干燥體。樣品信息見表1。

表1 全蝎樣品來源信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

取本品1 g，剪碎，加石油醚(60～90 ℃)20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取全蝎對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取油酸對照品，加石油醚(60～90 ℃)制成每1 mL含5 mg油酸的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部 通則0502)試驗，吸取供試品和對照藥材溶液各5 μL，對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙醚-冰醋酸(36∶9∶0.9)為展開劑，展缸預(yù)平衡20 min，展開，取出，晾干，置碘蒸氣中熏至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖1。124批全蝎樣品斑點清晰程度各不相同。

注：S1.油酸對照品；S2.全蝎對照藥材；1～10.樣品。圖1 全蝎TLC圖譜

2.2 水分

依法測定124批樣品(《中國藥典》2015年版四部 通則0832第二法)，結(jié)果在6%～50%。造成水分含量高低有別的可能原因為炮制過程中干燥的程度不同，包裝以及存儲環(huán)境導(dǎo)致樣品吸潮程度不同。根據(jù)測定結(jié)果，擬規(guī)定限度為不得過20.0%。

2.3 總灰分、酸不溶性灰分

依法測定124批樣品(《中國藥典》2015年版四部 通則2302)，總灰分最高為39%，酸不溶性灰分最高為3.5%，純凈度差別較大主要緣于含鹽、含土量不同，結(jié)合性狀分析可知，含鹽分高者，如混有鹽粒，總灰分會相對偏高。建議總灰分不得過20.0%，酸不溶性灰分不得過3.0%。

2.4 不同浸出物溶劑對測定結(jié)果的影響

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)浸出物所用溶劑稀乙醇(52.9%)能夠溶解全蝎中的鹽分，測得數(shù)據(jù)不夠科學(xué)，本實驗采用乙醇(95%)作溶劑，分別挑選高鹽分及低鹽分的樣品，測定其浸出物的含量，考察不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對浸出物測定結(jié)果的影響。表2結(jié)果表明，含鹽分較高的樣品采用乙醇為溶劑浸出物測定結(jié)果約降低60%，低鹽分樣品測定結(jié)果幾乎無變化?？梢娨砸掖紴榻鑫锶軇┠軌蛳}分的影響，且不影響有效成分的溶出。

2.5 特征氨基酸的含量測定

2.5.1色譜條件 色譜柱Wondasil C18-WR(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A為乙腈-0.1 mol·L-1醋酸鈉溶液(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.5)(7∶93)，流動相B為乙腈-水(4∶1)，梯度洗脫條件見表3；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為254 nm；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

表2 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對浸出物測定結(jié)果的影響

表3 梯度洗脫條件

2.5.2 對照品與供試品的制備

2.5.2.1 對照品溶液的制備 取甘氨酸對照品、精氨酸對照品、L-脯氨酸對照品、亮氨酸對照品適量，精密稱定，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液制成每1 mL各含100 μg的混合溶液，取上述溶液5 mL，置于25 mL量瓶中，加入0.1 mol·L-1異硫氰酸苯酯(PITC)的乙腈溶液2.5 mL，1 mol·L-1三乙胺的乙腈溶液2.5 mL，搖勻，室溫放置1 h后，加50%乙腈至刻度，搖勻。取10 mL，加正己烷10 mL，振搖，放置10 min，取下層溶液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.2.2供試品溶液的制備 取全蝎樣品細(xì)粉0.1 g，精密稱定，加6 mol·L-1鹽酸溶液5 mL，密封，150 ℃水解1 h，取出放冷至室溫，精密吸取水解液1 mL，蒸干，殘渣加0.1 mol·L-1鹽酸溶液溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液至刻度，搖勻，取上述溶液5 mL，按2.5.2.1項下方法自“置于25 mL量瓶中，加入0.1 mol·L-1異硫氰酸苯酯(PITC)的乙腈溶液2.5 mL”起操作，即得。

2.5.2.3 空白溶液的制備 取0.1 mol·L-1鹽酸溶液5 mL，按2.5.2.1項下方法自“置于25 mL量瓶中，加入0.1 mol·L-1異硫氰酸苯酯(PITC)的乙腈溶液2.5 mL”起操作，即得。

2.5.3 含量測定方法驗證

2.5.3.1 專屬性考察 取混合對照品溶液、供試品溶液、空白溶液按上述2.5.1色譜條件測定，空白無干擾，色譜峰分離度良好，理論塔板數(shù)均大于20 000，見圖2。

注：A.混合對照品；B.全蝎樣品；C.空白對照品；1.甘氨酸；2.精氨酸；3.L-脯氨酸；4.亮氨酸。圖2 全蝎樣品和對照品HPLC圖

2.5.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取混和對照品溶液1、2、4、8、10 μL，在2.5.1項的色譜條件下測定含量，記錄色譜峰面積，以峰面積(Y)對進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為Y甘氨酸=457 225X-6 152.76，r=1.000 0；Y精氨酸=189 815X-2 824.61，r=1.000 0；YL-脯氨酸=324 434X-2 692.74，r=1.000 0；Y亮氨酸=278 969X-3 374.43，r=1.000 0。結(jié)果顯示，甘氨酸在0.509 1～5.091 0 μg、精氨酸在0.502 5～5.025 0 μg、L-脯氨酸在0.348 2～3.482 0 μg、亮氨酸在0.508 8～5.088 0 μg線性關(guān)系良好。

2.5.3.3 精密度考察 取同一混合對照品溶液，按2.5.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸色譜峰的峰面積RSD分別為0.84%、0.76%、0.65%、0.73%，表明儀器精密度良好。

2.5.3.4 重復(fù)性考察 同一份樣品共取6份，按2.5.2.2項下方法平行制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜數(shù)據(jù)。結(jié)果甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸的含量RSD分別為0.78%、0.64%、0.69%、0.57%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.5.3.5穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，按2.5.1項下色譜條件分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積，甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸色譜峰的峰面積RSD分別為0.84%、0.96%、1.06%、0.75%，表明供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3.6 加樣回收率考察 稱取約50 mg已知含量的供試品細(xì)粉9份，平行分為3組，分別加入高、中、低3個濃度對照品的鹽酸溶液，再加鹽酸使成5 mL，按2.5.2.2項下操作，按2.5.1色譜條件進(jìn)行測定，計算加樣回收率。結(jié)果甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸的加樣回收率分別為102.5%、104.1%、102.5%、102.3%，RSD分別為2.7%、2.8%、2.2%、2.9%。

2.5.3.7 樣品測定 取不同批次的樣品0.1 g，精密稱定，按2.5.2.2項下方法制備供試品溶液，并按2.5.1項下色譜條件測定含量，按干燥品計算，結(jié)果甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸的含量范圍分別為2.47%～9.43%、2.06%～12.66%、1.37%～8.73%、2.42%～9.24%，4種氨基酸總和范圍為8.52%～35.95%，平均值為19.28%。建議規(guī)定含氨基酸以甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸的總量計不得少于15.0%。

3 討論

全蝎樣品為我中心省級評價品種，當(dāng)時執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《中國藥典》2010年版一部，包括性狀、顯微鑒別、浸出物3項，按法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗，不合格率為9%，全部為浸出物不合格。2015年版《中國藥典》針對咸全蝎易吸潮霉變的特點增加了黃曲霉毒素檢查項，但仍然控制不了全蝎的純凈度。綜觀全蝎質(zhì)量參差不齊，性狀差異較大，干濕程度不一，含鹽量相差懸殊，色澤也不一致，水分測定值高達(dá)50%，有的腹內(nèi)泥土較多，有的混有明顯的鹽粒，這些人為增重的方法均能影響藥物療效[4]，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對上述內(nèi)容均無控制指標(biāo)，尤其是缺少有效成分的專屬性檢測方法，需要不斷完善。故增加水分、總灰分、酸不溶性灰分檢查項是極其必要的。

上文提出浸出物所用溶劑不能消除鹽分的影響，不夠科學(xué)，為了進(jìn)一步證實這一點，我們運用SPSS軟件進(jìn)行總灰分與浸出物數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示顯著相關(guān)(P=0.000，r=0.858)?？梢娊鑫餃y定以一定的總灰分限度為前提，或者改變浸出物的溶劑，可以消除鹽分影響。

全蝎的活性成分蝎毒主要由非蛋白質(zhì)部分和蛋白質(zhì)部分組成，非蛋白質(zhì)部分主要包括一些以飽和脂肪酸為主的脂類成分，如油酸；毒性蛋白(蝎毒素)是由20～80個氨基酸殘基構(gòu)成的小分子蛋白質(zhì)[5]。故本文建立了以油酸為對照品、全蝎為對照藥材的TLC定性鑒別方法及特征氨基酸的HPLC含量測定方法。

全蝎中脂類成分的薄層色譜鑒別曾比較不同的薄層板和不同的溫濕度條件，均取得較好的分離效果，該方法參照鴉膽子中油酸的TLC鑒別制定[1]254-255。全蝎中特征氨基酸的含量測定選取蝎毒蛋白的水解產(chǎn)物——氨基酸為含量測定對象。甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸在全蝎中的含量較高，且不易被酸氧化破壞，故本實驗以這4種氨基酸為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定。提取方法、流動相的選擇、柱溫、檢測波長、流速等均參照文獻(xiàn)制訂[6-10]。

全蝎中脂類成分的TLC鑒別及特征氨基酸的含量測定方法能夠消除水、鹽的影響，二者結(jié)果趨近一致，且為有效成分的專屬性檢測，故更能真實地反映全蝎的質(zhì)量水平，可為現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。同時建議明確規(guī)定炮制方法中沸鹽水的濃度、煮制時間及干燥程度，各檢測項目有機(jī)結(jié)合，從整體上評價全蝎的質(zhì)量水平。

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StandardImprovementofScorpionandQualityEvaluation

LIUKaina*，WANGXiaoyun，PANYing，CHENGYating，PANGJing，WANGJian，GUOJinying

(QinhuangdaoInstituteforFoodandDrugControlofHebeiProvince，Qinhuangdao066004，China)

Objective：To establish the quality standard for scorpion used for quality evaluation.Methods：The contents of moisture，total ash and acid insoluble ash were determined.The effect of different extract solvents on the determination was investigated.Lipid components of scorpion were identified by TLC，the contents of characteristic amino acids were determined by HPLC.Results：The content of moisture，total ash and acid insoluble ash had been measured.The extract determination was more reasonable with ethanol as the solvent.The developed TLC spots were obvious.The method had good linear relationship within the range of 0.509 1-5.091 0 μg for glycine(r=1.000 0)，0.502 5-5.025 0 μg for arginine(r=1.000 0)，0.348 2-3.482 0 μg forL-proline(r=1.000 0)and 0.508 8-5.088 0 μg for leucine(r=1.000 0).The average recoveries were 102.5%，104.1%，102.5% and 102.3% with RSD of 2.7%，2.8%，2.2% and 2.9%(n=9)，respectively.Conclusion：The method is simple，accurate and specific，and can be used in the quality control of scorpion.

scorpion；check items；extract；TLC；HPLC；quality evaluation

河北省食品藥品監(jiān)督管理局科技計劃項目(ZC2015004)

] 劉凱娜,主管中藥師，研究方向：中藥材檢驗及質(zhì)量控制；E-mail:258252940@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.010

2016-05-24)

*[