王一諾，秦雙雙，黃寶優(yōu)，韋瑩，李翠，韋坤華

(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023))

·中藥農(nóng)業(yè)·

藥用植物短蕊萬壽竹的組織培養(yǎng)研究△

王一諾，秦雙雙，黃寶優(yōu)，韋瑩，李翠，韋坤華*

(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023))

目的：更好的開發(fā)利用短蕊萬壽竹。方法：以短蕊萬壽竹的幼嫩莖段為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，采用正交設(shè)計(jì)研究外源激素的種類和配比對(duì)誘導(dǎo)叢生芽和生根的影響。結(jié)果：最適的啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1，誘導(dǎo)叢生芽的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1，叢生芽的增殖系數(shù)達(dá)到6.88，最佳的生根培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1+AC 2.0 g·L-1，生根率達(dá)到96%以上。結(jié)論：建立短蕊萬壽竹的組織培養(yǎng)繁殖體系，為人工種植提供大量種苗。

短蕊萬壽竹；組織培養(yǎng)；叢生芽；生根培養(yǎng)

短蕊萬壽竹DisporumbrachystemonWang et Tang又名百味參、百尾筍，為百合科萬壽竹屬多年生草本，主要分布于云南、貴州、四川等地，生于海拔2800～3000 m的灌叢中或林下[1]。其葉色翠綠、葉形優(yōu)美、四季常綠，可用于林下種植或盆栽室內(nèi)觀賞，是具有較高開發(fā)前景的野生花卉。根、莖可入藥，其味甘，微苦，性涼，具有養(yǎng)陰潤肺、止咳、止血的功效，外用可治療骨折和燒傷[2]。隨著觀賞植物的發(fā)展和對(duì)藥用植物的利用，人們對(duì)其需求量日益的增大。但常規(guī)情況下，短蕊萬壽竹的繁育特性主要靠扦插和播種繁殖，由于種皮比較硬，播種發(fā)芽率比較低，且扦插繁殖倍數(shù)低在短期內(nèi)難以得到有效的苗數(shù)，不能滿足生產(chǎn)上大量的種苗需求[3-4]。鑒于短蕊萬壽竹較高的藥用和觀賞價(jià)值，采用組織培養(yǎng)技術(shù)建立無性快速繁殖體系，對(duì)野生短蕊萬壽竹種質(zhì)資源的保護(hù)和優(yōu)質(zhì)種苗的規(guī)模化栽培提供一定的參考依據(jù)，滿足生產(chǎn)上的需要。而有關(guān)于短蕊萬壽竹的組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)尚未見有相關(guān)的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

供試用的短蕊萬壽竹當(dāng)年生的幼嫩莖條采自廣西藥用植物園科研基地內(nèi)健壯無病蟲害的植株。

1.2 外植體消毒

取短蕊萬壽竹當(dāng)年生的幼嫩枝條為外植體，依次用2%(v/v)洗潔精水溶液浸泡5 min，用線狀流水沖洗15 min，然后置于超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%的乙醇消毒15 S，無菌水沖洗1次，添加了2～3滴吐溫-20的100 mL 0.1%(v/v)HgCl2消毒8～12 min，用無菌水沖洗3次，將帶芽莖段剪成1～2 cm的小段，接種至啟動(dòng)培養(yǎng)基中。

1.3 初代誘導(dǎo)培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，附加植物生長調(diào)節(jié)素6-BA(0.5～1.5 mg·L-1)、NAA(0.1～0.5 mg·L-1)、IBA(0.1～0.5 mg·L-1)不同濃度組合的MS+蔗糖30 g·L-1+瓊脂5.0 g·L-1和pH值為5.8的培養(yǎng)基中進(jìn)行啟動(dòng)培養(yǎng)，每個(gè)處理10瓶，每瓶5個(gè)外植體，培養(yǎng)條件為平均照度2 000 lx，光照時(shí)間12 h·d-1，溫度25±3 ℃，并于30 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)的芽數(shù)。

1.4 叢生芽的增殖培養(yǎng)

挑取初代培養(yǎng)的無菌苗單切為2 cm左右的帶芽莖段，接種至以MS為基本培養(yǎng)基，附加植物生長調(diào)節(jié)素6-BA(1.0、1.5、2.0 mg·L-1)、NAA(0.1、0.2、0.5 mg·L-1)、KT(0.2、0.5、1.0 mg·L-1)的MS+蔗糖30 g·L-1+瓊脂5.0 g·L-1和pH值為5.8的增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)，采用正交設(shè)計(jì)對(duì)各因素進(jìn)行L9(34)試驗(yàn)篩選，并于40 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。同時(shí)觀察生長情況并用5級(jí)表示：將所有叢生芽生長狀況按大小分成5級(jí)，分別記為：“+++++”“++++”“+++”“++”“+”。

1.5 生根培養(yǎng)

本試驗(yàn)采用附加不同激素的生根培養(yǎng)基，對(duì)短蕊萬壽竹的最佳生根培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選。挑取長勢(shì)良好的無菌苗單切為3 cm左右的莖段，接種于以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度配比的6-BA、NAA、AC的MS+蔗糖30 g·L-1+瓊脂5.0 g·L-1的生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40 d后觀察并記錄生根情況。同時(shí)觀察生長情況并用5級(jí)表示：將所有生根苗生長狀況按大小分成5級(jí)，分別記為：“+++++”“++++”“+++”“++”“+”。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)啟動(dòng)培養(yǎng)的影響

在啟動(dòng)培養(yǎng)基中接入短蕊萬壽竹的帶芽莖段后，觀察并記錄接入外植體的情況。試驗(yàn)結(jié)果表明(表1)，植物生長調(diào)節(jié)素的種類和不同配比對(duì)芽的誘導(dǎo)具有明顯的差異，帶芽莖段在處理號(hào)1～9啟動(dòng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～7 d后，均有腋芽開始出現(xiàn)萌動(dòng)，10 d后在葉腋處萌生出小芽，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，抽生的新芽逐漸明顯，15 d后在A5的啟動(dòng)培養(yǎng)基中最先長出綠色的小葉。從數(shù)據(jù)可以看出，MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1的激素配比組合時(shí)對(duì)芽的誘導(dǎo)效果最好，培養(yǎng)30 d后芽的誘導(dǎo)率達(dá)到82%，明顯的優(yōu)于其它激素配比的組合。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)短蕊萬壽竹啟動(dòng)培養(yǎng)的影響

2.2 植物生長調(diào)節(jié)素對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響

表2 短蕊萬壽竹叢生芽誘導(dǎo)正交試驗(yàn)L9(34)結(jié)果

表3 叢生芽培養(yǎng)基方差分析結(jié)果

將無菌的試管苗剪切成1.0 cm左右?guī)Ч?jié)莖段，接種至附加不同濃度的植物生長調(diào)劑素的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，比較多因素的組合對(duì)短蕊萬壽竹叢生芽誘導(dǎo)的影響，篩選出最佳的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)6-BA的濃度為1.5 mg·L-1、NAA的濃度為0.2 mg·L-1、KT的濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，增殖的倍數(shù)高達(dá)6.88。對(duì)叢生芽增殖系數(shù)影響最大的是6-BA的濃度，極差R值為2.17，依次為KT的濃度、NAA的濃度。方差的分析結(jié)果表明，影響增殖系數(shù)的因素中6-BA的濃度、KT的濃度在不同水平之間差異顯著(P<0.05)。6-BA的濃度在1.0～1.5 mg·L-1的范圍時(shí)，增殖倍數(shù)隨著質(zhì)量濃度的增加而變大，6-BA的濃度為1.5 mg·L-1時(shí)增殖系數(shù)高達(dá)5.63，與濃度為1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1處理之間差異顯著，且生長情況良好，植株健壯，葉色濃綠。NAA的濃度在不同水平之間差異不顯著，NAA增殖系數(shù)的范圍4.26～4.96，當(dāng)濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)最高為4.96。KT的濃度在各個(gè)水平之間處理差異顯著，濃度在0.2～1.0 mg·L-1范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，增殖系數(shù)也隨著增加，當(dāng)KT的濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)高達(dá)5.56。綜合考慮，短蕊萬壽竹叢生芽最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1，誘導(dǎo)出來的叢生芽生長狀況良好，苗茁壯，增殖倍數(shù)大，得到的有效苗數(shù)多。

圖1 短蕊萬壽竹的叢生芽誘導(dǎo)

2.3 生根培養(yǎng)

將短蕊萬壽竹的叢生芽切成單芽接種至添加不同植物生長調(diào)節(jié)素的生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)生根率，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步篩選出最佳的生根培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果表明(表4)，在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后可觀察到有白色的根狀物突起，15 d后可以在培養(yǎng)基上觀察到白色的細(xì)根。在MS的基本培養(yǎng)基上附加6-BA、NAA不同種類的植物生長激素，激素的種類和濃度的配比對(duì)短蕊萬壽竹的生根率具有明顯的影響。NAA對(duì)短蕊萬壽竹的生根具有促進(jìn)的作用，當(dāng)NAA的濃度在0.5～2.0 mg·L-1范圍內(nèi)，平均生根數(shù)和生根率隨著NAA的濃度增加而升高?；钚蕴?AC)對(duì)短蕊萬壽竹的生根有較好的效果，在不添加活性炭(AC)的情況下，生根數(shù)比較少且根比較細(xì)弱。在生根培養(yǎng)基中添加活性炭，生根率隨著增加，且根系主次分明，長而粗壯，每株苗的生根數(shù)都有4～5根，利于后期的移栽。綜上所述，初步篩選出來短蕊萬壽竹適宜的生根培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1+AC 2.0 g·L-1，生根較好，植株長勢(shì)健壯，葉色濃綠，生根率達(dá)到96%。

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)短蕊萬壽竹生根的影響

2.4 再生苗的移栽

挑取經(jīng)過壯苗生根后植株健壯、根系發(fā)達(dá)的組培苗移至溫室內(nèi)，打開瓶蓋并保持瓶內(nèi)水分充足，使其更好的適應(yīng)外界的環(huán)境。3 d后取出試管苗，用清水緩慢的清洗干凈根部的培養(yǎng)基，于傍晚移栽至栽培基質(zhì)中(沙土∶有機(jī)肥=3∶1)，澆透水定根。保持棚內(nèi)濕度85%左右，培養(yǎng)溫度20～30 ℃，同時(shí)適度遮蔭，15 d左右長出新根，葉片慢慢開始舒展，成活的小苗即可進(jìn)行日常的栽培管理，2個(gè)月后成活率達(dá)到98%。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)利用短蕊萬壽竹的帶芽莖段為實(shí)驗(yàn)材料，在MS基本培養(yǎng)基中附加不同種類和配比的植物生長激素，篩選出短蕊萬壽竹適宜的啟動(dòng)、叢生芽增殖、生根培養(yǎng)基。植物的組培苗在生長發(fā)育的過程中，適宜的激素有利于促進(jìn)組培苗的生長、分化和快速繁殖[5]。在培養(yǎng)基中加入適宜的6-BA、NAA、IBA，對(duì)短蕊萬壽竹芽的誘導(dǎo)具有明顯的促進(jìn)作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1的激素配比組合時(shí)對(duì)芽的誘導(dǎo)效果最好，培養(yǎng)30 d后芽的誘導(dǎo)率達(dá)到82%。芽苗的增殖和分化是組織培養(yǎng)過程中快速繁殖的關(guān)鍵因素，而增殖的系數(shù)在很大的程度上受到細(xì)胞分裂素的影響[6]，在試驗(yàn)中對(duì)叢生芽增殖系數(shù)影響最大的是6-BA的濃度，在不同水平之間差異顯著(P<0.05)，當(dāng)6-BA的濃度為1.5 mg·L-1時(shí)增殖系數(shù)高達(dá)5.63。在叢生芽的誘導(dǎo)過程中，6-BA、NAA、KT多激素的聯(lián)合使用對(duì)芽的增殖起到了較好的效果。短蕊萬壽竹在MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1培養(yǎng)基中，叢生芽的誘導(dǎo)效果最好，芽苗生長狀況良好，植株健壯，增殖倍數(shù)大，得到的有效苗數(shù)多。NAA能促進(jìn)細(xì)胞的分裂和誘導(dǎo)不定根的形成[7]，對(duì)短蕊萬壽竹的生根起到重要的作用，平均生根數(shù)和生根率隨著NAA的濃度增加而升高。在生根培養(yǎng)基中添加活性炭(AC)可促進(jìn)根的生長，在MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA2.0 mg·L-1+AC2.0 g·L-1的生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)出來的種苗植株健壯，主根系長而粗壯，利于后期試管苗的移栽。

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志[M].北京：北京科學(xué)出版社，2007.

[2] 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì).中華本草[M].上海：上海科學(xué)出版社，1999，8：7162.

[3] 蔣天儀，石大興，王波.長蕊萬壽竹野生資源開發(fā)利用的組織培養(yǎng)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(31)：13549.

[4] 張雁萍.民族藥用植物百尾參野生種子(母代)與不同齡種子(子代)育苗比較[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23(3)：132-135.

[5] 魏麗芳，于桂芬，馮國寶.鐵皮石斛組織培養(yǎng)與快速繁殖研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(35)：13561-13563.

[6] 張明，夏鴻西.石斛組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2000，25(6)：323-326.

[7] 邱運(yùn)亮，段鵬慧，趙華.植物組培快繁技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：68-69.

StudyonTissueCultureofDisporumbrachystemonWangetTang

WANGYinuo，QINShuangshuang，HuangBaoyou，WEIYing，LICui，WEIKunhua*

(GuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlants，GuangxiKeyLaboratoryofMedicinalResourcesProtectionandGeneticImprovement，Nanning530023，China)

Objective：The aim of the research was to develop and utilizeDisporumbrachystemonWang et Tang better.Methods: To investigate the effects of different hormone combinations on cluster bud induction and root culture ofDisporumbrachystemonWang et Tang. By orthogonal design, stem was used as the explants and the MS was used as the basic culture medium.Results: The results indicated that the best initial medium was MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1. The most effective medium for cluster bud induction was MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1，and the multiplication coefficient of cluster bud reached 6.88. The best rooting medium was MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1+AC 2.0 g·L-1, and rooting ratio was above 96%.Conclusion: The tissue culture and propagation system was astablished and solve the shortage of large-scale planting.

DisporumbrachystemonWang et Tang；tissue culture；cluster bud induction；rooting culture

國家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(201507002)，國家自然科學(xué)基金(81473309)，廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科合14125008-2-21，桂科重14124002-6，桂科重14124002-1)，廣西博士后專項(xiàng)資金(2015年)

] 韋坤華，副研究員，研究方向：藥用植物組織培養(yǎng)；E-mail：divinekh@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.016

2016-07-22)

*[