孫祥威，胡盈盈，徐劍峰，張良，毛晨晨，郭剛強(qiáng)，黃關(guān)立，沈賢，薛向陽

長鏈非編碼RNA AL049452在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義

孫祥威1，胡盈盈2，徐劍峰1，張良1，毛晨晨1，郭剛強(qiáng)3，黃關(guān)立4，沈賢5，薛向陽3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027；3.溫州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，浙江 溫州 325035；4.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤科，浙江 溫州 325015；5.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325027）

目的：探索長鏈非編碼RNA（lncRNA）AL049452在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法：收集84例手術(shù)切除的結(jié)直腸癌及相應(yīng)的癌旁正常組織，qRT-PCR檢測lncRNA-AL049452的表達(dá)水平，用Mann-Whitney U檢驗分析lncRNA-AL049452表達(dá)水平和結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系，同時分析其對結(jié)直腸癌患者的總生存時間及無病生存時間的影響。繪制ROC曲線評價lncRNA-AL049452診斷結(jié)直腸癌的效能。結(jié)果：結(jié)直腸癌患者腫瘤組織lncRNA-AL049452的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織（P=0.0035），腫瘤更大的結(jié)直腸癌患者其lncRNA-AL049452的表達(dá)量更高（P=0.024）。生存曲線分析顯示，高表達(dá)lncRNA-AL049452的結(jié)直腸癌患者的無病生存時間較低表達(dá)組更短（log-rank=4.208，P=0.034）。ROC曲線分析顯示，lncRNAAL049452診斷結(jié)直腸癌的曲線下面積為0.723（95%CI=0.613～0.832，P＜0.001），敏感性和特異性分別為86.0%和51.2%。結(jié)論：腫瘤組織中高表達(dá)的lncRNA-AL049452可能參與了結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，是結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后判斷的新生物標(biāo)記物。

長鏈非編碼RNA；AL049452；結(jié)直腸腫瘤；生物學(xué)標(biāo)記

結(jié)直腸癌是全球發(fā)病率第三的惡性腫瘤，全球每年超過693 900例患者死于結(jié)直腸癌[1]。發(fā)病率位于中國惡性腫瘤第四位，并逐年上升，嚴(yán)重威脅公眾生命健康[2]。隨著基因組學(xué)的進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與原癌基因和抑癌基因的改變密切相關(guān)[3]。人類基因組中有98%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不編碼蛋白質(zhì)，即非編碼RNA，其中長度大于200 nt的轉(zhuǎn)錄本被稱為長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）[4]。研究表明lncRNA通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控影響靶基因的表達(dá)，從而參與糖尿病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[5-6]。AL049452是G蛋白偶聯(lián)受體180基因（G protein

coupled receptor 180，GPR180）3’端長約577 bp的轉(zhuǎn)錄本，并不編碼任何蛋白質(zhì)，是新的lncRNA。GPR180是近年來新發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員[7]，參與血管重建并與腫瘤預(yù)后相關(guān)[8-9]， 但lncRNA-AL049452在腫瘤中的表達(dá)及效應(yīng)迄今尚未闡明。本研究旨在探索lncRNA-AL049452在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 組織標(biāo)本來源于2004年2月至2006年12月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)并經(jīng)病理確認(rèn)的84例結(jié)直腸癌患者。其中男46例，女38例；年齡為37～81歲，中位年齡65歲。所有患者的腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯等均由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科確認(rèn)，其中腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、Duke分期根據(jù)2012美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）結(jié)直腸癌臨床實踐指南劃分。切取結(jié)直腸癌組織及癌旁正常黏膜組織（距離腫瘤＞10 cm），保存于液氮中。術(shù)后前2年每3個月隨訪1次，術(shù)后第3年以后每半年隨訪1次?？偵鏁r間和無病生存時間均從術(shù)后第1天開始計算，總生存時間統(tǒng)計至患者死亡，無病生存時間統(tǒng)計至患者腫瘤復(fù)發(fā)或至死亡。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器：Trizol購自美國Invitrogen公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit、SYBR?Green Realtime PCR Master Mix購自日本TOYOBO公司；realtime-PCR采用Step One PlusTM實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）系統(tǒng)；lncRNA-AL049452及GAPDH的引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

表1 LncRNA-AL049452及GAPDH的qRT-PCR引物

1.2.2 生物信息學(xué)：GSE37364表達(dá)譜芯片信息來自NCBI GEO數(shù)據(jù)庫。該芯片含有38例結(jié)直腸正常組織，29例結(jié)直腸腺瘤，27例結(jié)直腸癌的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。編輯R語言代碼從中提取AL049452的表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄：切取30 mg的冰凍組織進(jìn)行研磨，按照說明書用Trizol提取RNA，并用紫外分光光度計（NanoDrop ND-1000）檢測RNA的純度及濃度。取1 μg RNA，按照ReverTra Ace qPCR RT Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA在-20 ℃保存。

1.2.4 qRT-PCR：按照20 μL qRT-PCR體系：將1 μL cDNA，上下游引物各1 μL，10 μL SYBR Mix，7 μL DEPC水依次加入八連管并混勻，按3 000 r/min離心1 min。采用Step One PlusTMqRT-PCR系統(tǒng)，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 32 s、72 ℃ 32 s循環(huán)40次。設(shè)置3個復(fù)孔，lncRNAAL049452及GAPDH的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行校正，并按照結(jié)直腸癌組織/癌旁正常組織處理成2-△△CT的形式。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。lncRNA-AL049452的表達(dá)量以M（P25，P75）表示。結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤及癌旁正常組織lncRNA-AL049452表達(dá)量的比較以及不同臨床病理學(xué)特征lncRNA-AL049452表達(dá)量的比較采用Mann-Whitney U檢驗。采用ROC曲線分析lncRNAAL049452診斷結(jié)直腸癌的敏感性和特異性。生存曲線采用Kaplan-Meier分析，采用log-rank test進(jìn)行統(tǒng)計檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 lncRNA-AL049452及GAPDH的qRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 LncRNA-AL049452在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況 GSE37364表達(dá)譜芯片分析顯示，lncRNA-AL049452 在癌旁正常組織[99.85（85.03，113.15）]、結(jié)直腸腺瘤[133.01（98.55，183.55）]及結(jié)直腸癌[204.45（167.12，284.35）]中的表達(dá)量逐漸升高（P＜0.001），見圖2。qRT-PCR結(jié)果顯示lncRNA-AL049452在腫瘤組織中的表達(dá)量[2.50（1.13，7.35）]明顯高于癌旁正常組織（P=0.0035）。

2.2 LncRNA-AL049452診斷結(jié)直腸癌的價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示lncRNA-AL049452診斷結(jié)直腸癌的曲線下面積（area underthe curve，AUC）為0.723（95%CI=0.613～0.832，P＜0.001），診斷結(jié)直腸癌的敏感性和特異性分別為86.0%和51.2%，約登指數(shù)為0.372，有較高的診斷價值（見圖3）。

2.3 LncRNA-AL049452表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 如表2所示，lncRNA-AL049452 的過表達(dá)與結(jié)直腸癌的大小有關(guān)（P=0.024），而lncRNA-AL049452的表達(dá)量與患者的性別、年齡、腫瘤分化、浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、Duke分期、脈管侵犯及血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平無關(guān)（P＞0.05）。

圖2 LncRNA-AL049452在結(jié)直腸癌表達(dá)譜芯片GSE37364中的表達(dá)情況

圖3 LncRNA-AL049452診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線

2.4 LncRNA-AL049452表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系 以結(jié)直腸癌患者lncRNA-AL049452表達(dá)量的平均值為界，將結(jié)直腸癌患者劃分為lncRNAAL049452高表達(dá)組（38例）和低表達(dá)組（46例）進(jìn)行生存分析。結(jié)果顯示lncRNA-AL049452不同表達(dá)組結(jié)直腸癌患者總生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（logrank=0.099，P=0.753），但是lncRNA-AL049452低表達(dá)組的中位無病生存時間（disease-free survival， DFS）為43個月，明顯高于lncRNA-AL049452高表達(dá)組的30個月（log-rank=4.208，P=0.034），見圖4。

3 討論

lncRNA是長度大于200 nt的非編碼RNA，缺乏開放閱讀框，不編碼任何蛋白[10]。按lncRNA在基因組的位置，分為正義lncRNA、反義lncRNA、雙向 lncRNA、基因內(nèi)lncRNA及基因間lncRNA[11]。lncRNA 起初被認(rèn)為是“基因組噪音”，而后研究證實lncRNA通過表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與各種疾病的發(fā)生發(fā)展[12]。

表2 LncRNA-AL049452表達(dá)水平和結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系[M（P25，P75）]

圖4 不同lncRNA-AL049452表達(dá)水平結(jié)直腸癌患者的生存曲線分析

遺傳物質(zhì)改變是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，原癌基因的激活及抑癌基因的失活都會最終促成腫瘤的發(fā)生[13]。研究證明，lncRNA與結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。如lncRNA-CCAT2在結(jié)直腸癌中過表達(dá)，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[14]，lncRNA loc285194作為p53的靶基因，可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[15]。同時lncRNA可以作為結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后的潛在指標(biāo)[16]。AL049452作為一個新的 lncRNA，位于GPR180的3’端；而GPR家族能夠調(diào)節(jié)腫瘤的血管重建，GRP180對腫瘤的發(fā)展有抑制作用。為分析lncRNA-AL049452在結(jié)直腸癌的表達(dá)，我們首先分析GEO數(shù)據(jù)庫中l(wèi)ncRNA-AL049452的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA-AL049452在結(jié)直腸正常組織向腺瘤及癌的演進(jìn)過程中表達(dá)量逐漸上升。進(jìn)一步qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，lncRNA

AL049452在結(jié)直腸癌中表達(dá)明顯上調(diào)。已發(fā)現(xiàn)一些lncRNA可以作為結(jié)直腸癌診斷的潛在生物學(xué)指標(biāo)，如HOTAIRM1作為腫瘤抑制因子對結(jié)直腸癌具有和CEA類似的診斷價值，其診斷效能優(yōu)于CA19-9和CA125[17]。循環(huán)中的lncRNA-BCAR4、lncRNA-MAGEA、lncRNA-KRTP5可以聯(lián)合作為結(jié)直腸癌診斷的良好指標(biāo)，其AUC可達(dá)0.857[18]。我們應(yīng)用ROC曲線分析lncRNA-AL049452表達(dá)量對結(jié)直腸癌早期診斷的價值，發(fā)現(xiàn)AUC為0.723，敏感性和特異性分別為86.0% 和51.2%，約登指數(shù)為0.372，有較高的診斷價值。

研究證實lncRNA與結(jié)直腸癌的臨床特征及預(yù)后密切相關(guān)，如lncRNA-GAPLINC在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，并與腫瘤大小、T分級、N分級有關(guān)，是結(jié)直腸癌不良預(yù)后的獨立危險因素[19]；過表達(dá)lncRNA-H19的結(jié)直腸癌患者，其腫瘤的分化程度更低，TNM分期更晚，總生存時間和無病生存時間更短[20]。臨床病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織的AL049452表達(dá)量與結(jié)直腸癌的腫瘤大小有關(guān)。生存分析發(fā)現(xiàn)lncRNAAL049452低表達(dá)的結(jié)直腸癌患者，其無病生存時間長于高表達(dá)lncRNA-AL049452的患者。以上結(jié)果提示結(jié)直腸癌惡性程度越高，其lncRNA-AL049452表達(dá)量越高，同時患者的預(yù)后情況也越差，因此AL049452 在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

綜上所述，lncRNA-AL049452在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)與腫瘤大小有關(guān)，而且對于結(jié)直腸癌的診斷及預(yù)后判斷均有提示作用。深入研究lncRNAAL049452參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，對于結(jié)直腸癌的早期診斷、完善治療、改善預(yù)后均有一定價值。

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（本文編輯：賈建敏）

Expression of lncRNA-AL049452 in the tissue of colorectal cancer and its clinical significance

SUN Xiangwei1, HU Yingying2, XU Jianfeng1, ZHANG Liang1, MAO Chenchen1, GUO Gangqiang3, HUANG Guanli4, SHEN Xian5, XUE Xiangyang3.
1.Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 3.Department of Microbiology and Immunology, School of Basic Medical Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 4.Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 5.Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To explore the expression and clinical significance of lncRNA-AL049452 in colorectal cancer (CRC). Mothods: Eighty-four cases of CRC tissues and corresponding paracancerous tissues were collected. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression level of lncRNA-AL049452 in these tissue specimens. Correlation between the expression of lncRNA-AL049452 and clinicopathological features was analysed by Mann-Whitney U test. Kaplan-Meier survival curves was used to analysed overall survival time and disease-free survival time between different lncRNA-AL049452 levels. Receiver operating characteristic (ROC) curve was performed to observe the diagnostic value of lncRNA-AL049452 for colorectal cancer. Results: lncRNA-AL049452 expression level in CRC tissues was obviously higher than that in corresponding paracancerous tissues (P=0.0035). High expression of lncRNA-AL049452 indicated larger tumor size (P=0.024). The lncRNA-AL049452 high-expression group presented significantly lower disease-free survival rates than the low-expression group (log-rank=4.208, P=0.034). In addition, ROC curves analyse showed that the AUC of ROC curve was 0.723 (95%CI=0.613-0.832, P＜0.001) with 86.0% sensitivity, 51.2% specificity. Conclusion: The highexpression of lncRNA-AL049452 in tumor tissues may play an important role in the progression in CRC, and can serve as novel biomarker for the diagnosis and prognosis of CRC.

long non-coding RNA; AL049452; colorectal neoplasms; biological markers

R735.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.08.004

2016-07-31

國家自然科學(xué)基金資助項目（81472308，31470891）；溫州市科技計劃項目（20150050）。

孫祥威（1992-），男，浙江溫州人，碩士生。

薛向陽，副教授，Email：wzxxy001@163.com。