林慧玥，錢凱，白家秀，張道根，魯瑞，萬新龍

斜紋夜蛾嗅覺反應(yīng)晝夜節(jié)律及其調(diào)控機(jī)制

林慧玥，錢凱，白家秀，張道根，魯瑞，萬新龍

（溫州醫(yī)科大學(xué) 健康與環(huán)境生態(tài)研究所，浙江 溫州 325035）

目的：研究斜紋夜蛾嗅覺反應(yīng)的晝夜節(jié)律和調(diào)控機(jī)制，為更有效的防治提供新的思路和方法。方法：通過測(cè)定多種寄主植物氣味化合物和性信息素在晝夜8個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)下的斜紋夜蛾觸角電位（EAG）反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾的EAG反應(yīng)晝夜節(jié)律并篩選出斜紋夜蛾EAG反應(yīng)最為強(qiáng)烈的化合物，進(jìn)一步通過風(fēng)洞技術(shù)測(cè)定黑暗期5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)斜紋夜蛾對(duì)這些化合物的行為反應(yīng)，驗(yàn)證其行為晝夜節(jié)律；同時(shí)通過RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)多個(gè)調(diào)控晝夜節(jié)律的時(shí)鐘基因和嗅覺受體基因在晝夜各個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平差異。結(jié)果：斜紋夜蛾雄蟲對(duì)所有測(cè)試植物氣味化合物和性信息素的EAG反應(yīng)都表現(xiàn)出雙峰模式，即都在黑暗之后3 h和9 h的反應(yīng)最為強(qiáng)烈，并篩選出斜紋夜蛾最為敏感的5種化合物：Z9E12-14:OAc、Z9E11-14:OAc、石竹烯、芳樟醇和苯乙醛。斜紋夜蛾在黑暗期5個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)這5種化合物行為反應(yīng)也表現(xiàn)出與EAG反應(yīng)相類似的夜間節(jié)律。從 基因表達(dá)水平來看，大部分嗅覺受體基因和時(shí)鐘基因都在黑暗之后3 h和（或）9 h表達(dá)水平達(dá)到最高峰值。結(jié)論：斜紋夜蛾的嗅覺反應(yīng)晝夜節(jié)律與嗅覺基因和時(shí)鐘基因表達(dá)的晝夜節(jié)律大體上是一致的，表明斜紋夜蛾的嗅覺反應(yīng)節(jié)律可能都是由這些時(shí)鐘基因和嗅覺基因在其體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)調(diào)控的。

斜紋夜蛾；晝夜節(jié)律；觸角電位；風(fēng)洞；RT-qPCR

昆蟲經(jīng)過長期的演化，它們的許多生命活動(dòng)和行為形成了晝夜節(jié)律性。昆蟲的許多行為如取食、交配以及尋找棲息地等都是依靠嗅覺來完成的。因此，昆蟲的嗅覺反應(yīng)也一定具有節(jié)律性的。目前對(duì)昆蟲嗅覺反應(yīng)晝夜節(jié)律及其分子機(jī)制的研究報(bào)道較少。對(duì)隱花色素基因的研究表明，其在生物體內(nèi)具有很高的同源性[1]，通過分子系統(tǒng)進(jìn)化分析可以探索出各個(gè)物種間的親緣關(guān)系，因而該基因成為分子進(jìn)化的又一個(gè)研究熱點(diǎn)。由于昆蟲生理活動(dòng)與生物鐘現(xiàn)象密切相關(guān)，通過研究其節(jié)律機(jī)制能夠更深人了解蟲害的發(fā)生與發(fā)展規(guī)律[2-4]。

近年來晝夜節(jié)律的分子機(jī)制這個(gè)暗箱逐漸被打開。目前轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋環(huán)被認(rèn)為是主要的生物節(jié)律產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)，并通過該環(huán)中產(chǎn)生的蛋白反饋抑制它們自身的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)研究最多、最深入的是果蠅的晝夜節(jié)律分子機(jī)制[5]。在果蠅，有五種被認(rèn)為是晝夜節(jié)律反饋調(diào)節(jié)的必需基因：period（per）、 timeless（tim）、clock（clk）、cycle（cyc）和cryptochromes（cry）[6]。目前，昆蟲晝夜節(jié)律的研究主要聚焦在生物鐘水平。生物鐘是基于一組 “時(shí)鐘基因”的轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋循環(huán)而產(chǎn)生的內(nèi)源性晝夜節(jié)律性的周期變化[7]，研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)時(shí)鐘基因per和cry1在甘草夜蛾和灰翅夜蛾的觸角中表達(dá)量呈晝夜周期性變化規(guī)律，表明這2種夜蛾的晝夜節(jié)律與其時(shí)鐘基因的時(shí)間表達(dá)水平有關(guān)[8]。生物鐘調(diào)節(jié)嗅覺反應(yīng)已經(jīng)在黑腹果蠅的觸角中發(fā)現(xiàn)[16]。觸角電位（electroantennogram，EAG）反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，黑腹果蠅和蟑螂對(duì)其寄主植物氣味和性信息素的嗅覺反應(yīng)也都表現(xiàn)出明顯的晝夜周期性變化[9-10]， 而敲除cry基因之后它們的觸角神經(jīng)元?jiǎng)t表現(xiàn)出了異常的嗅覺反應(yīng)晝夜節(jié)律[9]。另外，研究發(fā)現(xiàn)敲除黑腹果蠅的中心振蕩器細(xì)胞對(duì)其EAG反應(yīng)的晝夜節(jié)律沒有影響，而破壞其觸角神經(jīng)元之后發(fā)現(xiàn)其EAG反應(yīng)的晝夜節(jié)律消失[11]，表明觸角神經(jīng)元足以調(diào)控嗅覺反應(yīng)的晝夜節(jié)律。盡管觸角時(shí)鐘調(diào)節(jié)EAG反應(yīng)節(jié)律的機(jī)制還不明確，但是基于微陣列的研究方法已經(jīng)表明那些與氣味識(shí)別相關(guān)的基因，如嗅覺受體基因（olfactory receptors，OR）、氣味結(jié)合蛋白基因（odorant binding proteins，OBP）也起著時(shí)鐘調(diào)節(jié)作用[12]。除此之外，性信息素合成激活神經(jīng)肽（pheromone biosynthesis activating neuropeptide，PBAN）、黑化誘導(dǎo)激素（corazonin，Crz）以及色素?cái)U(kuò)散因子（pigment dispersing factor，PDF）被認(rèn)為參與和調(diào)節(jié)動(dòng)物的晝夜節(jié)律行為，不同的時(shí)間點(diǎn)在昆蟲腦部結(jié)構(gòu)中分布的位置和表達(dá)的水平不一樣[13]。

斜紋夜蛾（Spodoptera litura）是我國長江以南蔬菜、煙草、棉花、茶葉、葡萄等農(nóng)業(yè)和林特作物的重要害蟲，繁殖力強(qiáng)，且棲息地隱蔽，對(duì)農(nóng)藥抗性強(qiáng)，藥劑防治非常困難，已到了無藥可用的地步[14]。 目前防治斜紋夜蛾主要依靠化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，但大量使用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致斜紋夜蛾對(duì)多種殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，防治效果減低[15]。近幾年關(guān)于植物氣味引誘雌成蟲產(chǎn)卵或增強(qiáng)性信息對(duì)雄蟲引誘效果的研究已經(jīng)應(yīng)運(yùn)而生，并取得了相當(dāng)不錯(cuò)的成果。因此，利用植物氣味和性信息結(jié)合其行為節(jié)律，或許能為探索新型防治害蟲的方法提供理論基礎(chǔ)和思路。目前關(guān)于斜紋夜蛾嗅覺反應(yīng)晝夜節(jié)律及其分子機(jī)制幾乎還沒有進(jìn)行過系統(tǒng)地研究報(bào)道。為此，本研究選取斜紋夜蛾為研究對(duì)象，通過EAG反應(yīng)、風(fēng)洞以及RT-qPCR技術(shù)共同探索其嗅覺反應(yīng)的晝夜節(jié)律及分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 供試蟲源 斜紋夜蛾蛹購買于河南濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司，并放置于溫州醫(yī)科大學(xué)健康與環(huán)境生態(tài)研究所人工智能氣候室內(nèi)進(jìn)行羽化，室內(nèi)光照時(shí)間12 h:12 h，其中黑暗時(shí)間從人為授時(shí)時(shí)間（zeitgeber time，ZT）3到ZT15，光照時(shí)間從ZT15到ZT3；溫度（27±1）℃，濕度70%±10%。羽化成蟲飼以10%葡萄糖水作為補(bǔ)充營養(yǎng)。

1.2 植物氣味化合物和性信息素及其配制 供試揮發(fā)性氣味化合物的名稱、純度和來源見表1。用石蠟油作溶劑，分別將每種揮發(fā)性化合物配成濃度為0.01 μg/mL的溶液。

1.3 EAG反應(yīng)的測(cè)定 為了研究斜紋夜蛾對(duì)上述供試化合物EAG反應(yīng)的晝夜節(jié)律，我們分別在ZT3、ZT6、ZT9、ZT12、ZT15、ZT18、ZT21、ZT24共8個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定了斜紋夜蛾對(duì)每種化合物的EAG反應(yīng)。每次測(cè)定前先將斜紋夜蛾觸角切除頂端，然后將觸角基部和頂端分別套在參考電極和記錄電極上。實(shí)驗(yàn)采用Syntech EAG記錄系統(tǒng)記錄、分析其電位的變化。測(cè)定參照杜永均等[16]和方宇凌等[17]的方法，實(shí)驗(yàn)中每次吸取20 μL配好的溶液均勻滴于6 cm× 0.5 cm的濾紙上，并移入滴管中，滴管末端連接氣體刺激控制裝置，頂端插入具有連續(xù)氣流的巴斯德管小孔中。經(jīng)活性碳處理的干凈、濕潤的連續(xù)氣流的流量為1 200 mL/min，刺激氣流流量為40 mL/min， 對(duì)準(zhǔn)斜紋夜蛾觸角刺激，每次刺激時(shí)間為0.1 s。以 液體石蠟油為對(duì)照。各種測(cè)定每根觸角只用1次，用完之后再用另一只斜紋夜蛾的觸角進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)時(shí)間段在刺激間隔為60 s的實(shí)驗(yàn)條件下，分別重復(fù)5次，取其均值作為最終的EAG反應(yīng)值。

表1 EAG反應(yīng)中使用的氣味化合物名稱、分子量、純度及來源

1.4 風(fēng)洞實(shí)驗(yàn) 斜紋夜蛾對(duì)植物氣味和性信息素的行為反應(yīng)的晝夜節(jié)律研究在風(fēng)洞中進(jìn)行。風(fēng)洞裝置長200 cm，寬和高均為70 cm。風(fēng)洞內(nèi)設(shè)置溫度26 ℃，相對(duì)濕度為60%～75%。在實(shí)驗(yàn)開始前，將孵化3 d的雄蟲單獨(dú)裝入玻璃管（10 cm×2.5 cm）中，并用紗布封住開口處。在距上風(fēng)端20 cm、高35 cm的支架上放置滴有20 μL植物氣味化合物或性信息素化合物的濾紙條作為氣味源，濾紙每15 min換1次。同時(shí)在氣味源周邊設(shè)置1個(gè)直徑為10 cm左右的球形鋼絲網(wǎng)罩以保護(hù)誘芯不受雄蛾的污染和為雄蛾在誘芯附近降落提供場(chǎng)所。在距下風(fēng)端120 cm處設(shè)置1個(gè)高30 cm的昆蟲釋放支架。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將裝有斜紋夜蛾雄蟲的玻璃管放置昆蟲支架上，拿掉紗布，開始觀察并記錄雄蛾在ZT3、ZT6、ZT9、ZT12和ZT15這5個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)氣味化合物的行為反應(yīng)。每頭昆蟲任其反應(yīng)3 min，如無行為反應(yīng)則換下，引入另1頭雄蛾繼續(xù)實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)3 次，每次重復(fù)測(cè)試20頭雄蛾。記錄下列行為反應(yīng)的斜紋夜蛾數(shù)量：飛行、定向飛行和著陸。

1.5 斜紋夜蛾觸角基因表達(dá)量測(cè)定

1.5.1 總RNA提取：分別在ZT3、ZT6、ZT9、ZT12、ZT15、ZT18、ZT21、ZT24時(shí)間剪取并收集斜紋夜蛾觸角，每組取20對(duì)觸角作為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)的觸角收集完畢后立即用液氮研磨，采用Trizol法提取總RNA。提取的RNA溶于DEPC處理水后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)其260/280比值檢測(cè)RNA純度和濃度。

1.5.2 cDNA模板的合成：按照反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)手冊(cè)使用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。反應(yīng)體系包括10 μL反應(yīng)體系一：2 μL 5×gDNA Buffer、 1 μg RNA、RNase-Free ddH2O補(bǔ)足到10 μL；10 μL反應(yīng)體系二：2 μL 10×Fast RT Buffer、1 μL RT Enzyme Mix、2 μL FQ-RT Primer Mix、5 μL RNase-Free ddH2O。先將體系一于42 ℃孵育3 min后立即放置在冰上，然后將反應(yīng)體系二全部加入反應(yīng)體系一中；最后將混合反應(yīng)體系42 ℃孵育15 min， 95 ℃孵育3 min，并4 ℃保存。合成的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。以上所有樣品均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5.3 RT-qPCR：為探索斜紋夜蛾嗅覺反應(yīng)晝夜節(jié)律的分子調(diào)控機(jī)制，本研究共測(cè)定了9個(gè)嗅覺受體基因（OR01、OR03、OR06、OR11、OR13、OR14、OR26、 OR27和OR83）和10個(gè)時(shí)鐘基因（clk1、clk2、cry1、cry2、cyc1、cyc2、per1、tim1、tim2和crz）在ZT3、ZT6、ZT9、ZT12、ZT15、ZT18、ZT21、ZT24時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平。用GAPDH作為參照基因。用做RT-qPCR的基因引物見表2。RT-qPCR在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad）上完成，每個(gè)PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL Su-permix，1 μL正向引物（10 μmol/L）， 1 μL反向引物（10 μmol/L），1 μL cDNA，7 μL滅菌蒸餾水。采用的qPCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃ 3 min；然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，和70 ℃ 10 s 擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平采用CT值 法的相對(duì)定量法計(jì)算，以2-△△Ct計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，△△Ct=△Ct目的基因-△Ct參照基因；△Ct=Ct目的基因- Ct持家基因。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 所有數(shù)據(jù)都利用Excel軟件制作成平滑曲線圖，分析比較斜紋夜蛾在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)不同植物氣味和性信息素化合物的EAG反應(yīng)和行為反應(yīng)，以及多個(gè)嗅覺受體基因和時(shí)鐘基因的表達(dá)水平差異。

表2 RT-qPCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 斜紋夜蛾對(duì)植物氣味和性信息素化合物的EAG反應(yīng)的晝夜節(jié)律 斜紋夜蛾的EAG反應(yīng)表現(xiàn)出雙峰的晝夜節(jié)律模式，即斜紋夜蛾觸角對(duì)所有植物氣味和性信息素化合物的EAG反應(yīng)都在黑暗后3 h和9 h表現(xiàn)最為強(qiáng)烈，且在黑暗期所有時(shí)間點(diǎn)的觸角EAG反應(yīng)值要高于光照期所有時(shí)間點(diǎn)的EAG反應(yīng)值（見圖1）。這個(gè)結(jié)果表明，斜紋夜蛾的生物活性在黑暗期要明顯強(qiáng)于光照期，這與絕大多數(shù)蛾類昆蟲所表現(xiàn)出的晝伏夜出的生活習(xí)性一致。另外，根據(jù)斜紋夜蛾對(duì)不同化合物的EAG反應(yīng)值大小可以將這些化合物分為4組。第1組化合物包括斜紋夜蛾的性信息素主要成分Z9E12-14:OAc、Z9E11-14:OAc及斜紋夜蛾寄主植物成分石竹烯、芳樟醇和苯乙醛，斜紋夜蛾對(duì)這5種化合物的EAG反應(yīng)最為強(qiáng)烈（見圖1A）；第2組化合物包括植物氣味化合物苯甲醛、己烯醛、1-辛烯-3-醇和乙酸，斜紋夜蛾對(duì)它們的EAG反應(yīng)也較為強(qiáng)烈，但較第1組化合物稍弱（見圖1B）；第3組化合物包括植物氣味化合物α蒎烯、乙酸葉醇酯、壬醛和壬醇，斜紋夜蛾對(duì)這4種化合物的EAG反應(yīng)又比第2組化合物更弱一些（見圖1C）；第4組化合物則包括斜紋夜蛾性信息素化合物的一些衍生化合物Z9-14:OAc、Z9-12:OAc、E11-14:OAc、Z11-16:OAc和Z9-14:OH，斜紋夜蛾對(duì)這些化合物的EAG反應(yīng)最弱（見圖1D）。

2.2 斜紋夜蛾行為反應(yīng)的晝夜節(jié)律 本研究通過風(fēng)洞裝置測(cè)定了黑暗期所有時(shí)間點(diǎn)（光照期斜紋夜蛾活動(dòng)較弱，根本不起飛，因此無法測(cè)定其行為反應(yīng)）斜紋夜蛾對(duì)其EAG反應(yīng)最為強(qiáng)烈的5種化合物（Z9E12-14:OAc、Z9E11-14:OAc、石竹烯、芳樟醇和苯乙醛）的行為反應(yīng)。結(jié)果表明，斜紋夜蛾對(duì)這5種化合物的起飛、定向飛行（芳樟醇除外）以及著陸（芳樟醇和石竹烯除外）行為反應(yīng)都表現(xiàn)出與EAG反應(yīng)一致的雙峰模式，即在黑暗后3 h和9 h其3種行為反應(yīng)最為強(qiáng)烈（見圖2）。從斜紋夜蛾對(duì)這5種化合物的飛行反應(yīng)來看，表現(xiàn)最弱的時(shí)間點(diǎn)為剛進(jìn)入黑暗期的時(shí)候（ZT3），產(chǎn)生飛行反應(yīng)的斜紋夜蛾百分比只有10%（Z9E12-14:OAc）到20%（苯乙醛）；表現(xiàn)最為強(qiáng)烈的時(shí)間點(diǎn)為ZT6和ZT12，在這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，斜紋夜蛾的飛行比例最高分別達(dá)到50%（ZT6）和55%（ZT12）（見圖2）。定向飛行反應(yīng)的斜紋夜蛾百分比總體要比飛行反應(yīng)的低，在0到20%之間。除芳樟醇外，所有的化合物吸引斜紋夜蛾定向飛行的高峰期都在黑暗之后3 h和9 h這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)（ZT6和ZT12），最高百分比分別達(dá)到20%（苯乙醛）和15%（苯乙醛）；而斜紋夜蛾對(duì)這4種化合物的定向飛行反應(yīng)最弱的時(shí)間點(diǎn)都在黑暗之后6 h（ZT9），在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，斜紋夜蛾定向飛行的比例只有0（石竹烯）和7.5%（Z9E11-14:OAc）。與這4種化合物不同，斜紋夜蛾對(duì)芳樟醇的定向飛行反應(yīng)+只有在黑暗后9 h（ZT12）表現(xiàn)最為強(qiáng)烈（為7.5%），而在剛進(jìn)入黑暗期時(shí)（ZT3） 表現(xiàn)最弱（為0）（見圖2）。從著陸反應(yīng)來看，斜紋夜蛾對(duì)所有化合物的著陸反應(yīng)偏弱，最高的著陸斜紋夜蛾百分比僅為5%。其中斜紋夜蛾對(duì)Z9E12-14:OAc、 Z9E11-14:OAc和苯乙醛的著陸率高峰期都在黑暗之后3 h和9 h這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)（ZT6和ZT12），最高百分比均達(dá)到5%（Z9E11-14:OAc和苯乙醛）；而斜紋夜蛾對(duì)芳樟醇和石竹烯的著陸率高峰期只出現(xiàn)在黑暗之后9 h（ZT12），最高百分比均為2.5%（見圖2）。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)斜紋夜蛾對(duì)植物氣味和性信息素化合物的EAG反應(yīng)

總體而言，5種化合物對(duì)斜紋夜蛾引導(dǎo)的飛行、定向飛行及著陸等行為具有一定的節(jié)律性，均在黑暗后3 h（ZT6）和（或）9 h（ZT12）出現(xiàn)高峰期，而在剛進(jìn)入黑暗期（ZT3）或者黑暗6 h（ZT9）表現(xiàn)最弱，這規(guī)律與EAG反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3 斜紋夜蛾基因表達(dá)水平的晝夜節(jié)律 為了進(jìn)一步探討斜紋夜蛾在EAG反應(yīng)和風(fēng)洞實(shí)驗(yàn)中所表現(xiàn)出來的嗅覺反應(yīng)晝夜節(jié)律的調(diào)控機(jī)制，本研究在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)了斜紋夜蛾多個(gè)嗅覺受體基因和時(shí)鐘基因的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有嗅覺受體基因（OR01、OR03、OR06、OR11、OR13、OR14、OR26、OR27和OR83）表達(dá)水平規(guī)律與斜紋夜蛾嗅覺反應(yīng)的晝夜節(jié)律一致，均在黑暗后3 h（ZT6）和9 h（ZT12）表達(dá)達(dá)到最高水平，而且這些基因在黑暗期的表達(dá)水平整體上要高于光照期的表達(dá)水平（見圖3A-B）。光照期除OR14在光照3 h后又出現(xiàn)了1個(gè)表達(dá)小高峰之外，其他嗅覺受體基因表達(dá)水平都很低，而且波動(dòng)不大（見圖3A）。與嗅覺受體基因不一樣，時(shí)鐘基因的表達(dá)水平規(guī)律不一致，但總的來說，所有基因表達(dá)水平在黑暗期要比在光照期高（見圖3C-D）。其中per1、crz、cry1和cry2這4個(gè)時(shí)鐘基因的表達(dá)水平規(guī)律與嗅覺受體基因一樣，都在黑暗后3 h （ZT6）和9 h（ZT12）表達(dá)水平達(dá)到最高值；cyc2則在黑暗后3 h（ZT6）和12 h（ZT15）這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平達(dá)到最高值；其他所有時(shí)鐘基因（tim1、tim2、cyc1、clk1和clk2）都只在黑暗后3 h（ZT6）這1個(gè)時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出表達(dá)高峰，其他時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平差異不大（圖3C-D）。

3 討論

動(dòng)物的晝夜節(jié)律是一種復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，是動(dòng)物對(duì)各種環(huán)境條件變化（如光照、溫度、濕度等非生物條件和食物條件、種內(nèi)社群關(guān)系和種間關(guān)系等生物因素）的綜合適應(yīng)[18]。對(duì)于地球上的絕大多數(shù)生命有機(jī)體來說，光線是它們調(diào)整生物鐘的主要因素，通過對(duì)光線的感受從而調(diào)整它們的生理時(shí)鐘與自然界光照變化保持一致[19]。本研究通過EAG反應(yīng)和行為反應(yīng)（風(fēng)洞實(shí)驗(yàn)）發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾的嗅覺反應(yīng)是具有一定的晝夜節(jié)律性，這與其嗅覺基因和時(shí)鐘基因表達(dá)水平的晝夜節(jié)律基本上一致。

圖2 黑暗期不同時(shí)間點(diǎn)斜紋夜蛾對(duì)3種植物氣味化合物和2種性信息素化合物的行為反應(yīng)

昆蟲主要是靠觸角上的嗅感器來感受氣味的，有氣味的化學(xué)刺激物質(zhì)在嗅感器內(nèi)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)，通過觸角上的神經(jīng)傳向中樞[20]。在快速檢測(cè)觸角對(duì)氣味的反應(yīng)活性和敏感性方面，EAG反應(yīng)是一種非常重要的生物測(cè)定方法。它具有很高的敏感性和選擇性，因此被廣泛地應(yīng)用于昆蟲嗅覺研究中[21]，成為昆蟲信息素及其它揮發(fā)性信息化合物生物測(cè)定非常得力的方法之一[22]。風(fēng)洞實(shí)驗(yàn)國內(nèi)運(yùn)用的不多，與嗅覺儀相比，風(fēng)洞實(shí)驗(yàn)?zāi)芨玫啬M田間條件，可觀察的指標(biāo)較多，而且靈敏度也很高，其研究的對(duì)象為飛行的成蟲。風(fēng)洞實(shí)驗(yàn)從斜紋夜蛾的行為上有力地驗(yàn)證了嗅覺反應(yīng)是具有一定的晝夜規(guī)律的。風(fēng)洞實(shí)驗(yàn)選取的化學(xué)刺激物均為從EAG反應(yīng)中篩選出的，斜紋夜蛾敏感的化合物，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果更直觀強(qiáng)烈地證明嗅覺反應(yīng)具有較強(qiáng)的晝夜規(guī)律。不同化合物在不同時(shí)間對(duì)斜紋夜蛾引導(dǎo)的行為也是不一樣的，從側(cè)面可以求證出嗅覺反應(yīng)最強(qiáng)的時(shí)間段，從而為化學(xué)信息素誘捕斜紋夜蛾打下了基礎(chǔ)。目前國內(nèi)研究嗅覺行為大多是以嗅覺儀為主，通過風(fēng)洞實(shí)驗(yàn)來研究斜紋夜蛾的晝夜節(jié)律較少。本研究則運(yùn)用EAG反應(yīng)和風(fēng)洞實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)斜紋夜蛾在不同時(shí)間段受到氣味刺激后所產(chǎn)生的電生理和行為反應(yīng)變化，并通過熒光定量PCR檢測(cè)其嗅覺受體和時(shí)鐘基因表達(dá)水平的晝夜節(jié)律以揭示其嗅覺反應(yīng)晝夜節(jié)律的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步了解斜紋夜蛾的生物學(xué)特性，從而為該昆蟲的防治提供重要的理論依據(jù)。

本研究中EAG反應(yīng)和風(fēng)洞實(shí)驗(yàn)表明，斜紋夜蛾在黑暗后3 h和9 h的嗅覺最為活躍，而且在黑暗期的嗅覺反應(yīng)總體上要比在光照期的嗅覺反應(yīng)更為靈敏，這與絕大多數(shù)的蛾類昆蟲的生物行為晝夜節(jié)律一致。除此之外，蛾類生物行為晝夜節(jié)律還表現(xiàn)在其化蛹、羽化、交配、產(chǎn)卵、孵化等方面[23]。 蛾類昆蟲大多數(shù)產(chǎn)卵是在交尾后第2天的夜間，如棉 大卷葉夜蛾（S.derogate）、沙棘木蠹蛾（H.hippophaecolus）和甜菜夜蛾（S.exigua）的產(chǎn)卵時(shí)間都是在交尾后第2天晚上，其產(chǎn)卵時(shí)間分別為夜間20：00- 22：00，20：30-22：00和00：00-5：00[24-26]。在其他 昆蟲中，其生物行為也是有一定晝夜節(jié)律的。如井上蛀果斑螟蟲羽化、產(chǎn)卵、交配、化蛹等行為的高峰期都分別在18：00-4：00、2：00-10：00、4：00- 8：00、10：00-14：00和18：00-22：00，表現(xiàn)出較明顯的晝夜節(jié)律[27]。

昆蟲行為節(jié)律被認(rèn)為是一種由生物鐘基因控制的內(nèi)源性節(jié)律[28]。這種行為節(jié)律在其他夜行性動(dòng)物中也充分存在，并被指出與嗅覺傳入有一定關(guān)聯(lián)，認(rèn)為嗅覺傳入會(huì)影響晝夜節(jié)律，這兩者的關(guān)聯(lián)性已被證明[29]。目前關(guān)于斜紋夜蛾的晝夜節(jié)律分子機(jī)制的研究較少，我們猜測(cè)斜紋夜蛾嗅覺反應(yīng)的晝夜節(jié)律也是通過時(shí)鐘基因來控制的，故我們檢測(cè)了不同時(shí)間點(diǎn)的斜紋夜蛾的時(shí)鐘基因以及編碼嗅覺反應(yīng)的嗅覺受體基因的表達(dá)水平。從時(shí)鐘基因和嗅覺基因表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，這兩種基因的表達(dá)隨時(shí)間變化均具有較強(qiáng)的節(jié)律性，但各個(gè)基因的節(jié)律性并不相同，這也許是它們功能的側(cè)重點(diǎn)不同。有研究表明在果蠅中有100多個(gè)基因有較強(qiáng)的晝夜節(jié)律，分別參與了嗅覺、視覺、攝食等反應(yīng)[30]。本研究中，斜紋夜蛾的時(shí)鐘基因表達(dá)水平出現(xiàn)一定的節(jié)律性，其基因整體的表達(dá)水平在黑暗期較光照期高，這與斜紋夜蛾活動(dòng)習(xí)性相一致。時(shí)鐘基因在黑暗期的高水平表達(dá)有利于增加活動(dòng)相關(guān)酶的量及活性，為斜紋夜蛾夜間活動(dòng)本身?xiàng)l件提供便利。cyc1和clk2不管在黑暗期還是光照期，其基因表達(dá)水平起伏不大，但仍不排除它輔助或負(fù)反饋其他基因表達(dá)的作用。嗅覺基因表達(dá)規(guī)律性更強(qiáng)，各基因高表達(dá)水平均時(shí)間段位于黑暗后3 h和9 h，在光照期的基因表達(dá)水平均較低，與斜紋夜蛾活動(dòng)習(xí)性相一致。斜紋夜蛾主要在夜間活動(dòng)及覓食，嗅覺基因在此時(shí)間段高水平表達(dá)進(jìn)而合成嗅覺相關(guān)蛋白為夜間覓食做準(zhǔn)備。OR14在光照期3 h出現(xiàn)了峰值，我們推測(cè)OR14基因在白晝交替的時(shí)間段作用較大，而光照對(duì)其表達(dá)影響不顯著。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)斜紋夜蛾幾個(gè)嗅覺受體基因和時(shí)鐘基因的表達(dá)水平

本研究運(yùn)用EAG反應(yīng)和風(fēng)洞實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用植物揮發(fā)物及性信息素在1 d內(nèi)的不同時(shí)間段對(duì)斜紋夜蛾的嗅覺反應(yīng)活性進(jìn)行檢測(cè)，了解植物揮發(fā)物及性信息素對(duì)斜紋夜蛾雄蟲的電生理反應(yīng)及行為反應(yīng)，找出斜紋夜蛾對(duì)這些刺激氣味的晝夜節(jié)律性，為進(jìn)一步提高斜紋夜蛾誘集效率提供科學(xué)依據(jù)。通過研究斜紋夜蛾時(shí)鐘基因和嗅覺受體基因表達(dá)水平的晝夜節(jié)律，為進(jìn)一步深入探索斜紋夜蛾以及其他蛾類昆蟲晝夜節(jié)律的調(diào)控打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，后期可以結(jié)合更多行為學(xué)觀察進(jìn)而為害蟲的防治提供更寬廣的思路。當(dāng)然，斜紋夜蛾觸角嗅覺反應(yīng)的晝夜節(jié)律還可能和光強(qiáng)度[31]、溫度[32]、地理性[33]等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：趙翠翠）

Study on circadian rhythms of olfactory response and its regulatory mechanisms in Spodoptera litura

LIN Huiyue, QIAN Kai, BAI Jiaxiu, ZHANG Daogen, LU Rui, WAN Xinlong.
Institute of Health and Environmental Ecology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To study circadian rhythms of olfactory response and its regulatory mechanisms in Spodoptera litura, providing new insight in controlling this pest. Methods: Electroantennogram (EAG) was used to determine the electrophysiological responses of S. litura to chemicals originated from sex pheromones and host plants at eight different time points during day, finding the circadian rhythms of EAG responses in S. litura and selecting out the compounds to which the moths strongly responded. Then the wind tunnel was used to measure the behavioral responses of S. litura to these compounds at the same five time points during the scotophase. In addition, the expression levels of genes regulating circadian rhythms and olfaction at the same time points were detected by the real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) technique to reveal the molecular regulatory mechanism of olfactory circadian rhythms in S. litura. Results: The results showed that the strongest EAG responses of male S. litura to all tested plant odor compounds and sex pheromone components occurred after 3 hours and 9 hours in the dark, showing a bimodal pattern. A total of five compounds: Z9E12-14:OAc, Z9E11-14:OAc, caryophyllene, linalool and phenylacetaldehyde were selected and tested in behavioral responses (wind tunnel). The behavioral responses of S. litura to the five chemicals at five time points during scotophase showed similar patterns to that obtained from the EAG tests. The expression levels of the most olfactory receptor and clock genes reached the peak after 3 and 9 hours in the dark, which is largely consistent with the circadian rhythms of olfactory responses in S. litura. Conclusion: The circadian rhythms of olfactory responses were consistent with those of expression levels of olfactory and clock genes in S. litura, suggesting that the circadian rhythms are probably essentially regulated by clock and olfactory genes.

Spodoptera litura; circadian rhythms; electroantennogram; wind tunnel; RT-qPCR

Q965

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.08.002

2016-11-02

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY15C030003）；溫州醫(yī)科大學(xué)科研啟動(dòng)基金（89213002）。

林慧玥（1991-），女，浙江瑞安人，碩士生。

萬新龍，副研究員，Email：smartw@wmu.edu.cn。