侯麗娜，劉煒燁，賈小平，李 亮，李小溪

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院健康管理中心，廣東廣州510515)

慢性心力衰竭患者尿液雙向凝膠電泳技術(shù)的優(yōu)化

侯麗娜，劉煒燁，賈小平，李 亮，李小溪

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院健康管理中心，廣東廣州510515)

目的:分析慢性心力衰竭患者尿液雙向電泳技術(shù)的影響因素以提高其分辨率及穩(wěn)定性．方法:采用超濾法富集并濃縮尿液蛋白，Bradford法測(cè)濃度后進(jìn)行雙向電泳，凝膠經(jīng)銀染顯色后，用Melanie 4軟件分析雙向電泳圖譜．分別對(duì)蛋白上樣量，聚焦參數(shù)等步驟進(jìn)行優(yōu)化．結(jié)果:超濾濃縮法，150 μg的上樣量，60 KVh的聚焦總伏特?cái)?shù)，進(jìn)行的雙向電泳圖譜分辨率高，穩(wěn)定性好．結(jié)論:對(duì)上樣量和聚焦總伏特?cái)?shù)優(yōu)化后可獲得穩(wěn)定性高和重復(fù)性好的慢性心力衰竭患者尿液雙向電泳圖譜，以便開展后續(xù)研究．

慢性心力衰竭;尿液;雙向凝膠電泳;蛋白質(zhì)組

0 引言

慢性心力衰竭是一種復(fù)雜的臨床綜合征，其特點(diǎn)是心室充盈和/或射血能力受損從而導(dǎo)致心臟不能泵出足量的血液滿足機(jī)體的代謝需要．慢性心力衰竭發(fā)病率及死亡率逐年上升意味著沉重的公共衛(wèi)生和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］．在臨床中清楚地查明所有的致病因素常常是困難的．目前，在日常診療中運(yùn)用的臨床、實(shí)驗(yàn)室檢查和影像學(xué)標(biāo)記物方法來(lái)診斷、預(yù)測(cè)和隨訪慢性心力衰竭患者常常是復(fù)雜的［2］．從尿液蛋白質(zhì)組學(xué)整體水平出發(fā)，可能為慢性心力衰竭的診斷和預(yù)后提供了額外的預(yù)測(cè)價(jià)值，并有助于指導(dǎo)治療和發(fā)現(xiàn)治療新靶點(diǎn)，具有重要的意義．

尿液相比其他體液的蛋白質(zhì)組學(xué)分析的臨床應(yīng)用是一個(gè)新興的和有希望的研究領(lǐng)域，可以直接反映機(jī)體的狀態(tài)，尿液樣本容易獲取，而且獲取方式為非侵襲性，患者的配合度更高［3］．本研究運(yùn)用雙向凝膠電泳技術(shù)對(duì)慢性心力衰竭患者與正常對(duì)照人群的尿液差異表達(dá)蛋白進(jìn)行比較分析，以獲得慢性心力衰竭差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，可以更好地了解慢性心力衰竭的病理機(jī)制，具有重要的學(xué)術(shù)科研及臨床運(yùn)用價(jià)值．然而，在雙向電泳過(guò)程中，影響等電聚焦和凝膠電泳的因素多種多樣，如樣品的處理、上樣量和聚焦參數(shù)的設(shè)定等．因此，本研究對(duì)其中的某些關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行了反復(fù)對(duì)比優(yōu)化處理，以獲得理想的雙向電泳圖譜．

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 樣品采集 40例健康對(duì)照人群來(lái)源于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院健康管理中心．40例患者為南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心內(nèi)科住院患者，明確診斷為慢性心力衰竭．診斷標(biāo)準(zhǔn)參考最新中國(guó)心血管疾病診斷治療指南．本研究經(jīng)該單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均已知情并同意捐獻(xiàn)，簽訂知情同意書．兩組人群的基線資料(年齡、肌酐等)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)．尿液標(biāo)本要求清潔中段尿，2 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱并保存．

1．1．2 試劑 固相pH梯度干膠條(pH 3-10 L和NL，24 cm)、膠條緩沖液(pH 3－10)均為GE公司產(chǎn)品;15 mL超濾管購(gòu)自Millipore公司;尿素、DTT、3-［3-(膽酰胺丙基)二甲氨基］丙磺酸內(nèi)鹽、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、Acrylamide、礦物油、甘油、Glycine、Methylene double acrylamide和 Thiourea均為美國(guó) Bio-Rad公司產(chǎn)品;Na2S2O3、AgNO3、C2H5OH、C2H4O2、Na2CO3、甲醛醋酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純．1．1．3 儀器 YM-3超濾離心管(美國(guó)Millipore公司)、圖像分析軟件為Melanie 4試用版本、Milli-Q超純水儀購(gòu)自Millipore公司、等電聚焦儀、垂直電泳系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司、透射掃描儀為UMAX owerLook 100(美國(guó)Bio-Rad公司)．

1．2 方法

1．2．1 尿液蛋白樣品制備 從－80℃冰箱取出樣品混合，放置于冰上解凍后進(jìn)行低溫超濾離心，超濾離心使用YM-3超濾離心管截留分子質(zhì)量大于10 KD的各組尿液蛋白，采用Bradford方法測(cè)定蛋白濃度后，取離心管內(nèi)液凍存．

1．2．2 雙向凝膠電泳分離總蛋白 按照如下分成四組進(jìn)行實(shí)驗(yàn):150 μg蛋白樣品聚焦60 KVh組(IPG pH 3-10 NL，24 cm)，250 μg蛋白樣品聚焦60 KVh組(IPG pH 3-10NL，24 cm);150 μg蛋白樣品聚焦60 KVh組(IPG pH 3-10 NL，24 cm)，150 μg蛋白樣品聚焦50 KVh組(IPG pH 3-10 NL，24 cm)分別置于450 μL上樣緩沖液中充分混合，采取被動(dòng)泡漲12 h，等電聚焦參數(shù)為100V 1 h，500V 1 h，1000 V 1 h，8 000 V 3 h，8 000 V 50/60 KVh，500 V 3 h．聚焦完畢后進(jìn)行兩次平衡，隨后進(jìn)行第二向凝膠電泳．

1．2．3 銀染 經(jīng)過(guò)固定、敏化、染色、顯影等過(guò)程［4］．

1．2．4 圖譜分析 凝膠銀染結(jié)束后，用UMAX PowerLook 1100投射掃描儀對(duì)凝膠進(jìn)行圖像掃描，并對(duì)其呈現(xiàn)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行分析．

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上，數(shù)據(jù)以x ±s表示，計(jì)量資料兩組間均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料則采用χ2檢驗(yàn)，由統(tǒng)計(jì)軟件 STATA16．0完成．P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果

2．1 研究對(duì)象一般資料比較 慢性心力衰竭患者和健康對(duì)照人群各40例樣本的尿液分別各自混合后，提取總蛋白，經(jīng)過(guò)測(cè)定后進(jìn)行雙向凝膠電泳．結(jié)果表明，慢性心力衰竭患者和正常對(duì)照人群基線資料(年齡、性別、尿液肌酐水平等)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，表1)．

表1 雙向凝膠電泳研究的尿液標(biāo)本 (n=40，x ±s)

2．2 不同上樣量對(duì)雙向凝膠電泳圖譜的影響 為了探索合理的上樣量，在參考相關(guān)尿液蛋白質(zhì)組學(xué)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上［4－6］，本研究分別比較了150 μg和250 μg兩組上樣量雙向凝膠電泳圖譜．圖1A上樣量為250 μg，圖譜上有些蛋白點(diǎn)過(guò)飽和，許多蛋白質(zhì)點(diǎn)融合在一起;掩蓋附近一些低豐度蛋白的表達(dá)，使其分辨率降低，且其圖染色背景較深．圖1B上樣量為150 μg，盡管蛋白上樣量較圖1A少，但整個(gè)圖譜效果明顯優(yōu)于圖1A．雖然出現(xiàn)的蛋白點(diǎn)要少于圖1A，但大部分蛋白質(zhì)點(diǎn)能夠清晰辨認(rèn)，背景較為干潔，以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)．因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)上樣量一般為150 μg．

圖1 不同上樣量的雙向電泳圖譜比較

2．3 不同聚焦參數(shù)總伏特?cái)?shù)對(duì)雙向凝膠電泳圖譜的影響 聚焦的程序及總伏特?cái)?shù)直接影響圖譜的質(zhì)量．為了獲取理想的蛋白圖譜，本研究比較了聚焦總伏特?cái)?shù)分別為50 KVh/60 KVh兩組實(shí)驗(yàn)，即聚焦程序:100 V 1 h，500 V 1 h，1000 V 1 h，8 000 V 3 h，8 000 V 50/60 KVh，500 V 3 h．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聚焦總伏特?cái)?shù)50 KVh組相應(yīng)的蛋白圖譜的蛋白點(diǎn)少，橫條紋較多(圖2A);而聚焦總伏特?cái)?shù)60 KVh組的雙向凝膠電泳圖譜上不僅蛋白點(diǎn)較多，而且橫條紋也大大減少(圖2B)，分離效果較好，有利于開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)．因此，60 KVh的聚焦總伏特?cái)?shù)是合理的．

圖2 不同聚焦總伏特?cái)?shù)的雙向電泳圖譜比較

3 討論

慢性心力衰竭是一種心血管疾病常見的臨床綜合征，伴有心肌結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變、心室泵血功能降低，是多種心臟病潛在的終末期表現(xiàn)．慢性心力衰竭的病因復(fù)雜，病理機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，不同的病因?qū)W說(shuō)解釋了心臟疾病如何進(jìn)展到慢性心力衰竭，包括心肌缺血、高血壓、糖尿病、心臟瓣膜病、心律失常和遺傳性心肌?。?－9］．然而，在臨床中清楚地查明所有的致病因素常常是困難的．

現(xiàn)在使用的許多生物標(biāo)記物只能描述一部分病理特點(diǎn)，不能夠全面整體地闡述疾?。鞍踪|(zhì)組學(xué)可以從整個(gè)蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的水平研究疾病的變化，是當(dāng)前篩選疾病差異表達(dá)蛋白，尋找疾病標(biāo)志物及發(fā)現(xiàn)藥物治療新靶標(biāo)有力工具．尿液相比血液、唾液等其他體液的蛋白質(zhì)組學(xué)分析的臨床應(yīng)用是一個(gè)新興的和有希望的研究領(lǐng)域，可在一定程度上反映血液和整個(gè)機(jī)體的狀態(tài)．運(yùn)用尿液蛋白質(zhì)組學(xué)分析法識(shí)別蛋白質(zhì)/多肽生物標(biāo)記物可能為診斷、預(yù)測(cè)、指導(dǎo)治療和新療法的發(fā)展提供了一種新的形式;同時(shí)尿液樣本易于收集，且對(duì)人體無(wú)創(chuàng)，這可能具有利于診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的價(jià)值，并有助于指導(dǎo)治療和發(fā)現(xiàn)治療新靶點(diǎn)［10－12］．以前的研究運(yùn)用尿液蛋白質(zhì)組學(xué)分析法來(lái)識(shí)別針對(duì)冠心病和亞臨床期左心室舒張功能不全的尿液多肽生物標(biāo)記物．這些生物標(biāo)記物被用來(lái)建立特定疾病的分類［13］．但此方法尚未廣泛應(yīng)用于慢性心力衰竭．Lemesle等［14］報(bào)道了將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于射血分?jǐn)?shù)相關(guān)型患者管理的潛在獲益，即血漿多種標(biāo)記物蛋白質(zhì)表達(dá)譜可預(yù)測(cè)慢性心衰患者的心血管事件死亡率．基于尿液蛋白質(zhì)組分析可用來(lái)篩選慢性心力衰竭相關(guān)性尿液多肽標(biāo)記物的一種敏感工具，這些多肽標(biāo)記物有可能幫助我們進(jìn)一步理解和診斷心力衰竭．本研究正是從慢性心力衰竭的尿液蛋白組學(xué)的立足點(diǎn)出發(fā)，以期篩選出慢性心力衰竭密切相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，希望可直接了解慢性心力衰竭的發(fā)病機(jī)制及探索臨床診療的新思路．蛋白質(zhì)組學(xué)關(guān)鍵目的是分離并篩選出盡可能多的蛋白質(zhì)，以便后續(xù)質(zhì)譜鑒定出盡可能多的不同種蛋白質(zhì)．因此，研究影響等電聚焦和雙向電泳的關(guān)鍵因素是重要內(nèi)容，可為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究奠定殷實(shí)的基礎(chǔ)．

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中加入蛋白抑制劑抑制蛋白酶的活性，盡量保證蛋白的完整性．為了提高分辨率和相對(duì)分子質(zhì)量較高蛋白質(zhì)的分離，對(duì)比150 μg和250 μg兩組上樣量，結(jié)果顯示150 μg的上樣量可以明顯地檢測(cè)出低豐度蛋白，同時(shí)還可以避免低豐度蛋白被高豐度蛋白掩蓋．此外，本研究還觀察了不同聚焦總伏特?cái)?shù)對(duì)雙向電泳圖譜的影響，對(duì)比發(fā)現(xiàn)當(dāng)聚焦總伏特?cái)?shù)不夠時(shí)，尿液中的蛋白到達(dá)不了相應(yīng)的等電點(diǎn)部位，電泳圖譜上的蛋白點(diǎn)較少，還會(huì)在雙向電泳圖譜上出現(xiàn)顏色較深的橫條紋．通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)60 KVh的聚焦總伏特?cái)?shù)是適度的，圖譜上可以看到不僅蛋白點(diǎn)較多，而且橫條紋也大大減少［15］．值得引起注意的是，因尿液PH值偏酸性(6．0～7．0)，在2-DE的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中本研究使用了pH 3－10非線性(NL)的膠條，因?yàn)樵撃z條不僅相對(duì)增大pH 4－7段的長(zhǎng)度以更好分離此區(qū)間的蛋白點(diǎn)，還能夠兼顧檢測(cè)標(biāo)本蛋白總體情況，包括堿性段的蛋白［16］．

綜上所述，為更好地開展慢性心力衰竭的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究，我們認(rèn)為采用超濾的方法，150 μg的上樣量，60 KVh的聚焦參數(shù)，使用非線性的IPG膠條可以得到理想的雙向電泳圖譜，有助于分離、篩選出相關(guān)差異表達(dá)蛋白質(zhì)．

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Optimization of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis on urine samples from patients with chronic heart failure

HOU Li-Na，LIU Wei-Ye，JIA Xiao-Ping，LI Liang，LI Xiao-Xi
Department of Healthy Mangement，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China

AIM:To analyze the influence factors of two-dimensional electrophoresis(2-DE)on urine samples from the patients with chronic heartfailure and improve the resolution and stability of 2-DE map．METHODS:After using the method of ultrafiltration，the 2-DE was conducted after measuring the concentration of the total protein by Bradford method．The gel was scanned and analyzed by Melanie 4 following silver staining．We improved the sample volume of proteins，focus parameters and other related steps to optimize the 2-DE．RESULTS:We could successfully obtain a higher resolution and reproducible 2-DE image with ultrafiltration，protein loaded with 150 μg and focus voltage with a total of 60 KVh．CONCLUSION:The well-established 2-DE map on urine samples of chronic heart failure patients made by 2-DE is useful in studying the mechanism and treatments of chronic heart failure．

chronic heart failure;urine;two-dimensional gel electrophoresis(2-DE);proteome

R541．6+1

A

2095-6894(2017)08-41-03

2017－02－10;接受日期:2017－02－26

廣東省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016zc0078)

侯麗娜．博士，主治醫(yī)師．研究方向:心血管及泌尿系統(tǒng)疾病健康管理．E-mail:1175024441@qq．com

李小溪．博士，主治醫(yī)師．E-mail:ursin7872@fmmu．com