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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

川芎嗪調(diào)控PKCβ1減輕波動(dòng)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究

王景尚1，黃燁2，殷惠軍3，孫明月2，石穎2

目的觀察川芎嗪對(duì)波動(dòng)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷及蛋白激酶Cβ1(PKCβ1)表達(dá)的影響。方法分離、鑒定并培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)共分為7組：正常低糖(N)組、穩(wěn)定高糖(W)組、波動(dòng)高糖(B)組、穩(wěn)定高糖+LY333531(WL)組、波動(dòng)高糖+LY333531(BL)組、波動(dòng)高糖+川芎嗪(TMP)組和波動(dòng)高糖+二甲雙胍(MH)組。8 d后檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、可溶性細(xì)胞間黏附分子1(sICAM-1)、晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)和總抗氧化能力(T-AOC)水平及細(xì)胞PKCβ1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果與N組相比，W組和B組HUVECs總凋亡率、TNF-α、sICAM-1、AOPP含量、PKCβ1蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01)，T-AOC顯著降低(P<0.01)，且W組和B組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。應(yīng)用TMP和MH干預(yù)具有與LY333531阻斷相似的效應(yīng)，可顯著降低細(xì)胞的總凋亡率、TNF-α、sICAM-1、AOPP含量及PKCβ1蛋白表達(dá)(P<0.01)，同時(shí)可顯著升高T-AOC水平(P<0.01)。結(jié)論波動(dòng)性高糖狀態(tài)具有顯著加重人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的效應(yīng)，且該效應(yīng)與PKCβ1表達(dá)水平顯著升高密切相關(guān)；川芎嗪對(duì)波動(dòng)性高血糖狀態(tài)下的血管內(nèi)皮功能具有明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與其顯著抑制PKCβ1的過表達(dá)進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷；川芎嗪；波動(dòng)高糖；蛋白激酶Cβ1；腫瘤壞死因子α；可溶性細(xì)胞間黏附分子1

2型糖尿病是冠心病的等危癥，血管并發(fā)癥的發(fā)生是糖尿病病人出現(xiàn)高致殘率、高致死率的主要原因[1]。課題組前期通過納入冠心病病人并應(yīng)用寡核苷酸基因芯片技術(shù)成功構(gòu)建了冠心病白細(xì)胞差異基因表達(dá)譜，同時(shí)深入分析發(fā)現(xiàn)，其中的差異基因蛋白激酶Cβ1(PKCβ1)位于冠心病疾病網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)[2]。高血糖狀態(tài)是糖尿病病人的顯著特征，與血管損傷在內(nèi)的糖尿病長(zhǎng)期并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。大量臨床和基礎(chǔ)研究證實(shí)，相對(duì)于血糖控制良好的穩(wěn)定性高血糖病人，血糖控制不良的“波動(dòng)性高血糖”糖尿病病人更易出現(xiàn)慢性血管并發(fā)癥，而且血糖波動(dòng)的幅度越大，其并發(fā)癥的發(fā)生率就越高、預(yù)后就越差[3-5]。這已成為目前糖尿病預(yù)防和治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。蛋白激酶C(PKC)途徑被認(rèn)為是糖尿病血管病變的關(guān)鍵機(jī)制[6]?；诖?，推測(cè)冠心病關(guān)鍵調(diào)控基因蛋白激酶Cβ1參與波動(dòng)性高血糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷過程?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪具有較好的抗脂質(zhì)過氧化和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能等作用[7-8]，那么，其保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用是否與調(diào)控PKCβ1基因有關(guān)？其在波動(dòng)性高血糖血管病變中是否也發(fā)揮重要作用呢？基于此，本研究通過體外構(gòu)建波動(dòng)性高血糖誘導(dǎo)損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討川芎嗪?duì)波動(dòng)高糖損傷血管內(nèi)皮的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 鹽酸川芎嗪(Tetramethylpyrazine hydrochloride，TMP，批號(hào)：201121126)、鹽酸二甲雙胍原料藥(metformin hydrochloride，MH，批號(hào)：20111125)均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；LY333531(PKCβ1抑制劑，批號(hào)：02011306)購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 健康產(chǎn)婦臍帶取自北京海淀區(qū)婦幼保健醫(yī)院。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的分離方法參照J(rèn)affe等[9]方法。無菌條件下取健康產(chǎn)婦正常分娩的新生兒臍帶應(yīng)用0.1%膠原酶Ⅰ臍靜脈灌流消化分離細(xì)胞15 min，以1 500 r/min離心10 min，收集內(nèi)皮細(xì)胞。接種于含20%胎牛血清、10 ng/mL EGF、40 U/mL肝素、20 mmol/L谷氨酰胺、50 U/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素、0.11 mg/mL丙酮酸鈉的低糖型DMEM培養(yǎng)基中，再置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h換液，以后每2 d～3 d更換一次，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，倒置相差顯微鏡下觀察到內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)單一，呈棱形或多角形，細(xì)胞邊界清楚，胞質(zhì)豐富，胞核呈橢圓形、靠近中央，核仁明顯。檢查3 d～5 d細(xì)胞融合連成片，鋪滿培養(yǎng)瓶，呈鵝卵石樣排列，以0.25%胰酶-EDTA溶液消化傳代培養(yǎng)。所用實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均為第3代～5代細(xì)胞。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 實(shí)驗(yàn)分為7組。正常低糖(N)組：持續(xù)低糖型DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)；穩(wěn)定性高糖(W)組：持續(xù)高糖型DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)；波動(dòng)性高糖(B)組：高糖型DMEM全培養(yǎng)基/低糖型DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24 h更換一次；穩(wěn)定性高糖+LY333531(WL)組：對(duì)穩(wěn)定性高糖組進(jìn)行LY333531(200 nmol/L)干預(yù)，預(yù)處理1 h；波動(dòng)性高糖+LY333531(BL)組：對(duì)波動(dòng)性高糖組進(jìn)行LY333531(200 nmol/L)干預(yù)，預(yù)處理1 h；鹽酸川芎嗪(TMP)組：對(duì)波動(dòng)性高糖組運(yùn)用川芎嗪(500 μmol/L)進(jìn)行干預(yù)和鹽酸二甲雙胍(MH)組：對(duì)波動(dòng)性高糖組運(yùn)用鹽酸二甲雙胍(1 mmol/L)進(jìn)行干預(yù)。各組細(xì)胞在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)8 d后，收集細(xì)胞上清液進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。

1.4 指標(biāo)檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡水平，定量ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液腫瘤壞死因子α(TNF-α)、可溶性細(xì)胞間黏附分子1(sICAM-1)、晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)和總抗氧化能力(T-AOC)水平，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞PKCβ1蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 不同培養(yǎng)條件葡萄糖培養(yǎng)及藥物干預(yù)對(duì)HUVECs凋亡的影響 與N組相比，W組和B組HUVECs總凋亡率均明顯增加(P<0.01)，且凋亡以晚期凋亡為主，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；應(yīng)用LY333531阻斷后，WL組和BL組細(xì)胞總凋亡率均顯著下降(P<0.05或P<0.01)；應(yīng)用TMP和MH干預(yù)亦可顯著降低細(xì)胞的總凋亡率(P<0.01)，二者均以抑制早期凋亡為主。詳見圖1、圖2。

注：與N組相比，*P<0.05，**P<0.01；與W組相比，#P<0.05，##P<0.01；與B組相比，▲P<0.01。圖1 不同培養(yǎng)條件葡萄糖培養(yǎng)及藥物干預(yù)對(duì)HUVECs凋亡的影響

圖2 不同培養(yǎng)條件葡萄糖培養(yǎng)及藥物干預(yù)對(duì)細(xì)胞凋亡影響的典型流式圖

2.2 不同培養(yǎng)條件葡萄糖培養(yǎng)及藥物干預(yù)對(duì)HUVECs炎癥反應(yīng)的影響 與N組相比，W組和B組HUVECs 炎癥因子TNF-α和sICAM-1含量均明顯增加(P< 0.01)；與W組相比，B組HUVECs TNF-α和sICAM-1含量又有進(jìn)一步升高(P<0.05或P<0.01)；應(yīng)用LY333531阻斷后，WL組和BL組細(xì)胞TNF-α和sICAM-1水平顯著下降(P<0.05或P<0.01)；應(yīng)用TMP和MH干預(yù)后，細(xì)胞TNF-α和sICAM-1水平亦顯著下降(P<0.01)。詳見表1。

組別nTNF-αsICAM-1N組60.11±0.01 1.29±0.79W組60.14±0.021)4.23±1.061)B組60.17±0.021)3)5.85±2.291)2)WL組60.11±0.012)2.50±0.862)BL組60.12±0.024)3.26±1.414)TMP組60.13±0.034)3.44±1.174)MH組60.12±0.024)2.82±1.194) 與N組相比,1)P<0.01;與W組相比,2)P<0.05,3)P<0.01;與B組相比,4)P<0.01。

2.3 不同培養(yǎng)條件葡萄糖培養(yǎng)及藥物干預(yù)對(duì)HUVECs 氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 與N組相比，W組和B組HUVECs AOPP含量顯著增多(P<0.01)，T-AOC顯著降低(P<0.01)，且B組與W組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；應(yīng)用LY333531阻斷后，WL組和BL組細(xì)胞AOPP含量均顯著下降(P<0.01)，同時(shí)伴T-AOC顯著升高(P<0.05或P<0.01)；應(yīng)用TMP和MH干預(yù)后，AOPP含量均顯著下降(P<0.01)，且T-AOC顯著升高(P<0.01)。詳見表2。

組別nAOPP(pmol/L) T-AOC(U/L)N組6210.48±107.622652.08±253.94W組6527.45±202.891)2072.83±202.351)B組6677.05±123.361)2)1643.15±104.811)3)WL組6337.88±135.283)2358.78±209.172)BL組6402.77±102.854)2089.70±150.494)TMP組6368.01±75.714)2322.43±334.454)MH組6358.79±92.584)2089.27±205.224) 與N組相比,1)P<0.01;與W組相比,2)P<0.05,3)P<0.01;與B組相比,4)P<0.01。

2.4 不同培養(yǎng)條件葡萄糖培養(yǎng)及藥物干預(yù)對(duì)HUVECs PKCβ1蛋白表達(dá)的影響 與N組相比，W組和B組細(xì)胞PKCβ1蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，且B組與W組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；應(yīng)用LY333531阻斷后，WL組和BL組PKCβ1蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.01)；應(yīng)用TMP和MH干預(yù)后，PKCβ1蛋白表達(dá)不同程度下降(P<0.05或P<0.01)，且作用與LY333531相似。詳見圖3。

注：與N組相比，*P<0.05，**P<0.01；與W組相比，

#P<0.05，##P<0.01；與B組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

圖3各組細(xì)胞PKCβ1蛋白表達(dá)水平的比較

3 討 論

川芎嗪是從傘形科藁本屬植物川芎中提取的生物堿—四甲基吡嗪，是川芎的有效成分之一。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：川芎嗪具有保護(hù)血管內(nèi)皮、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化應(yīng)激等多種心腦血管藥理學(xué)作用，廣泛應(yīng)用于閉塞性心腦血管疾病、糖尿病、腫瘤等多種疾病的治療[7，10]。血管內(nèi)皮功能損傷是糖尿病血管病變發(fā)生發(fā)展的前提和基礎(chǔ)[11-12]。血糖波動(dòng)被認(rèn)為是糖尿病血管病變的重要危險(xiǎn)因素之一，與血管并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。

本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡方法評(píng)價(jià)血糖波動(dòng)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果表明，高糖狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率顯著上升，而且在波動(dòng)高糖狀態(tài)下表現(xiàn)得更為明顯。提示，血糖波動(dòng)性的增加具有加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷的效應(yīng)。同時(shí)，應(yīng)用LY333531阻斷PKCβ1表達(dá)以及川芎嗪和二甲雙胍干預(yù)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率均顯著下降。提示，PKCβ1在波動(dòng)高糖損傷內(nèi)皮過程中具有重要作用，而藥物干預(yù)具有顯著拮抗波動(dòng)高糖內(nèi)皮損傷的作用，且與PKCβ1抑制劑的作用相似。

炎癥因子和黏附分子的分泌和釋放在糖尿病血管病變中具有重要作用[13]。TNF-α主要由單核/巨噬細(xì)胞分泌，是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子。作為前炎癥因子，參與包括糖尿病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生和病情演變，并直接參與血管病變的病理過程[14]。ICAM-1(CD54)是細(xì)胞間黏附分子的一種，屬于免疫球蛋白超家族，在炎癥細(xì)胞黏附、聚集中發(fā)揮重要作用。正常情況下，sICAM-1在內(nèi)皮細(xì)胞處于低表達(dá)水平，但在白細(xì)胞介素-1(IL-1)、TNF-α和LPS等炎癥介質(zhì)刺激后表達(dá)急劇增加，參與白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附及向血管外遷移、黏附心肌細(xì)胞和釋放細(xì)胞毒的過程。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致糖尿病內(nèi)皮損傷的重要原因[15-16]。晚期氧化蛋白產(chǎn)物是氧化應(yīng)激過程中生成的一類含雙酪氨酸的蛋白交聯(lián)物，既能反映機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，還可起到炎癥遞質(zhì)的作用[17]。總抗氧化能力是機(jī)體酶性和非酶性抗氧化物整體水平的具體體現(xiàn)，能反映機(jī)體抗氧化酶的活力以及抗氧化系統(tǒng)所處的功能狀態(tài)[18]。本研究結(jié)果顯示：高糖刺激能顯著促使內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α、sICAM-1的合成增多，并顯著誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞過氧化產(chǎn)物的生成及抗氧化能力的下降，而波動(dòng)高糖效應(yīng)更加明顯。應(yīng)用PKCβ1抑制劑干預(yù)可顯著逆轉(zhuǎn)血糖波動(dòng)造成的損傷。應(yīng)用川芎嗪和二甲雙胍干預(yù)均具有顯著抗炎、抑制細(xì)胞黏附、拮抗氧化的效應(yīng)，且與PKCβ1抑制劑的作用相似。

既往研究表明，PKC在糖尿病病人中處于持續(xù)的活化狀態(tài)，同時(shí)參與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展[19]。Quagliaro等[20]應(yīng)用間斷性高血糖(5 mmol/L和20 mmol/L)培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞2 周后發(fā)現(xiàn)PKC活化具有加重波動(dòng)高糖損傷內(nèi)皮的作用，而其亞型PKCβ1在該過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。本研究中，測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞中PKCβ1蛋白表達(dá)情況，并運(yùn)用LY333531對(duì)其進(jìn)行了阻斷，發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。應(yīng)用川芎嗪和二甲雙胍干預(yù)均可顯著抑制PKCβ1蛋白表達(dá)。提示川芎嗪拮抗波動(dòng)高糖內(nèi)皮損傷效應(yīng)與其顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞PKCβ1過表達(dá)有關(guān)。

綜合本研究可以看出，波動(dòng)性高血糖加重人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用與其能夠誘發(fā)PKCβ1過度表達(dá)密切相關(guān)；川芎嗪對(duì)波動(dòng)性高血糖狀態(tài)下的血管內(nèi)皮功能具有顯著保護(hù)效應(yīng)，其機(jī)制與其抑制PKCβ1的過表達(dá)進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。此外，本研究結(jié)果也提示川芎嗪在防治糖尿病血管并發(fā)癥中具有一定的應(yīng)用前景，但仍有待進(jìn)一步臨床研究驗(yàn)證。

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(本文編輯郭懷印)

Tetramethylpyrazine Ameliorates High Blood Glucose Fluctuations Induced-human Umbilical Vein Endothelial Cell Injury by Regulating PKCβ1Expression

Wang Jingshang，Huang Ye，Yin Huijun，Sun Mingyue，Shi Ying

Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital，Capital Medical University，Beijing 100026，China Corresponding Author：Huang Ye (Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing，China)

ObjectiveTo investigate the effects of Tetramethylpyrazine (TMP) on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) injury induced by high blood glucose fluctuations and the PKCβ1expression.MethodsHUVECs were incubated for 8 days in media containing different glucose concentrations：5.56 mmol/L (normal glucose，N)，25 mmol/L (constant high glucose，W)，or a daily alternating 5.56 or 25 mmol/L glucose (fluctuant high glucose，B).LY333531 (200 nmol/L) was pretreated on W group (WL) and B group (BL)，respectively.Meanwhile，B group were treated with tetramethylpyrazine hydrochloride (500 μmol/L) and metformin hydrochloride (1 mmol/L)，respectively，which were called as TMP group and MH group.Cell apoptosis was measured by flow cytometry.The concentrations of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)，soluble intercellular adhesion molecule-1 (sICAM-1)，AOPP and total antioxidant capacity (T-AOC) in the cell culture supernatant were measured by ELISA method.The expression of protein kinase C (PKC) β1in HUVECs was measured by Western blot.ResultsIn comparison with N group，cell apoptosis rate (mainly late apoptosis)，levels of TNF-α，sICAM-1 and AOPP，the expression of PKCβ1in W group and B group were all significantly increased (P<0.05 or P<0.01)，whereas T-AOC was significantly decreased (P<0.01)，all especially in B group (P<0.05 or P<0.01).Pretreated with LY333531，cell apoptosis rate，levels of TNF-α，sICAM-1 and AOPP，as well as the expression of PKCβ1，were all significantly decreased (P<0.05 or P<0.01)，meanwhile T-AOC was significantly increased (P<0.05 or P<0.01).TMP and MH manifested the similar protective effects as LY333531.ConclusionHigh blood glucose can induce HUVEC injury obviously，which is closely related to PKCβ1over-expression.Tetramethylpyrazine can protect HUVECs suffering fluctuant high glucose obviously，and the protective mechanism of which is closely related to its effects of relieving vessel stress，alleviating inflammatory reaction and inhibitory effect on the expression of PKCβ1.

human umbilical vein endothelial cells injury；tetramethylpyrazine；high blood glucose fluctuations；protein kinase Cβ1；tumor necrosis factor-alpha；soluble intercellular adhesion molecule-1

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(No.81202777)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81573803)

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院(北京 100026)；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)

黃燁，E-mail：yellow_926@126.com

信息：王景尚，黃燁，殷惠軍，等.川芎嗪調(diào)控PKCβ1減輕波動(dòng)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(16)：1969-1973.

R587 R285.5

：Adoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2017.16.006

：1672-1349(2017)16-1969-05

2017-01-26)