王全智+魏躍

摘要：為了建立草莓品種紅顏（Fragaria×ananassa Duch. Benihoppe）的高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因體系，以草莓紅顏組培苗的葉片作為試驗材料，對影響基因的因子進(jìn)行優(yōu)化，獲得穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)基因體系。結(jié)果表明，農(nóng)桿菌菌液D600 nm=0.4、侵染時間20 min、培養(yǎng)3 d后草莓抗性芽誘導(dǎo)率較高。用350 mg/L羧芐青霉素（carbenicillin，簡稱Cb）作為抑菌抗生素能夠有效抑制農(nóng)桿菌而不傷害草莓葉片；用20 mg/L卡那霉素（kanamycin，簡稱Kan）作為篩選抗生素能夠盡可能多的去除非抗性芽。熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，草莓FaCBL1基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入草莓基因組中。

關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌；草莓；FaCBL1基因；轉(zhuǎn)化

中圖分類號： S668.401文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0039-03

E-mail：1109238212@qq.com。八倍體栽培草莓品種紅顏（Fragaria×ananassa Duch. Benihoppe）是由日本引入我國栽培的優(yōu)良品種，該品種果實果形正，鮮食口感好，豐產(chǎn)性好，品質(zhì)優(yōu)良，適于設(shè)施栽培，目前已經(jīng)成為我國栽培面積較大的一個品種，尤其是在江、浙地區(qū)，栽培面積較大，占草莓總栽培面積的50%以上。但是由于該品種耐儲性差，貨架期短，而且該品種抗病性差，育苗過程極易感染炭疽病，成苗率低，設(shè)施栽培過程中容易感染白粉病和灰霉病。因此，亟待對該品種進(jìn)行改良，而傳統(tǒng)的育種方法周期長，見效慢。近年來，由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物品種改良中的廣泛應(yīng)用，也有多項關(guān)于草莓基因改良的報道。因此，用分子育種的方法改良草莓基因在未來草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中是一條必經(jīng)之路，能夠為草莓分子育種開辟一條新途徑，對紅顏草莓的推廣種植和提高紅顏草莓生產(chǎn)的經(jīng)濟效益有重要的意義。

鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白（calcineurin B-like，簡稱CBL）是在植物抗逆中起著重要作用的一類基因家族。其中CBL1基因在抗逆以及果樹果實發(fā)育、品質(zhì)形成等方面都有重要的作用[1]。而草莓果實的發(fā)育是果樹學(xué)科研究的重要問題之一，研究草莓果實成熟發(fā)育對培育草莓優(yōu)良品種有重要意義，因此，研究草莓FaCBL1基因在草莓果實發(fā)育中的作用及其功能是未來草莓分子生物學(xué)研究中的一條重要途徑[2]。而基因功能的驗證有賴于一個高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。因此，建立一個高效穩(wěn)定的FaCBL1基因遺傳轉(zhuǎn)化體系，能夠為探討逆境相關(guān)基因在果實發(fā)育中的作用奠定一個良好的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗選用草莓品種紅顏組培苗，由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)園藝系組織培養(yǎng)實驗室保存。組培苗在MS+0.5 mg/L BA+0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)備用。取草莓葉片剪去葉尖和葉緣，將葉片剪成3 mm×3 mm的葉塊備用。

1.2菌株、載體和基因

本試驗所用農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是GV3101，由江蘇現(xiàn)代園藝工程技術(shù)中心實驗室保存。GV3101含有植物表達(dá)載體pK7WG2D，該載體上含有的目的基因是FaCBL1基因，并帶有β-葡糖苷酸酶基因（GUS）和卡那霉素（Kan）抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（nptⅡ）。

1.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

共培養(yǎng)培養(yǎng)基（G1）：MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA；篩選培養(yǎng)基（G2）：MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+20 mg/L Kan+350 mg/L Cb；伸長培養(yǎng)基（G3）：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+20 mg/L Kan+350 mg/L Cb；生根培養(yǎng)基（G4）：MS+0.1 mg/L IBA+25 mg/L Kan+300 mg/L Cb。所有培養(yǎng)基中均附加瓊脂7 g/L、蔗糖30 g/L。培養(yǎng)條件為光—暗周期16 h—8 h，光照度2 000～3 000 lx，溫度23～25 ℃。培養(yǎng)55 d后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.4轉(zhuǎn)基因方法

1.4.1農(nóng)桿菌的培養(yǎng)將保存的菌轉(zhuǎn)移到附加100 mg/L壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，長出單菌落后，挑取單菌落放于附加100 mg/L壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液D600 nm為0.8～1.2，室溫下 5 000 r/min 離心10 min，收集菌體并用新鮮的MS液體培養(yǎng)基活化菌體。

1.4.2葉片轉(zhuǎn)化方法首先將葉片剪到新鮮的MS液體中，剪好后放在活化好的液體菌液中侵染，侵染以后的葉片用無菌濾紙吸干表面殘留的菌液后接種于G1培養(yǎng)基上共培養(yǎng)。共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)入G2篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)和再生，28 d后更換1次新的篩選培養(yǎng)基，待抗性芽長出后，將抗性芽轉(zhuǎn)入G3伸長培養(yǎng)基上生長，40 d后，將抗性芽從莖基部切下，轉(zhuǎn)入G4生根培養(yǎng)基上生根，獲得完整的抗性苗。

1.4.3植物篩選抗生素濃度的確定將葉片分別接種于含有Kan濃度為10、15、20、25 mg/L的G1培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng) 14 d 后轉(zhuǎn)至光下再培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計葉片褐化率、愈傷形成率和不定芽再生率，確定最適的Kan濃度。

1.4.4抑制農(nóng)桿菌抗生素濃度的選擇將共培養(yǎng)后的葉片分別接種于含有Cb濃度為200、350、500 mg/L的G1培養(yǎng)基上，經(jīng)暗培養(yǎng)14 d，篩選培養(yǎng)至40 d后，觀察農(nóng)桿菌的抑菌程度并確定最適的Cb濃度。

1.4.5菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間的優(yōu)化選擇培養(yǎng)菌液的D600 nm分別設(shè)為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6；葉片的浸染時間分別設(shè)為10、15、20、25、30 min；共培養(yǎng)時間分別設(shè)為1、2、3、4、5 d；確定最佳的菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間。endprint

1.5評價指標(biāo)與數(shù)據(jù)調(diào)查

用GUS基因的瞬時表達(dá)率來選擇最佳的菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間。GUS瞬時表達(dá)率=（顯示藍(lán)色的葉片數(shù)/所剪的總?cè)~片數(shù)）×100%。

1.6轉(zhuǎn)FaCBL1基因草莓植株的檢測

1.6.1檢測方法

1.6.1.1GUS染色轉(zhuǎn)化過程中獲得的抗性芽長出葉片后，剪取3 mm×3 mm的葉塊裝于含GUS染色液的離心管中，于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行GUS組織染色，16～24 h后取出葉片，用70%乙醇脫色，至葉片中的葉綠素完全脫除為止。葉綠素脫除干凈后，葉片顯示藍(lán)色的為轉(zhuǎn)基因植株，顯示白色的為非轉(zhuǎn)基因植株。

1.6.1.2熒光定量PCR檢測提取轉(zhuǎn)基因植株和對照植株總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，簡稱RT-qPCR）的方法，檢測基因的相對表達(dá)量。相關(guān)基因和內(nèi)標(biāo)Actin基因RT-qPCR擴增的總反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL SYBR premix Ex Taq混合液，2 μL cDNA，1 μL上游引物（10 μmol/L），1 μL下游引物（10 μmol/L），6 μL無核酸污染的滅菌水。反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性2 min，94 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，每次循環(huán)的第3步進(jìn)行熒光采集。最后從 60 ℃ 升溫至95 ℃，每隔30 s上升0.5 ℃，共71個循環(huán)。檢測其熒光值，繪制熔點曲線。標(biāo)準(zhǔn)品cDNA和待測樣品均設(shè)置3次重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1卡那霉素濃度對草莓轉(zhuǎn)化的影響

轉(zhuǎn)基因植物篩選抗生素的濃度應(yīng)當(dāng)是在不傷害植物本身的情況下能夠長愈傷，而不能夠誘導(dǎo)過多的芽，因此葉片接種于不同濃度Kan的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后，需要統(tǒng)計葉片的黃化率和白化率。隨著培養(yǎng)基中Kan濃度的增加，外植體失綠、黃化、皺褶、壞死的現(xiàn)象加重，當(dāng)Kan濃度達(dá)到30 mg/L時，外植體黃化，而且沒有再生芽，可見Kan對轉(zhuǎn)化外植體再生率有很大影響。由圖1可知，在Kan濃度為20 mg/L時，葉片褐化率達(dá)到75%，有一定數(shù)量的愈傷組織形成，但是有少量不定芽生成。因此，Kan濃度達(dá)到20 mg/L時能夠部分抑制草莓不定芽的再生，可作為草莓轉(zhuǎn)基因過程中植物篩選抗生素Kan的最佳濃度。

2.2羧芐青霉素濃度對草莓轉(zhuǎn)化的影響

本試驗使用轉(zhuǎn)基因中常用的Cb抗生素抑制農(nóng)桿菌，Cb對草莓的再生會產(chǎn)生一定的影響。低濃度的Cb在轉(zhuǎn)基因初期一般都能夠抑制大部分農(nóng)桿菌的生長，但在后期移至光下培養(yǎng)時不能夠很好地抑制農(nóng)桿菌的生長。本試驗中，在Cb濃度為350 mg/L時可以完全抑制農(nóng)桿菌的生長，而且對草莓外植體的再生率影響不大。因此，可以用選用Cb濃度為 350 mg/L 作為抑制培養(yǎng)基中農(nóng)桿菌生長的最佳濃度。

2.3菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間的選擇

由圖2可知，菌液D600 nm在0.1～0.4之間時，隨D600 nm的增加，GUS瞬時表達(dá)率隨之上升；在D600 nm=0.4時，GUS瞬時表達(dá)率最高。菌液濃度過高會導(dǎo)致葉片切口處褐化，外植體容易死亡；濃度過低農(nóng)桿菌數(shù)目不足，會使轉(zhuǎn)化效率降低。因此，D600 nm=0.4時菌液濃度為最佳。

由圖3可知，隨侵染時間的增加，GUS瞬時表達(dá)率隨之上升，侵染外植體20 min時，GUS瞬時表達(dá)率達(dá)到最高值。侵染時間過長，外植體容易褐化變爛。因此，最佳侵染時間選為20 min。

由圖4可知，外植體在共培養(yǎng)2 d時開始有GUS瞬時表達(dá)，隨著共培養(yǎng)時間的加長，GUS瞬時表達(dá)率逐漸升高，但是在共培養(yǎng)4 d時農(nóng)桿菌的生長已經(jīng)很難被抑制。因此，以共培養(yǎng)3 d為最佳。

2.4抗性芽的伸長、生根

將生長健壯的抗性芽轉(zhuǎn)入伸長培養(yǎng)基中，抗性芽能很好地長大、增殖。將增殖的抗性苗分株，單株放入生根培養(yǎng)基中可以正常生根，生根率達(dá)到90%以上。

2.5轉(zhuǎn)基因植株的GUS組織化學(xué)染色檢測

通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)FaCBL1基因轉(zhuǎn)紅顏草莓，共獲得8株轉(zhuǎn)基因植株，其中5株GUS陽性植株，GUS染色鑒定的部分結(jié)果如圖5所示。

2.6轉(zhuǎn)基因草莓植株的熒光定量PCR檢測

對GUS染色為陽性的5株草莓轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行熒光定量PCR檢測。提取PCR陽性植株和陰性對照植株的總RNA，以其為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第1鏈為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴增。由圖6可知，5個轉(zhuǎn)基因株系的FaCBL1基因與對照相比都有較高的表達(dá)量，且均高于對照，說明基因已經(jīng)完全轉(zhuǎn)入草莓中。

3討論

草莓作為一種兼具觀賞和高營養(yǎng)價值的水果，目前在國內(nèi)外的種植面積日益增加。尤其在我國，隨著觀光農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展，種植草莓將會是我國觀光農(nóng)業(yè)發(fā)展的一項重要經(jīng)濟收入。目前，我國江、浙、滬地區(qū)的城郊已經(jīng)開始大面積種植草莓，集觀光旅游于一體，還能夠增加農(nóng)民的收入。

基因工程的不斷發(fā)展為草莓育種提供了新的技術(shù)手段，可以針對草莓栽培中不能夠解決或者難以解決的問題有目的地對草莓進(jìn)行基因改良，而不改變草莓原有的特性。目前在草莓的轉(zhuǎn)基因中，最常用的方法就是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，這個方法操作較為簡單，但是轉(zhuǎn)化效率低、轉(zhuǎn)化重復(fù)性差。本試驗通過轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化，建立了一個高效穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)化體系，對影響遺傳轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行了優(yōu)化。

基因轉(zhuǎn)化中要使用選擇性抗生素有效地篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞。本試驗中所用的載體上帶有的篩選基因標(biāo)記是Kan，關(guān)于Kan的濃度已經(jīng)有許多的研究報道[3-4]，在草莓的遺傳轉(zhuǎn)化中Kan的濃度一般在20～30 mg/L之間[5]，本試驗中選擇Kan的最佳濃度為20 mg/L。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法中為了抑制農(nóng)桿菌常用Cb作為抑菌性抗生素，本試驗對3種Cb濃度作了比較，結(jié)果表明，使用 350 mg/L Cb可以有效抑制農(nóng)桿菌的生長而對外植體造成的傷害不大。這與其他研究者得出的結(jié)論[6-8]不同，可能是由于菌株不同或者菌株活性不同，所用抗生素種類以及濃度也有所不同[9]所致。endprint

菌液的濃度和侵染時間對遺傳轉(zhuǎn)化有很大的影響，菌液濃度過高，對植物材料的毒害較大，容易導(dǎo)致外植體褐化、壞死，而且后期用抑菌抗生素除菌也很困難；菌液濃度過低，農(nóng)桿菌數(shù)目不多，侵染能力較弱，轉(zhuǎn)化效率也就降低，因此要選擇適宜的菌液濃度才能有效地提高轉(zhuǎn)化效率。侵染時間過長容易導(dǎo)致外植體中毒死亡，侵染時間太短，農(nóng)桿菌不能充分被受傷細(xì)胞吸收，轉(zhuǎn)化效率較低，因此，掌握好侵染時間有助于提高遺傳轉(zhuǎn)化率。本試驗結(jié)果表明，D600 nm=0.4時的菌液濃度侵染外植體20 min效果最佳，這與張紅梅等的結(jié)論[10-13]一致。

本試驗通過優(yōu)化一系列的轉(zhuǎn)化條件，建立起一個穩(wěn)定有效的轉(zhuǎn)基因體系，能夠為今后草莓的基因改良提供借鑒。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔣天梅，殷學(xué)仁，王平，等. 乙烯調(diào)控非躍變型果實成熟衰老研究進(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報，2011，38（2）：371-378.

[2]張勇，湯浩茹，羅婭，等. 草莓FaCBF1基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報，2014，41（2）：240-248.

[3]張志宏，吳祿平. 草莓主栽品種Tudla遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，1998，6（2）：200-204.

[4]金萬梅，尹淑萍，魯韌強，等. GO基因?qū)Σ葺z傳轉(zhuǎn)化及抗病性鑒定[J]. 分子植物育種，2005，3（6）：797-800.

[5]秦永華，張上隆. 草莓轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J]. 遺傳，2007，29（2）：150-156.

[6]Mathews H，Wagoner W，Kellogg J，et al. Genetic transformation of strawberry：stable integration of a gene to control biosynthesis of ethylene[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，1995，31（1）：36-43.

[7]Oosumi T，Gruszewski H A，Blischak L A，et al. High-efficiency transformation of the diploid strawberry （Fragaria vesca） for functional genomics[J]. Planta，2006，223（6）：1219.

[8]Barceló M，Elmansouri I，Mercado J A，et al. Regeneration and transformation via Agrobacterium tumefaciens of the strawberry cultivar Chandler[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1998，54（1）：29-36.

[9]金建鳳，高強，陳勇，等. 轉(zhuǎn)移擬南芥CBF1基因引起水稻植株脯氨酸含量提高[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志，2005，27（1）：73-76.

[10]張紅梅，王俊麗. “全明星”草莓葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 生物技術(shù)，2005，15（3）：68-70.

[11]王俊麗，葛會波，彭士琪，等. 草莓外源LEAS基因的導(dǎo)入[J]. 園藝學(xué)報，2003，30（3）：322-324.

[12]張志宏，吳祿平，代紅艷，等. 草莓主栽品種再生和轉(zhuǎn)化的研究[J]. 園藝學(xué)報，2001，28（3）：189-193.

[13]那杰，王關(guān)林，夏然，等.endprint