裴杰 褚敏 包鵬甲 閻萍 郭憲

（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所 甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，蘭州 730050）

乳鐵蛋白抗菌機理研究進展

裴杰 褚敏 包鵬甲 閻萍 郭憲

（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所 甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，蘭州 730050）

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是發(fā)現(xiàn)于哺乳動物初乳中具有多種生物活性的單體糖蛋白，對幼體初期免疫具有重要作用。前人研究發(fā)現(xiàn)LF蛋白的酶解后其抗菌活性得到增強，是由于酶解后產(chǎn)生了比其本身抗菌能力更強的肽段。目前關于LF蛋白抗菌活性的報道很多，但其抗菌的具體分子機制尚不清楚。以LF蛋白與細菌細胞膜的結合能力和LF蛋白酶解產(chǎn)物的抗菌活性為切入點，揭示了LF蛋白行使抗菌功能的過程，認為LF蛋白與細菌表面相結合而發(fā)生結構變化，進而暴露出敏感的酶切位點，經(jīng)酶解而釋放抗菌活性肽，這些抗菌肽破壞細菌的細胞膜結構，達到抑菌或殺菌的目的。對LF蛋白抗菌機理的闡釋將為研制抗菌能力更強的活性蛋白提供理論依據(jù)。

乳鐵蛋白；抗菌活性；抗菌肽；膜結合

哺乳動物出生后，由于其獲得性免疫的防御系統(tǒng)并不成熟和完善，對外界病原微生物的抵抗能力非常弱，因此從初乳中獲得抗病原微生物的活性蛋白，便成了其對抗疾病侵襲的主要防御手段。乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是發(fā)現(xiàn)于動物初乳中具有廣譜抗菌能力的單體糖蛋白，在初乳中的含量是常乳的十幾倍甚至幾十倍［1］，這種高濃度的蛋白表達對新生動物的天然免疫具有重要作用。LF蛋白和其酶解肽段具有普通抗生素所不具備的一系列優(yōu)點，包括具有廣譜抗菌、抗病毒、抗真菌和抑殺腫瘤細胞的功能，對動物細胞幾乎沒有毒性，不含稀有氨基酸和外源化學成分［2］。另外，抗菌肽不具有固定的抗菌模式，這使致病菌不易針對其抗菌作用機制產(chǎn)生耐藥性。以上優(yōu)點顯示了LF蛋白替代抗生素的巨大潛能，使它被認為是一種新型的抗菌、抗病毒、抗癌藥物和極具開發(fā)潛力的食品和飼料添加劑。

本文對近年來LF蛋白的抗菌研究進行了歸納和總結，以LF蛋白的膜結合能力和LF蛋白酶解產(chǎn)物的抗菌活性為切入點，對LF蛋白的抗菌機理進行深入探討。對LF蛋白抗菌機理的剖析將使我們更為深入的了解LF蛋白及其抗菌肽的構效關系，根據(jù)這些LF蛋白分子結構信息，可以人為的設計出抗菌功能更強的活性蛋白，為進一步開發(fā)新型的抗菌類藥物奠定理論基礎。

1 LF蛋白概述

LF蛋白是一種分子質量為80 kD左右的鐵結合糖蛋白，產(chǎn)生于約1.25億年前胎盤類動物和有袋類動物分化之時，因與轉鐵蛋白有較高的同源性而被歸于轉鐵蛋白家族，是轉鐵蛋白家族中最年輕的成員［3］。LF蛋白廣泛存在于外分泌液（乳汁、唾液、淚液、鼻分泌物）、血漿、羊水、子宮分泌物、尿液和中性粒細胞中，以初乳中含量最高［1］。研究發(fā)現(xiàn)，LF蛋白具有多種生物學功能，包括廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤［4］作用，并且與體內(nèi)的許多重要生理過程有關，如能調節(jié)體內(nèi)鐵的平衡、調節(jié)骨髓細胞生成、促進細胞生長、調節(jié)機體免疫功能、增強機體抗病能力、抗高血壓活性、與多種抗生素及抗真菌制劑協(xié)同作用［5-7］。

LF蛋白由兩個對稱的N-葉和C-葉組成，兩葉間在氨基酸序列上有顯著的同源性，每葉又分別由兩個結構域構成（圖1），每一葉可以結合一個Fe3+離子，每個鐵結合部位由4個氨基酸殘基組成。LF蛋白表面帶有大量的正電荷（圖1），這種特征有利于其與帶負電的細胞膜相結合。在大多數(shù)細胞中，LF蛋白以無鐵的形式（apo-LF）被分泌到胞外，當與過量的三價鐵離子結合后變成鐵飽和LF蛋白（holo-LF）。人類LF蛋白有多個表達后修飾位點，如磷酸化［9］和N-聚糖修飾［10］，這些修飾可能使LF蛋白免受水解酶作用和參與受體識別［11］。

圖1 LF蛋白的二級結構和表位電荷分布［8］

2 LF蛋白的抗菌途徑

作為抑菌劑的LF蛋白具有廣譜性，即能抑制革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌（Escherichia coli）、幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）、克雷白氏桿菌（Klebsiella）、沙門氏菌（Salmonella）和志賀氏菌（Shigella）等，又對革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和單增李斯特菌（Listeria monocytogens）具有抗菌作用［12-13］。

不同狀態(tài)下LF蛋白具有不同的抗菌能力［14］，而且基因工程表達的LF蛋白也具有與天然狀態(tài)相似的抗菌活性［15］。對不同物種的LF蛋白抗菌活性的研究顯示，牛LF蛋白的抗菌能力在哺乳動物中是最強的［16］。LF蛋白主要通過鐵剝奪、膜滲透和酶抑制3種途徑發(fā)揮抑菌作用［6，17］，但其具體抗菌行使的分子機制尚不明確，具體作用方式如下：（1）鐵剝奪是LF蛋白最基本的抑菌機制。不飽和LF蛋白具有極強的鐵結合性，它可以與病原性微生物競爭性地結合鐵離子，使病原性微生物因失去生長所需的基本元素鐵而停止生長甚至死亡；或使微生物由于缺乏鐵離子而不能形成致病性生物膜，降低細菌濃度，減少發(fā)病率［18］。（2）膜滲透的產(chǎn)生機制是LF蛋白依靠本身帶有的正電荷與革蘭氏陽性菌細胞壁上的磷壁酸（Lipoteichoic acid，LTA）或革蘭氏陰性菌的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）產(chǎn)生靜電吸引，破壞微生物細胞膜的正常生理功能、通透性增加和脂質雙分子層破壞，增加細胞膜通透性，使細菌脂多糖滲出，造成內(nèi)容物流失而達到殺死病原菌的目的［17，19］。LF蛋白這種殺菌作用還可能與LF蛋白結合鈣、鎂離子的能力有關［20］。（3）酶抑制機制是LF蛋白通過其蛋白酶活性降解一些細菌毒力因子或黏附蛋白，降低病原體結合和侵入哺乳動物細胞的幾率。LF蛋白表面所攜帶的堿性高密度電荷，很容易與細菌或宿主細胞的一些生物分子發(fā)生非特異性結合，如LF蛋白可以與雙岐桿菌和假單胞菌屬細胞膜上的結合蛋白相結合，從而降低細菌的感染力［21］。

鐵剝奪可以通過對鐵離子的剝奪而抑制細菌的生長，酶抑制可以減少細菌對宿主的侵染和減弱毒性分子的毒力，真正可以直接導致細菌的死亡的還是其膜滲透的抗菌途徑，也是LF蛋白行使抗菌能力的主要途徑。由于膜滲透抗菌活性行使的前提是LF蛋白必須首先與細菌的細胞膜結合，LF蛋白的表位與細菌的膜表面特征對這種結合起著至關重要的作用。

3 LF蛋白與細菌細胞膜的結合能力

研究表明，LF蛋白與多種病原微生物的細胞膜表面存在相互作用，這種膜結合能力是由LF蛋白與細菌膜上不同組分的親和力所決定的［22］。由于病原微生物的細胞膜由多種組分構成，其中最主要的有脂質、脂多糖和膜蛋白，我們分別對這些組分與LF蛋白的作用進行探討。

3.1 LF蛋白與細菌細胞膜上脂質的作用

體外實驗顯示，當缺少胃蛋白酶時，LF蛋白不能被降解為小的肽段，它通過靜電作用與脂肪乳劑的磷脂界面結合，有穩(wěn)定脂滴的作用。LF蛋白和其酶解釋放的抗菌肽Lfcin都可以抑制引起牙周炎的牙齦卟啉單胞菌和中間普雷沃菌的生長，但只有LF蛋白可以通過與膜上脂質的相互作用而抑制這兩種菌細胞膜的形成［23］。LF蛋白還可以通過鐵螯合作用使綠膿桿菌的胞膜變得不穩(wěn)定［24］，進而可以增加綠膿甲單胞菌的通透性，與木糖醇共同作用可以在一定程度上破壞細胞膜的結構，進而降低綠膿甲單胞菌的生存能力［25］。

3.2 LF蛋白與細菌脂多糖作用

革蘭氏陰性菌的外膜是含有大量的脂多糖（在沙門氏菌和大腸桿菌中的含量分別為3/16和7/19），LF蛋白便可以與這些脂多糖相結合，利用這種結合能力使大腸桿菌和鼠沙門氏菌的脂多糖從胞膜上釋放［26］。通過抗原表位在空間上較遠的兩個抗體的免疫結合實驗顯示，LF蛋白對革蘭氏陰性菌的脂多糖和脂質A具有結合能力，兩者具有空間上相近的結合位點，并且對脂質A的結合能力大于脂多糖［27］。LF蛋白的這種結合往往是通過其自身表位上的肽段實現(xiàn)的，如其多肽片段LF11與脂多糖通過靜電力和疏水力相互作用，這種作用可以減弱脂多糖對機體的刺激［28］。

3.3 LF蛋白與細菌膜蛋白的結合

除了與脂質和脂多糖的相互作用外，通過細菌表面的結合蛋白也是LF蛋白與膜結合的重要作用方式。這種與細菌細胞膜的結合方式在多種細菌中得到體現(xiàn)，如LF蛋白與甲單胞菌細胞表面的LF結合蛋白相結合，這種結合對細菌的生長起抑制作用［29］。晶體結構分析顯示，帶負電荷肺炎球菌的表面蛋白PspA的N端螺旋結構可以與LF蛋白的N葉帶正電荷的部分相結合［30］，這種結合阻礙了抗菌肽進入胞膜而對細菌的殺傷作用［31］。LF蛋白對溶血性曼氏桿菌有殺菌作用，通過覆蓋檢測法和雙向電泳分析發(fā)現(xiàn)LF蛋白可以結合于溶血性曼氏桿菌的兩個外膜蛋白OmpA和孔蛋白，這兩個LF結合蛋白在菌體內(nèi)可以與兩種狀態(tài)的LF蛋白（缺鐵LF蛋白和鐵飽和LF蛋白）相結合［32］。另外，奈瑟氏菌的LF蛋白結合蛋白A和B結合于LF蛋白的C葉，它可能通過這種結合來獲得鐵離子［33-34］。

3.4 LF蛋白糖基化對膜結合能力的影響

LF蛋白的翻譯后修飾同樣對其活性起著非常重要的作用，如糖基化［10，35-36］和酰胺化［37］。關于牛LF蛋白糖基化位點存在不同的報道。Baker等［38］認為牛LF蛋白有4個糖基化位點，分別在第233、368、76、545位的天冬酰胺，而Yu［36］報道牛LF蛋白只有第138和479位的天冬酰胺被糖基化。這種糖基化的變化可能因不同泌乳期各種糖基轉移酶的表達量不同所決定［39］。天然狀態(tài)下的人LF蛋白和轉基因牛奶中得到的人LF蛋白存在不同的糖基化［40］，重組LF蛋白含有較多的甘露糖，較少的N-乙酰神經(jīng)氨酸和巖藻糖，有些含有乙酰半乳糖胺-乙酰氨基葡萄糖二糖。糖基化與細菌的膜結合密切相關［35］，如齦卟啉單胞菌的菌毛只能和糖基化的LF蛋白結合，只有N-乙酰半乳糖胺和巖藻糖是對結合有抑制作用的［41］。人類LF蛋白能夠阻止病原菌的粘附，LF蛋白上結合的多糖可以降低沙門氏菌對結腸上皮細胞的侵染。LF蛋白的糖基化被基因表達嚴格調控，糖基化的不同與病原菌的調節(jié)密切相關，在整個泌乳期巖藻糖轉移酶表達量升高，在泌乳第二周寡糖基轉移酶復合物表達量開始下降［10］。

LF蛋白雖然可以與多種病源菌的表面物質相結合，但其本身不能充分發(fā)揮殺菌作用，如LF蛋白影響肽聚糖的合成和/或結合于肽聚糖上的乙酰氨基葡萄糖，并且可與金黃色葡萄球菌的細胞壁相結合，影響分裂后的子細胞散播，但并不能使細菌裂解。LF蛋白抑制臨床實驗分離的綠膿桿菌細胞膜的形成，這種抑制作用與其殺菌作用不相關，因為體外實驗顯示多種細菌對LF蛋白不敏感［42］。然而，LF蛋白的酶解肽段卻可致使金黃色葡萄球菌的細胞壁變形，進而通過細胞破裂殺死細菌［43］。

4 LF蛋白酶解多肽的抗菌能力

LF蛋白降解后其抗菌活性會進一步增加，這主要是因為LF蛋白降解后產(chǎn)生多種比其本身抗菌能力更強的肽段［13］，如牛LF蛋白的胃蛋白酶水解產(chǎn)物具有比LF蛋白本身更強的抗雙歧桿菌、單核細胞增多性雙歧桿菌、李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌的抗菌能力，同時對奶酪上的假單孢菌和大腸桿菌具有明顯的抑制作用［44］。LF蛋白的N端的降解片段對耐藥性的金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌引起的感染有治療作用，主要是由于其對細菌細胞膜膜滲透的破壞作用，肽段上的前兩個R氨基酸對這種破壞作用起著至關重要的的作用［45］。

4.1 抗菌肽Lfcin

乳鐵蛋白素（Lactoferricin，Lfcin）是LF蛋白在酸性環(huán)境下經(jīng)胃蛋白酶作用，從N端釋放的一段25個氨基酸殘基的小肽。有人認為它是LF蛋白酶解產(chǎn)物中活性最強的抗菌肽。Lfcin除了不能結合鐵離子外，幾乎具備LF蛋白的所有生物學活性［46］。在LF蛋白結構內(nèi)部時，Lfcin會在其表面形成一個α-螺旋的二級結構（圖2），而當它處于水相溶液時，則主要以兩個反相平行的β-折疊結構存在（圖3）。造成這種結構的變化是因為Lfcin在疏水性分子（如脂質分子）的作用下發(fā)生了變構，由β-折疊結構變回α-螺旋結構。這種α-螺旋結構具有與細胞膜的脂質更好的親和性，因此，位于表面的Lfcin對LF蛋白的膜結合能力做出了一定的貢獻。Lfcin多肽兩親性二級結構和陽離子特性是其具有抗菌功能的基礎，主要通過與細菌胞膜結合以膜滲透的途徑發(fā)揮抗菌活性［1］。

圖2 抗菌肽Lfcin和Lfampin在LF蛋白上的位置［8］

Lfcin對病原菌的致死作用機制與抗生素的親膜特性相似，依靠其自身帶有的正電荷與革蘭氏陽性菌細胞壁上的LTA或革蘭氏陰性菌的LPS產(chǎn)生靜電吸引，使抗菌肽附著于外膜表面，然后利用疏水結構插入細胞膜，造成細胞膜脂質雙分子層結構改變，形成環(huán)狀孔道，實現(xiàn)抗菌肽跨膜進入細胞內(nèi)；或者多個抗菌肽聚合到膜區(qū)引發(fā)通道形成，增強細胞膜通透性，使細胞膜失去跨膜電荷梯度和pH梯度，或在膜上形成孔洞導致細胞內(nèi)容物流失達到殺菌目的［47］。利用熒光信號分子的實驗也證實，Lfcin可破壞大腸桿菌的細菌膜致使熒光信號分子流入，還也可以使大型脂質單層囊泡破裂造成熒光分子的釋放［48］。

圖3 Lfcin和Lfampin多肽的分子結構

4.2 抗菌肽Lfampin

Lfampin也是由LF蛋白酶解產(chǎn)生的肽段，位于LF蛋白的268-284部位氨基酸（圖2），肽段的N端形成兩親性的α-螺旋結構（圖3）［51］，帶正電荷的C端對其行使抗菌活性具有重要作用［52］。與許多抗菌相似，Lfampin含有的色氨酸和帶正電荷的氨基酸使它具有廣譜抗菌活性，并且為兩親性分子。Lfampin與細菌細胞膜也具有一定的結合能力，其C端所帶的正電荷先與細菌脂雙層膜相吸引，然后N端的螺旋結構結合于膜表面［52］。增加Lfampin的C端的正電荷氨基酸的數(shù)目可以明顯提高其抗菌活性［53］，差示掃描量熱法確定它插入膜的疏水核心區(qū)域，熒光光譜學證實多肽上的氨基酸殘基決定了肽段與磷脂雙分子層上核心疏水區(qū)的相互作用［53］。Lfampin抗菌肽進行適當?shù)娜藶楦脑炜梢赃M一步提高其抗菌能力，如由Lfcin和Lfampin抗菌肽串聯(lián)組成的LFchimera具有比兩者更強的與帶負電荷細胞膜結合的能力和抗菌活性［54-55］。

4.3 其他LF蛋白抗菌肽

除Lfcin和Lfampin多肽外，LF蛋白的酶解產(chǎn)物中還存在其它一些具有明顯抗菌活性的小肽。源于人類LF蛋白的抗菌肽HLR1r具有抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的作用，如耐甲氧金黃色葡萄球菌，同時具有抗感染的功效［56］。多肽LF11對細菌胞膜具有一定的破壞作用，去除多肽LF11的不帶電荷殘基、增加LF11多肽N端的疏水氨基酸或N端的酰化作用都可以提高其抗大腸桿菌的能力，N端酰化的LF11可以結合革蘭氏陰性菌表面的脂多糖［57］。源于LF蛋白序列的多肽L10對超廣譜β內(nèi)酰胺酶陽性的革蘭氏陰性菌和多藥耐藥性的真菌均有殺傷作用，電鏡觀察確定了L10肽段可以與兩種菌胞膜的結合，進一步研究確定它可以結合革蘭氏陰性菌的脂質A和脂多糖結合，并且對假絲酵母的細胞具有透化作用［58］。

部分LF蛋白的抗菌多肽對真菌也有一定的抑制作用，如多肽Lfpep和Kaliocin-1對白色念珠菌的細胞膜具有滲透作用，同樣Lfpep也是通過破壞生物膜結構來達到殺菌的目的［59］，LF11也可以抑制白色念珠菌生物膜的形成［60］。由LF蛋白序列衍生出的兩個肽段HLopt2和HLBD1對假絲酵母有殺傷作用，HLopt2可以使酵母的生物膜表面形成凹陷，進而破壞膜結構達到殺菌的目的［61］

5 小結

綜上所述，LF蛋白的總體抗菌活性由其膜結合能力和其酶解多肽的抗菌活性所決定，因此，作為抗菌蛋白的LF不但是潛在抗菌肽的前體，而且是膜結合功能的執(zhí)行者和降解酶的優(yōu)秀底物。在此，我們認為LF蛋白行使抗菌功能的過程是，整體LF蛋白先與細菌的細胞膜結合，這種結合能力的強弱與細菌細胞膜的組分和LF蛋白的糖基化密切相關；膜結合可以使LF蛋白發(fā)生結構改變，進而改變其對蛋白酶的敏感性；LF蛋白變構之后被酶解，產(chǎn)生出具有比LF蛋白細菌細胞膜破壞能力更強的多種抗菌肽；這些抗菌肽通過增加細胞膜的通透性使細胞內(nèi)溶物流失，最終達到殺菌的效果。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Antibacterial Mechanism of Lactoferrin

PEI Jie CHU Min BAO Peng-jia YAN Ping GUO Xian
（Key Laboratory of Yak Breeding Project in Gansu Province，Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730050）

Lactoferrin（LF）is a monomer glycoprotein in mammalian colostrum with multi biological activities，thus it plays a vital role in initial immunologic reconstitution for young mammals. Previous studies have discovered that enzymatic hydrolysates of lactoferrin have enhanced antibacterial activity compared to lactoferrin because more active antibacterial peptides were produced by the enzymolysis. At present，molecular mechanism of antibacterial function of lactoferrin is still unclear although many antibacterial activities of lactoferrin were reported. In this paper，combination of the bacterial cell membranes and the antibacterial activity of enzymatic hydrolysates were taken as the breakthrough point，and the process of LF acting in antibacterial function was explored. It was considered that the mechanism of the antibacterial function of lactoferrin was that the structure of lactoferrin changed following binding to bacterial surface，then the sensitive restriction enzyme cutting sites of lactoferrin were exposed，and many antibacterial peptides were released after enzymolysis；subsequently the peptides destroyed the membrane structures of bacterial cells，and thus the purpose of the bacteriostasis or sterilization achieved. In summary，the elucidation of antibacterial mechanism of lactoferrin provides the theoretical basis for developing active proteins with stronger antibacterial ability.

lactoferrin；antibacterial activity；antimicrobial peptide；membrane binding

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0354

2017-05-03

國家自然科學基金項目（31402034），國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉牛牦牛）產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金（CARS-37），牦牛遺傳資源與育種（CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-01）

裴杰，男，博士，研究方向：動物蛋白質結構與功能；E-mail：douglaspei@126.com

閻萍，女，博士，研究方向：動物遺傳育種與繁殖；E-mail：pingyan63@126.com郭憲，男，博士，研究方向：動物遺傳育種與繁殖；E-mail：guoxian@caas.cn