覃榮活付加芳宗工理王志宇曹廣祥

（1. 濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250022；2. 山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250062）

轉(zhuǎn)錄組分析棒狀鏈霉菌F613-1高產(chǎn)克拉維酸的分子基礎(chǔ)

覃榮活1，2付加芳2宗工理2王志宇2曹廣祥1，2

（1. 濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250022；2. 山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250062）

旨在探究S. clavuligerus工業(yè)菌株高產(chǎn)克拉維酸（CA）的分子基礎(chǔ)。采用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)菌株和高產(chǎn)CA的工業(yè)菌株F613-1之間的基因轉(zhuǎn)錄水平差異，結(jié)合菌株表型差異進(jìn)行綜合分析。結(jié)果表型比較顯示，F(xiàn)613-1在固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度、氣生菌絲形態(tài)、孢子形成等方面與標(biāo)準(zhǔn)菌株存在差異。液體搖瓶培養(yǎng)中，菌體生長(zhǎng)速度無(wú)明顯變化，但F613-1的糖消耗量顯著降低，同時(shí)CA產(chǎn)量比ATCC27064提高約11.7倍。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，F(xiàn)613-1中CA基因簇及其途徑特異性調(diào)控基因的表達(dá)量顯著升高，其副產(chǎn)物全霉素基因簇的表達(dá)量顯著下降；CA合成原料精氨酸和3-磷酸甘油醛代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著變化，精氨酸合成代謝基因上調(diào)，而3-磷酸甘油醛分解代謝基因下調(diào)；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中80多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平也發(fā)生明顯變化，其中42個(gè)顯著上調(diào)，38個(gè)顯著下調(diào)。工業(yè)生產(chǎn)菌株高產(chǎn)克拉維酸的主要原因是CA基因簇及其調(diào)控基因表達(dá)量的升高、相關(guān)副產(chǎn)物基因簇的沉默及CA合成原料精氨酸和3-磷酸甘油醛的積累。

棒狀鏈霉菌；工業(yè)菌株；轉(zhuǎn)錄組；克拉維酸

克拉維酸（Clavulanic acid，CA）是一種高效的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，廣泛應(yīng)用于臨床治療β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥菌的感染［1］。棒狀鏈霉菌（Streptomyces clavuligerus）是CA的工業(yè)生產(chǎn)菌株，但是S. clavuligerus除合成CA外同時(shí)也合成頭霉素C、全霉素和多種5S克拉維烷類(lèi)物質(zhì)，其中克拉維烷和CA具有共同的前期合成途徑，與CA競(jìng)爭(zhēng)前體物質(zhì)［2］，這些副產(chǎn)物不僅影響CA產(chǎn)量的提高同時(shí)也增加了純化工藝的難度。

S. clavuligerus ATCC27064的基因組草圖已經(jīng)完成測(cè)序［3，4］，CA的生物合成途徑和基因簇也已基本闡明［5-7］。S. clavuligerus中3個(gè)基因簇與CA合成有關(guān)，分別是CA基因簇（CA gene cluster）、克拉維烷基因簇（Clavam gene cluster）和旁系同源基因簇（Paralogue gene cluster），CA基因簇和克拉維烷基因簇位于基因組，而旁系同源基因簇位于pSCL4質(zhì)粒［8］。CA基因簇中ceaS2、bls2、pah2、cas2、oat2、oppA1、oppA2、cad、cyp、fd、gcas、orf12和orf16，克拉維烷基因簇中cas1和旁系同源基因簇中ceaS1、bls1、pah1、oat1都參與了CA的合成，cas1、ceaS1、bls1、pah1和oat1是CA基因簇中相應(yīng)基因的同源基因［9］。

CA合成分為早期途徑和晚期途徑，早期途徑以精氨酸和3-磷酸甘油醛（G3P）為起始原料，在Ceas1/Ceas2、Bls1/Bls2、Pah1/Pah2、Cas1/Cas2等酶的作用下形成中間體克拉維胺酸（Clavaminic acid），晚期途徑在Gcas、Cad、Cyp和Fd等酶的作用下將克拉維胺酸轉(zhuǎn)化為CA［9］?？死S胺酸是CA和克拉維烷合成途徑的分支點(diǎn)，部分克拉維胺酸在Gcas的催化下進(jìn)入CA晚期途徑，另一部分克拉維胺酸在Cvm1等克拉維烷合成酶的催化下形成多種5S克拉維烷產(chǎn)物［2］。CA基因簇上游緊挨著頭霉素C基因簇，研究顯示頭霉素C基因簇中ccaR編碼一個(gè)途徑特異性調(diào)控因子CcaR，正調(diào)控CA合成的早期途徑基因ceas2、bls2、pah2和cas2，以及調(diào)控基因claR，而claR正調(diào)控晚期途徑基因oppA1、cad和cyp［10，11］。

S. clavuligerus F613-1是CA的工業(yè)生產(chǎn)菌株，在發(fā)酵罐中CA發(fā)酵水平達(dá)到為4.87 g/L［12］。我們前期完成了F613-1菌株的全基因組測(cè)序［13］，對(duì)全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)比較分析顯示：與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27064相比，F(xiàn)613-1丟失了pSCL1、pSCL2和pSCL3等3個(gè)質(zhì)粒，以及pSCL4質(zhì)粒的1.1 Mb DNA序列，但是CA基因簇、克拉維烷基因簇和旁系同源基因簇中不存在大規(guī)模的基因突變和缺失現(xiàn)象，僅存在數(shù)個(gè)SNP，這些SNP可能不是F613-1高產(chǎn)CA的主要原因。本研究擬通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較分析F613-1和ATCC27064在轉(zhuǎn)錄水平的差異，分析CA合成原料精氨酸及G3P代謝相關(guān)基因、CA及其多種副產(chǎn)物合成及調(diào)控相關(guān)基因，以及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因的變化情況，以期在轉(zhuǎn)錄水平闡明F613-1高產(chǎn)CA的分子機(jī)制，為進(jìn)一步通過(guò)基因工程方法提高工業(yè)菌株CA產(chǎn)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 S. clavuligerus工業(yè)生產(chǎn)菌株F613-1和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27064。

1.1.2 培養(yǎng)條件 固體培養(yǎng)：將孢子涂布于BSCA培養(yǎng)基（含1.5%麥芽提取物、0.3%胰蛋白胨、0.4%葡萄糖、2%瓊脂粉，pH7.5）上，25℃培養(yǎng)10 d收集孢子。液體發(fā)酵培養(yǎng)：按106個(gè)/mL的接種量將孢子接種于TSB（OXOID）培養(yǎng)基中，25℃、250 r/min培養(yǎng)48 h得到種子液，然后按5%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基（2.0%大豆超細(xì)粉，1.2%玉米淀粉，0.5%酵母提取物，0.08%磷酸氫二鉀，pH8.0），25℃、250 r/min。

1.2 方法

1.2.1 固體培養(yǎng)表型比較 將F613-1和ATCC27064的孢子分別稀釋至106個(gè)/mL，各取10 μL孢子懸液劃線接種到同一個(gè)BSCA平板的兩側(cè)，25℃培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況變化。

1.2.2 發(fā)酵液總糖、還原糖和生物量測(cè)定 取培養(yǎng)好的發(fā)酵液10 mL，12 000 r/min，4℃，離心10 min，沉淀去除殘液后稱(chēng)重計(jì)算生物量，上清經(jīng)0.22 μm過(guò)濾后進(jìn)行糖含量檢測(cè)。濾液適當(dāng)稀釋后直接進(jìn)行還原糖含量檢測(cè)，總糖先經(jīng)鹽酸完全水解，然后用氫氧化鈉中和，適當(dāng)稀釋后測(cè)定糖含量。糖含量檢測(cè)采用DNS（二硝基水楊酸）比色法進(jìn)行。

1.2.3 發(fā)酵液的HPLC檢測(cè) 取1.2.2中發(fā)酵液離心獲得的上清，經(jīng)0.22 μm過(guò)濾后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。儀器為安捷倫1260，色譜柱為Diamonsil 5 μm C18（250×4.6 mm），柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，進(jìn)樣量20 μL。流動(dòng)相A為0.05 mol/L 磷酸二氫鈉（磷酸調(diào)pH至4.0），流動(dòng)相B為等體積的甲醇和流動(dòng)相A混合。洗脫條件：0-4 min為100% A；4-15 min，A由100%逐漸降至50%，B由0%逐漸提高到50%；15-18 min，保持50% A和50% B；流速1 mL/min。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析 鏈霉菌總RNA采用TRIzol（Ambion）抽提法提取，檢驗(yàn)合格后去除rRNA和片段化處理，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，連接上接頭后進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化，構(gòu)建PE100文庫(kù)。PE100文庫(kù)質(zhì)檢合格后上機(jī)測(cè)序，高通量測(cè)序采用illumina Hiseq2500平臺(tái)（廣州瑞博生物）。原始測(cè)序數(shù)據(jù)先進(jìn)行去接頭序列和低質(zhì)量序列等處理獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)，然后用參考基因S. clavuligerus ATCC27064（NZ_CM001015.1）進(jìn)行比對(duì)。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采用Tophat2軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)覆蓋區(qū)域及覆蓋深度等做綜合評(píng)估［14］；用Audics軟件對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行差異分析［15］，通過(guò)差異倍數(shù)（|log2FoldChange|>1）和顯著水平（q-value<0.001）兩個(gè)水平挑選出樣本間差異表達(dá)的基因。KEGG代謝通路分析中差異基因的顯著性閾值設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 F613-1和ATCC27064的固體培養(yǎng)表型比較

每隔24 h觀察并記錄F613-1和ATCC27064在BSCA平板上的生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明與ATCC27064相比，F(xiàn)613-1的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢速度較慢（圖1-A），在BSCA培養(yǎng)上不產(chǎn)色素而ATCC27064合成紫紅色的色素（圖1-B）。此外，F(xiàn)613-1氣生菌絲較為疏松，產(chǎn)孢（孢子為灰色）數(shù)量明顯減少（圖1-C和D），在培養(yǎng)后期易與培養(yǎng)基脫離。

圖1 F613-1與ATCC27064在BSCA培養(yǎng)基上培養(yǎng)表型對(duì)比圖

2.2 F613-1和ATCC27064的液體發(fā)酵情況比較

本研究分別收集F613-1和ATCC27064搖瓶發(fā)酵72、96、120和144 h 等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵液，分別進(jìn)行總糖、還原糖和生物量測(cè)定，并用HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中CA和非CA物質(zhì)的合成情況。結(jié)果（圖2-A）顯示，F(xiàn)613-1與ATCC27064在各時(shí)間點(diǎn)的生物量相近（數(shù)據(jù)未顯示），還原糖含量變化趨勢(shì)也無(wú)明顯差異，但F613-1的總糖消耗速度明顯降低，說(shuō)明F613-1的糖利用和轉(zhuǎn)化能力可能優(yōu)于ATCC27064。HPLC分析（圖2-B）顯示，F(xiàn)613-1發(fā)酵144 h時(shí)CA產(chǎn)量達(dá)到3.86 g/L，CA峰面積占總峰面積的67.68%，CA產(chǎn)量比ATCC27064提高了約11.7倍，CA峰面積占總峰面積的比例提高了約3.6倍，這表明F613-1的代謝流發(fā)生變化，使CA合成量增加而副產(chǎn)物合成量相對(duì)減少。

2.3 F613-1和ATCC27064整體轉(zhuǎn)錄水平比較

圖2 F613-1與ATCC27064搖瓶發(fā)酵參數(shù)對(duì)比圖

本研究收集了液體發(fā)酵72 h（CA合成高峰期）的F613-1和ATCC27064菌絲體，提取總RNA并構(gòu)建文庫(kù)，用illuminaHiseq2500 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序方式為PE100。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)量篩選，F(xiàn)613-1一共得到15 854 608個(gè)有效mRNA信息，基因覆蓋率為95.26%；ATCC27064一共得到17 798 172個(gè)有效mRNA信息，基因覆蓋率為96.11%。通過(guò)Audics軟件分析基因轉(zhuǎn)錄水平差異，從樣本間基因差異火山圖（圖3）可以看出ATCC27064和F613-1之間存在統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異。與ATCC27064相比較，F(xiàn)613-1菌株共有798個(gè)基因的表達(dá)量明顯發(fā)生改變，其中211個(gè)基因表達(dá)量顯著升高，587個(gè)基因表達(dá)量顯著下降，說(shuō)明F613-1高產(chǎn)CA的變化可能是由部分基因的轉(zhuǎn)錄水平變化引起。

2.4 CA相關(guān)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇的轉(zhuǎn)錄水平變化

圖3 F613-1和ATCC27064樣本間基因差異分析火山圖

差異分析顯示，F(xiàn)613-1中CA基因簇的大部分基因都上調(diào)了2-4倍（表1），其中CA的途徑特異性正調(diào)控基因claR上調(diào)2.83倍，CA早期途徑的關(guān)鍵合成基因cas2、pah2和bls2，以及晚期途徑的關(guān)鍵合成基因fd、cyp和cad變化最為明顯，差異倍數(shù)達(dá)到3-4倍。此外，CA基因簇上游的頭霉素C基因簇同樣也整體上調(diào)了2-4倍，其中正調(diào)控頭霉素C和CA合成途徑的ccaR基因上調(diào)2.21倍（表1）。與此同時(shí)，旁系同源基因簇整體上調(diào)2-3倍，其中與CA合成相關(guān)的基因ceaS1、pah1、bls1、oat1均上調(diào)2-3倍，但克拉維烷正調(diào)控基因cvm7P無(wú)明顯變化，而克拉維烷基因簇整體轉(zhuǎn)錄水平也無(wú)明顯變化，這可能是F613-1大量合成CA而克拉維烷水平較低的原因。全霉素合成基因整體下調(diào)4-230倍，個(gè)別基因幾乎不表達(dá)（表1），已有研究表明全霉素是CA合成的競(jìng)爭(zhēng)性途徑，說(shuō)明全霉素基因簇沉默是F613-1高產(chǎn)CA的原因之一。總體來(lái)看，F(xiàn)613-1菌株中次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇的基因表達(dá)變化使得前體物質(zhì)更多的流向CA合成途徑。

2.5 CA合成原料精氨酸和G3P代謝途徑基因的表達(dá)變化

精氨酸和G3P是CA合成途徑的兩個(gè)起始物質(zhì)?；贙EGG生物學(xué)通路數(shù)據(jù)庫(kù)的生物通路富集分析發(fā)現(xiàn)，精氨酸生物合成通路中多個(gè)基因出現(xiàn)連續(xù)上調(diào)，包括從谷氨酸鹽到鳥(niǎo)氨酸（argA、argB、argC/ARG56、argD、argE、argJ），N-乙酰-L瓜氨酸到瓜氨酸（argE），及尿素循環(huán)途徑中從鳥(niǎo)氨酸到精氨酸（argI/ argF、argG、argA、argH）的基因（圖4-A）。這些基因轉(zhuǎn)錄水平的大幅上調(diào)可能使F613-1積累更多的精氨酸，促進(jìn)CA合成。

表1 F613-1與ATCC27064中CA合成基因，CA合成調(diào)控基因，全霉素合成基因的表達(dá)差異比較

G3P既是CA合成途徑的起始物質(zhì)（圖4-B），同時(shí)也是糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑的重要中間產(chǎn)物。分析顯示，F(xiàn)613-1菌株中糖酵解途徑中果糖1，6-二磷酸酶（fbp）下調(diào)2.3倍，減弱了果糖1，6-二磷酸的糖異生反應(yīng)，有利于G3P合成；同時(shí)磷酸丙糖異構(gòu)酶（tpiA）和G3P脫氫酶（gapA）表達(dá)上調(diào)，差異倍數(shù)分別為2.2倍和2.3倍，有利于甘油代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為G3P；此外丙酮酸脫氫酶復(fù)合酶系均下調(diào)2-4倍，使得糖酵解產(chǎn)物丙酮酸去路受阻（圖4-C）；另一方面，檸檬酸循環(huán)途徑中檸檬酸合酶及亞基分別下調(diào)2.4倍和6.1倍，α-酮戊二酸脫氫酶E2組件（sucB）下調(diào)4.2倍，進(jìn)一步減少了丙酮酸的消耗，有利于G3P積累（圖4-D）。

圖4 F613-1中精氨酸生物合成途徑基因及G3P代謝途徑基因表達(dá)差異圖

2.6 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因的表達(dá)變化

S. clavuligerus中存在眾多ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因，分析顯示F613-1中有多達(dá)80個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因（ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體透性酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體底物結(jié)合蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體ATP結(jié)合蛋白及ATP酶等）表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，占總差異基因的10%，其中42個(gè)顯著上調(diào)，38個(gè)顯著下調(diào)。通過(guò)差異基因KEGG代謝通路分析，找到了12個(gè)功能明確的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)差異表達(dá)基因，其中包括負(fù)責(zé)氨基酸、糖、磷脂和金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（圖5）。

3 討論

圖5 F613-1與ATCC27064部分ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因表達(dá)變化情況及其功能示意圖

在S. clavuligerus工業(yè)菌株育種的早期，提高CA產(chǎn)量的方法主要以傳統(tǒng)的隨機(jī)誘變篩選為主，但隨著CA生物合成途徑的逐步闡明，越來(lái)越多的基因工程及反向代謝工程育種方法已經(jīng)應(yīng)用到S. clavuligerus菌株改造中。超表達(dá)CA合成通路基因及調(diào)控基因（如claR、ccaR、cas2等）是已被證明有效的提高CA產(chǎn)量的基因工程方法［16］。本研究的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示工業(yè)菌株F613-1中CA合成基因的表達(dá)量雖然整體上調(diào)，但是上調(diào)幅度并不是很大，特別是合成途徑幾個(gè)關(guān)鍵的基因如ceas1（上調(diào)2.14倍）、ceas2（上調(diào)2.49倍）和gcas（上調(diào)2.42倍）仍然存在進(jìn)一步提升的空間。其中ceas1/ceas2編碼CA合成途徑的起始酶，催化精氨酸和G3P合成羧乙酰精氨酸［N2-（2-carboxyethyl）arginine］［17］，gcas是CA合成途徑的關(guān)鍵基因，該基因編碼N-甘氨酰-克拉維胺酸合成酶（N-glycyl-clavaminic acid synthetase），是CA前體克拉維胺酸轉(zhuǎn)入CA合成分支途徑的關(guān)鍵基因［18］。另一種提高CA產(chǎn)量的策略是阻斷副產(chǎn)物的生物合成途徑。CA、頭霉素C和克拉維烷都屬于β-內(nèi)酰胺類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，三者合成途徑屬于競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。研究表明敲除頭霉素C合成關(guān)鍵基因lat，使CA產(chǎn)量顯著提高［19-20］。本研究中F613-1的頭霉素C基因簇明顯上調(diào)，且lat上調(diào)幅度接近3倍，不利于CA的合成，因此在基因工程改造中可以敲除F613-1菌株的lat基因?？死S烷是CA前體的直接競(jìng)爭(zhēng)者，研究顯示調(diào)控基因cvm7P正調(diào)控克拉維烷的合成基因，對(duì)CA合成基因無(wú)影響［21］，而F613-1中cvm7P轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著變化，因此敲除F613-1菌株的cvm7P基因可能有助于提高CA產(chǎn)量。此外，研究表明全霉素的合成受精氨酸和CA途徑后期中間產(chǎn)物的影響，說(shuō)明全霉素與CA也可能存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系［22］，因此本研究中F613-1全霉素合成基因的沉默有可能會(huì)促進(jìn)CA的合成。

CA的調(diào)控基因中除claR和ccaR變化比較明顯外，CA基因簇末端的一個(gè)編碼σ因子的基因（orf21）也上調(diào)了2.12倍（表1）。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，orf21可上調(diào)CA早期合成基因ceas2和cas2及調(diào)控基因ccaR的轉(zhuǎn)錄［23］。文獻(xiàn)報(bào)道雙組分調(diào)控系統(tǒng)orf22/orf23可以正調(diào)控claR進(jìn)而提高CA產(chǎn)量［24］，但是本研究顯示F613-1中orf22/orf23的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著變化（表1）。此外，CA合成途徑的正調(diào)控因子bldG［25］也在F613-1中無(wú)顯著變化（表1）。因此，orf21、orf22/orf23和bldG等調(diào)控基因也可以作為提高F613-1 CA產(chǎn)量的改造靶點(diǎn)。

Townsend等［26］用同位素標(biāo)記法研究了氨基酸對(duì)CA合成的影響，發(fā)現(xiàn)在CA合成過(guò)程中鳥(niǎo)氨酸和精氨酸比其它氨基酸更易被利用，且CA噁唑環(huán)結(jié)構(gòu)直接來(lái)源于尿素循環(huán)。鳥(niǎo)氨酸和精氨酸是尿素循環(huán)中兩種重要的氨基酸，研究發(fā)現(xiàn)鳥(niǎo)氨酸可抑制S. clavuligerus中頭霉素C的合成［27］。本研究發(fā)現(xiàn)F613-1中由谷氨酸鹽起經(jīng)鳥(niǎo)氨酸到精氨酸代謝途徑的基因整體表達(dá)上調(diào)，明顯有利于CA合成。由于谷氨酸成本更加經(jīng)濟(jì)，因此在F613-1發(fā)酵中可以采用谷氨酸替代鳥(niǎo)氨酸和精氨酸作為CA前體添加劑。

甘油是CA工業(yè)發(fā)酵常用的添加前體［28］，其衍生物G3P是CA合成的限速因素［29-30］。Medema等［31］通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析另一株CA高產(chǎn)菌株S. clavuligerus DS48802發(fā)現(xiàn)，與ATCC27064相比，DS48802中甘油攝取及轉(zhuǎn)化到G3P的基因明顯上調(diào)，同時(shí)三羧酸循環(huán)中順烏頭酸酶和檸檬酸合酶基因表達(dá)下降，這使得G3P積累并有利于流向CA合成途徑。本研究中F613-1的甘油耐受能力顯著高于ATCC27064，與G3P合成相關(guān)的基因上調(diào)而G3P分解基因下調(diào)進(jìn)而積累G3P，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，但是甘油轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝基因（包括甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因RS04225/RS03030，甘油激酶基因RS04230/RS03035，α-甘油磷酸脫氫酶基因RS04235/RS21895）的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯變化。此外，F(xiàn)613-1中丙酮酸氧化降解途徑受阻雖然有利于G3P積累，但另一方面也減弱了細(xì)胞能量供應(yīng)，影響F613-1的生長(zhǎng)速度。因此，通過(guò)提高F613-1中甘油轉(zhuǎn)運(yùn)和G3P合成基因的表達(dá)，將有可能改善F613-1生長(zhǎng)狀況并進(jìn)一步提高CA產(chǎn)量。

磷酸鹽、硫酸鹽、脂肪酸、Fe3+等也是發(fā)酵過(guò)程中影響CA產(chǎn)量的重要因素［32-33］，這些物質(zhì)都是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的底物，F(xiàn)613-1中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因的表達(dá)差異可能影響S. clavuligerus對(duì)這些物質(zhì)的吸收，進(jìn)而促進(jìn)CA的合成。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)S. clavuligerus中唯一的溶菌酶基因（RS20110）在F613-1中上調(diào)了5倍，我們推測(cè)過(guò)量表達(dá)的溶菌酶可能增加細(xì)胞壁通透性，有利于細(xì)胞攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)而促進(jìn)CA合成。因此，改造工業(yè)菌株的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和細(xì)胞膜通透性也可能是提高CA產(chǎn)量的靶點(diǎn)之一。

4 結(jié)論

CA是S. clavuligerus的次級(jí)代謝產(chǎn)物，工業(yè)菌株F613-1具有較高的CA合成能力，并且克拉維烷等副產(chǎn)物合成量較低。本研究表明F613-1中CA生物合成途徑的合成基因及調(diào)控基因的整體上調(diào)是其高產(chǎn)CA的主要原因；精氨酸生物合成通路基因的顯著上調(diào)以及G3P代謝途徑基因的表達(dá)變化也直接促進(jìn)了CA生成；全霉素合成基因的大幅下調(diào)可能使更多的前體物質(zhì)流向CA合成途徑。此外，大量ABC轉(zhuǎn)運(yùn)基因差異表達(dá)也可能對(duì)CA產(chǎn)生起到重要影響。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Characterization of Clavulanic Acid High-yield Streptomyces clavuligerus Industrial Strain by Transcriptome Analysis

QIN Rong-huo1，2FU Jia-fang2ZONG Gong-li2WANG Zhi-yu2CAO Guang-xiang1，2
（1. School of Medicine and Life Sciences，University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences，Ji’nan 250022；2. Shandong Medicinal Biotechnology Center，Ji’nan 250062）

This work aims to explore the molecular mechanism of clavulanic acid（CA）high-yield Streptomyces clavuligerus industrial strain. Transcriptome high-throughput sequencing was performed to compare the differential gene expressions between standard strain ATCC27064 and high-yield industrial strain F613-1，and comprehensive analysis was carried out combined with the phenotypic differences between them. The phenotypic results showed that F613-1 grew differently in growth rate，aerial mycelium morphology and spore formation in solid medium，compared with the standard strain. In the liquid culture，the growth rate of the two strains demonstrated no difference，but the sugar consumption of F613-1 significantly decreased，and the CA yield was 11.7 times higher than that of ATCC27064.Transcriptome analysis indicated that the expressions of both CA cluster genes and pathway-specific regulatory genes significantly increased；while the expressions of holomycin（CA by-product）cluster genes significantly decreased. On the other hand，the transcriptional levels of genes associated with arginine and glyceradldehyde-3P（raw materials for CA synthesis）metabolic pathways changed significantly，i.e.，up-regulated for arginine and down-regulated for glyceradldehyde-3P. Besides，the expressions of over80 genes involved in ABC transport system obviously changed，and 42 remarkably up-regulated and 38 down-regulated. The main reason of F613-1 highly produces clavulanic acid possibly lies in the increased transcription of CA cluster genes and relative regulatory genes，the silence of cluster genes involved in CA by-products，and the accumulation of arginine and alyceradldehyde-3P.

Streptomyces clavuligerus；industrial strain；transcriptome；clavulanic acid

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0275

2017-04-07

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2016CP04），山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生科技創(chuàng)新工程（201604）

覃榮活，男，碩士，研究方向：微生物與生化藥物；E-mail：qinronghuo@139.com

曹廣祥，男，副研究員，研究方向：微生物與生化藥物；E-mail：caozhong0402@163.com